基于实时荧光重组酶聚合酶扩增技术的铜绿假单胞菌快速检测方法的建立

目的 针对铜绿假单胞菌毒力基因exoS,建立一种实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)技术检测方法,并评价该方法的特异性、灵敏度及实用性。方法 根据铜绿假单胞菌毒力基因exoS的特异性保守区域,设计RPA特异性引物和探针,对提取的目标DNA进行检测,确定RPA方法的特异性和灵敏度;建立实时荧光定量PCR(qPCR)法,对目标DNA进行检测,比对不同检测方法对铜绿假单胞菌的检出限;通过临床样本性能验证试验,进一步确定RPA技术检测铜绿假单胞菌的可行性。结果 建立的RPA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有特异扩增曲线,对其他细菌无特异扩增曲线;RPA方法检测病原菌的灵敏度为5×10^(2) cfu/mL,该方法与qPCR法检出限一致且结果可靠;RPA方法检测时间仅需30 min,明显短于传统方法的检测时间。结论 该研究建立的铜绿假单胞菌RPA检测方法特异性强、灵敏度高,相对于传统检测方法明显缩短检测时间,可用于临床标本中铜绿假单胞菌的快速检测。

塞尼卡谷病毒重组酶聚合酶扩增技术(RPA)实时荧光检测方法的建立

塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus,SVV)可感染猪,引起类似口蹄疫病毒感染造成的水疱性病变,新生仔猪病死率达30%~70%。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对SVV 3D基因设计了引物和探针,并进行筛选、反应条件优化以及敏感性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,本方法在40℃、10 min内检测的最低浓度为28拷贝/μL;与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒无交叉反应;通过3次重复试验检测2.8×10~6~2.8×10~1拷贝/μL的6个稀释度样品,在荧光强度达1500 mV所需时间变异系数范围在2.44%~14.95%。该等温、快速扩增方法为猪群出现水疱性疾病的鉴别诊断提供了技术支持,对及时采取适当防控措施具有重要意义。

非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFVB646L(p72)基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。

利用双重实时荧光重组酶辅助扩增技术快速检测肉制品中鼠源性成分

为实现肉制品中大鼠和小鼠源性成分的同步检测,基于实时荧光重组酶辅助扩增(real-time recombinase-aided amplification,Rt-RAA)技术,以大鼠COX3基因和小鼠16S rRNA基因序列保守区域为靶标,分别设计相应的Rt-RAA引物和探针,通过反应参数的优化确定最佳双重Rt-RAA检测反应条件。进一步对建立的双重Rt-RAA检测方法进行特异性、灵敏度及稳定性评估,并应用该方法对模拟市售肉制品进行检测。结果表明,所建立的双重RtRAA检测方法特异性强、稳定性好,大鼠和小鼠源性成分的检出限分别为0.5%和0.2%,同步检测2种源性成分检出限为0.5%,同步检测混合模拟市售样品检出限仍低至0.5%,双重Rt-RAA与实时荧光定量聚合酶链式反应对市售样品和模拟样品检测结果高度一致。因此,本研究建立的双重Rt-RAA检测方法适用于大鼠和小鼠源性成分的检测,为肉制品掺假检测提供了一种快捷、高效及准确的新方法。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测发热伴血小板减少综合征病毒方法的建立

目的建立一种可用于检测发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)的逆转录-酶促重组等温扩增(reverse transcription enzymatic recombinase amplification,RT-ERA)方法。方法以SFTSV非结构蛋白NSs基因的保守