基于三重实时荧光聚合酶链反应构建黄牛和牦牛源性成分同步检测方法

目的建立一种拥有内源质控的三重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,用以快速鉴定肉和乳中黄牛和牦牛的源性成分。方法首先对黄牛肉、牦牛肉、黄牛奶、牦牛奶等7种动物产品进行特异性检测,同时通过稀释梯度方法验证此方法的绝对检出限(limit of detection,LOD),最后通过黄牛和牦牛肉掺假模拟试验确定该方法的相对灵敏度。结果该方法的特异性强,能特异性地检测到来源于黄牛和牦牛肉和乳的DNA,稳定扩增的内源质控有效地避免了假阴性结果,本方法针对黄牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10‒3 ng,针对牦牛奶的绝对LOD为2.5×10^(-3)5.0×10^(‒2)ng,本方法对黄牛肉和牦牛肉混合肉的相对灵敏度可达0.1%牦牛肉。结论所建立的三重实时荧光PCR方法特异性强、灵敏度高,可实现黄牛和牦牛源性以及内源质控的同步检测,又能通过内源质控排除实验假阴性结果。

实时荧光聚合酶链反应检测新型冠状病毒室内质控方法初探

目的绘制实时荧光聚合酶链反应(RT-PCR)定性室内质控图和基于循环阈值的Levey-Jennings质控图,探究新型冠状病毒RT-PCR检测的室内质控方法。方法使用无菌生理盐水按照1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40对第三方质控物进行倍比稀释,确定室内弱阳性质控的稀释倍数。统计该实验室2022年1-2月新型冠状病毒RT-PCR阴阳性质控原始记录,以自定义数值绘制定性结果散点图。统计2022年1-2月每批次弱阳性质控的靶基因Ct值,分别对N基因和ORF1ab基因两组Ct值进行正态分布检验,根据前20次检测结果分别计算N基因和ORF1ab基因的靶值X和标准差s,绘制Levey-Jennings质控图。结果确定1∶30为每日室内质控的弱阳性质控品的稀释倍数。定性检测散点图可直观发现1次弱阳性质控检出阴性的“假阴性”反应。弱阳性质控N基因、ORF1ab基因Ct值均符合正态分布(P>0.05)。N基因Ct值靶值X为34.13,变异系数为1.91%,所有Ct值均在X±3 s以内,5次出现±2 s警告,符合Westgard质控规则。ORF1ab基因Ct值靶值为35.30,变异系数为2.58%,出现1次+3 s失控,5次±2 s警告,第31~41批次违反了10x规则,第73~80批次违反了R 4s规则。结论应用定性室内质控散点图和Levey-Jennings质控图建立的新型冠状病毒室内质控方法具有可行性,能够有效监测和预警检测过程中的质量问题,保证检测结果准确可靠。

实时荧光聚合酶链反应技术在献血者血液筛查中的应用

目的评估将实时荧光聚合酶链反应技术应用于血液常规筛查的必要性。方法使用实时荧光聚合酶链反应技术对酶免双试剂及转氨酶检测合格的无偿献血者血液标本进行核酸筛查，初筛阳性标本进行病毒项目确认。确认阳性标本进一步做病毒载量和血清标志物检测。结果19562人份酶免阴性标本中共检出12份HBVDNA阳性标本，病毒载量为（〈12～30．6）IU／mL。其中5份为乙肝隐匿性感染，3份为乙肝感染恢复期，2份为变异病毒感染，2份为疑似乙肝窗口期感染。结论将实时荧光聚合酶链反应技术应用于血液筛查有利于提高成都地区输血安全，特别是对检出ELISAHBsAS阴性的低浓度乙型肝炎感染者具有重要意义。

应用实时荧光聚合酶链反应技术与第二代杂交捕获法检测高危亚型人乳头瘤病毒

目的比较实时荧光聚合酶链反应(PCR)与第2代杂交捕获法(HC-Ⅱ)2种人乳头瘤病毒(HPV)检测方法。方法采用实时PCR与HC-Ⅱ分别检测223例宫颈脱落细胞标本中的高危亚型HPV,对结果不一致的标本进行测序分析。结果实时PCR和HC-Ⅱ2种方法检测高危亚型HPV的一致性较好,总符合率为77%,总一致性指数(Kappa指数)为0.538。其中,高度鳞状上皮细胞内病变(HSIL)组二者的符合率为82%,Kappa指数为0.410,一致性比其他组好。结论实时PCR与HC-Ⅱ检测结果一致性较好,尤其对于HSIL患者,可作为临床上HPV高危亚型检测的有效手段。

实时荧光聚合酶链反应检测HBV基因型B～D方法的建立

目的建立实时荧光聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型B^D方法并验证其准确性。方法比较GenBank中已发表的明确分型的143株HBV全序列,设计特异的组合引物探针,应用实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法对兰州地区128例慢性乙型肝炎患者血清标本进行基因型B、C、D检测,并随机对检测的基因型各3株标本进行S基因测序验证。结果128例标本中B型检出率为20.3%(26/128),C型71.9%(92/128),D型7.8%(10/128);18株HBV克隆标本S基因测序结果与本分型法完全一致。结论实时荧光聚合酶链反应HBV基因分型法能够简便、灵敏、快速、准确地鉴定HBV基因型,适宜用于HBV基因型的大规模临床和流行病学调查。

实时荧光聚合酶链反应检测肺部感染患者痰标本中军团菌

目的建立实时荧光定量聚合酶链反应(PCR),检测肺部感染患者痰液中军团菌属特异性16SrRNA基因。方法利用军团菌属特异性16SrRNA基因保守序列设计引物和探针,优化反应条件和反应体系,对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他病原菌标准菌株进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性;并对557例肺部感染患者痰液标本进行检测,同时采用PCR酶切法作比较,阳性者对基因扩增产物测序做验证试验。结果该方法检测军团菌属所有标准菌株均出现阳性信号,其他非军团菌属检测结果均为阴性,灵敏度为102 CFU/mL;577例肺部感染患者的痰液标本,实时荧光定量PCR军团菌检出阳性率为23.1%,PCR酶切法检出阳性率为19.9%,经16SrRNA基因测序验证军团菌阳性率为17.2%,3种方法检出阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。结论实时荧光定量PCR检测患者痰液标本中军团菌,具有快速、简便的特点,可作为临床军团菌感染患者的一种辅助诊断试验。

SYBR-GreenⅠ实时荧光聚合酶链反应结合融解曲线分析技术在α-珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断中的应用

目的探讨SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR(SYBR-PCR)结合融解曲线分析(D.C)技术进行α-珠蛋白生成障碍性贫血(α-地贫)基因诊断的价值。方法对22个家系中的37份样品采用4管SYBR-PCR结合D.C进行--SEA、-α3.7,-α4.2及非缺失型(αα)4个等位基因型的检测,进而作出基因诊断。同时运用单管多重PCR(mPCR)结合凝胶电泳技术进行基因检测加以对照确认。结果22个家系中6个家系检出有--SEA或-α3.7携带者,其中东南亚型缺失携带者(--SEA/αα)7例,右侧缺失携带者(-α3.7/αα)3例,东南亚型缺失与右侧缺失双重杂合子(--SEA/-α3.7)1例。2例为胎儿产前诊断。其中1例为Bart′s水肿胎儿(--SEA/--SEA),另1例为东南亚型缺失携带者(--SEA/αα)。用mPCR凝胶电泳技术得出的基因诊断结果与上述结果一致。结论SYBR-PCR结合D.C技术在α-地贫的基因诊断、携带者检出及产前诊断方面具有实用价值。

实时荧光聚合酶链反应检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体的临床分析

采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测性病患者泌尿生殖道沙眼衣原体,进行临床和实验室分析。采集380例男女性病患者泌尿生殖道分泌物,进行多形核白细胞数检测和荧光PCR。结果显示,216例男性患者中,尿道多形核白细胞数≥5个者占92.59%,荧光PCR检测沙眼衣原体阳性62例,阳性率为28.70%;沙眼衣原体合并淋病奈瑟菌感染30例,合并感染率为13.89%。164例女性患者中,87例宫颈管内多形核白细胞数≥10个(占53.05%),荧光PCR检测沙眼衣原体阳性33例(占20.12%)。结果提示,性病门诊开展实时荧光PCR检测沙眼衣原体可提高检测阳性率和控制沙眼衣原体传播。

实时荧光聚合酶链反应在检测冷冻禽、畜肉类中沙门菌中的应用

目的探讨实时荧光聚合酶链反应检测技术(RT-PCR)在冷冻禽、畜肉类沙门菌快速检测中的应用价值。方法选取2017年1月至2019年12月冷冻禽、畜肉类270份,采取RT-PCR法进行沙门菌检测及血清分型鉴定,并按照《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》(GB 4789.4—2016)(以下简称《标准》)的规定进行检验。比较两种检测方法检测阳性率、敏感度、特异度以及对RT-PCR鉴定结果及血清分型鉴定结果进行分析。结果RT-PCR对冷冻禽、畜肉类中沙门菌检测阳性率11.85%(32/270)高于《标准》(18/270)(χ^(2)=4.320,P=0.038);RT-PCR检测敏感度高于《标准》,差异有统计学意义(χ^(2)=16.170,P<0.001),RT-PCR检测特异度与《标准》比较,差异无统计学意义(P>0.05);对所检出沙门菌实施血清分型鉴定后得知,肯塔基血清型、海德堡血清型、鼠伤寒血清型、肠炎血清型占比最高,分别可达21.875%(7/32)、18.750%(6/32)、15.625%(4/32)、12.500%(4/32)。结论RT-PCR法在冷冻禽、畜肉类沙门菌快速检测中具有较高应用价值,可准确检测出沙门菌,并明确其具体分型。

实时荧光聚合酶链反应技术及应用于病原体检测的进展

聚合酶链反应飞速的发展使其成为分子生物学实验室的重要工具,实时荧光聚合酶链反应技术以其敏感性高、重复性好、定量准确、速度快和污染少使聚合酶链反应技术又向前迈进了一步。本文对实时荧光聚合酶链反应技术的方法学作一介绍,同时也讨论了此技术存在的不足,并对其目前在病原体检测中的主要应用进行综述。

宫颈人乳头瘤病毒第二代杂交捕获法和实时荧光聚合酶链反应检测法的临床应用比较

目的:比较第二代杂交捕获法(HCⅡ)与实时荧光聚合酶链反应技术(real-time PCR)在检测女性生殖道人乳头瘤病毒(HPV)高危亚型中的临床价值。方法:随机选取2011年1～6月我院妇产科行液基细胞薄层涂片技术进行低度鳞状上皮内病变(LSIL)检查,检查结果为未明确诊断意义的不典型鳞状上皮细胞(ASCUS)患者100例,分别采用real-time PCR与HCⅡ检测HPV高危亚型,比较两者的检测结果。对检测HPV阳性的样本或HPV阴性但液基细胞薄层涂片技术(LCT)≥LSIL的妇女采用阴道镜下活组织病理学检查,以病理结果作为验证两种HPV检测的参考标准。结果:共取病理68例。病理结果证实该人群中子宫颈上皮内瘤变(CIN)Ⅲ级5例,CINⅡ级11例,CINⅠ级19例,慢性宫颈炎和鳞状上皮化生33例。该100例患者HCⅡ和real-time PCR检测高危型HPV的阳性率分别为63.0%和71.0%,二者总符合率为82.3%;HCⅡ检测手段对高危宫颈病变患者进行高危HPV筛查的灵敏性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比和阴性似然比分别为79.3%、88.2%、91.2%、10.1%、99.7%、8.9和0.327;real-time PCR以上各指标分别为100.0%、92.5%、86.7%、8.6%、100.0%、8.7和0。结论:Real-time PCR与HCⅡ检测宫颈上皮内瘤变患者高危型HPV有较好的相关性;但real-time PCR检测高危型HPV具有更好的敏感性和特异性。

检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-timeRT-PCR)。方法基于HEVORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化。采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性。结果优化出1对引物和探针的组合。优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U。优化的反应条件为:50℃30min;95℃3min;95℃10s,50℃30s,72℃60s,5个循环;95℃10s,57℃40s,40个循环。初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102。结论所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。

实时荧光聚合酶链反应检测副溶血弧菌致病基因

目的建立一种快速、准确、特异、定量检测副溶血弧菌及其致病因子的方法。方法选择副溶血弧菌TLH、TDH和TRH基因作为靶序列,设计并合成引物和探针;收集疑似食物中毒导致腹泻患者粪便标本487份,并对其进行检测分析。结果采用荧光聚合酶链反应检测TLH和TDH基因的灵敏度为1.0×102拷贝,而检测TRH的灵敏度为1.0×103拷贝;487份粪便标本中检出副溶血弧菌TLH基因112例(23.0%),检出携带TDH基因菌株101例(90.2%),未检出TRH基因。结论应用Taqman探针实时荧光PCR技术能够快速、准确检测副溶血弧菌及其致病基因,适合于大样本筛查;临床分离的副溶血弧菌以携带TDH基因为主。

实时荧光聚合酶链反应熔解曲线检测人类白细胞抗原B27方法建立及评价

目的构建并评价实时荧光聚合酶链反应(PCR)熔解曲线法检测人类白细胞抗原-B27(HLA-B27)。方法通过采用本研究所构建的实时荧光PCR熔解曲线法和微量淋巴细胞毒法、实时荧光定量PCR法检测81例标本,并对3种方法进行评价。结果实时荧光PCR熔解曲线法与实时荧光定量PCR的敏感度和特异度均达到93.8%、90.9%,明显优于微量淋巴细胞毒法的敏感度56.2%和特异度81.8%。结论实时荧光PCR熔解曲线法具有很好的敏感度和特异度,具有较好的临床适应性。

实时荧光聚合酶链反应检测宫颈人乳头瘤病毒在宫颈癌筛查中的应用

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染已被证明是宫颈癌的直接病因,Woodman等研究发现其归因危险性达到90%以上。有研究证明,

实时荧光聚合酶链反应技术检测乙型肝炎病毒YMDD变异的研究

目的采用实时荧光聚合酶链反应(PCR)技术检测慢性乙型肝炎(CHB)患者在使用拉米夫定过程中,乙型肝炎病毒(HBV)YMDD变异的发生情况,并研究影响变异发生的相关因素,为临床预测和判断HBV YMDD变异提供一定的依据。方法选择50例CHB患者作为拉米夫定治疗组,30例CHB患者作为对照组。采用实时荧光PCR方法分别检测两组在用药期间HBV YMDD变异的发生情况,同时采用荧光定量PCR方法检测治疗组在用药前后HBV DNA水平。结果治疗组在用药52周时的变异率24.0%,明显高于对照组52周时的变异率3.3%(P<0.05);治疗组在用药52周时的变异率24.0%,明显高于用药26周时的变异率4.0%(P<0.05);治疗前HBV DNA水平较高组(28例)患者在用药52周时的变异率(35.7%)明显高于HBV DNA水平较低组(22例)患者的变异率(9.1%)(P<0.05);治疗组中未变异的38例患者在用药52周时的HBV DNA阴转率(65.8%)明显高于变异的12例患者的HBV DNA阴转率(16.7%)(P<0.05)。结论拉米夫定可导致HBV YMDD变异的产生,并且该变异的发生率随着拉米夫定的用药时间的延长而增加;HBV YMDD变异的发生同血清HBV DNA水平相关。

实时荧光聚合酶链反应检测粪便标本中的金黄色葡萄球菌肠毒素A、D

目的:建立一种快速、准确、特异、定量检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素A、D的方法并探讨肠毒素在食物中毒引起腹泻中的意义。方法:选择femB、SEA和SED基因分别作为金黄色葡萄球菌菌株、肠毒素A、肠毒素D的靶序列,设计合成引物和探针;收集食物中毒导致腹泻患者粪便标本487份,并对其进行检测分析。结果:采用荧光聚合酶链反应检测金黄色葡萄球菌和肠毒素A的灵敏度为1.0×102拷贝,而检测肠毒素D的灵敏度为1.0×103拷贝;487份粪便标本中检出金黄色葡萄球菌femB基因72例(14.8%),检出产肠毒素A菌株为11例(15.3%,11/72),产肠毒素D菌株为9例(12.5%,9/72),同时产肠毒素A、D菌株1例(1.4%,1/72)。结论:应用Taqm an探针实时荧光PCR技术能够快速、准确检测金黄色葡萄球菌及其肠毒素,适合于大样本筛查。

实时荧光聚合酶链反应检测视神经损伤后NgR mRNA表达的变化

目的:定量检测成年大鼠视神经损伤后NgRmR-NA表达的变化情况,探讨Nogo-A和NgR在视神经损伤后的表达变化间的关系。方法:采用荧光定量PCR(FluoresenceQuantivepolymerasechainreaction,FQ-PCR)法,定量分析视神经损伤后1,3,5,7,15d视神经NgRmRNA表达的变化。结果:大鼠视神经钳夹伤后其NgRmRNA表达无显著变化。结论:Nogo-A和其受体NgR表达变化的不一致,提示了Nogo-A除了抑制再生外,可能还有其它尚未阐明的功能。

实时荧光聚合酶链反应技术检测人乳头瘤病毒高危亚型的临床应用

目的:采用实时荧光聚合酶链反应技术(实时PCR)检测10种人乳头瘤病毒(HPV)高危亚型,比较不同病变程度标本的HPV高危亚型的检出率。方法:采用实时PCR法检测240例妇女宫颈脱落细胞标本中的10种HPV高危亚型,并对部分标本的检测结果应用测序法进行验证。结果:10种HPV高危亚型总的检出率为42.9%;高度鳞状上皮细胞内病变(HSIL)组的检出率均较低度鳞状上皮细胞内病变(LSIL)组要高,分别为81.7%与52.5%。15例HPV检测阳性的标本经测序验证均在10种亚型的范围内。结论:实时PCR法能同时检测10种HPV高危亚型,操作简便、结果准确,适合临床上用于HPV高危亚型的筛查检测。

实时荧光聚合酶链反应检测呼吸道感染鲍曼不动杆菌TEM-1基因

目的建立一种快速、准确、特异、定时检测鲍曼不动杆菌TEM-1型β-内酰胺酶耐药基因的方法。方法选择TEM-1型β-内酰胺酶耐药基因作为靶序列,设计合成引物和探针;收集呼吸道感染患者痰标本培养的鲍曼不动杆菌279株,并对其进行检测分析。结果采用荧光聚合酶链反应检测鳗曼不动杆菌TEM-1耐药基因灵敏度为102拷贝,279株鲍曼不动杆菌中检出47株携带TEM-1基因,检出率为16.8%。结论应用Taqman探针荧光聚合酶链反应能够快速、准确检测鲍曼不动杆菌TEM-1型β-内酰胺酶耐药基因。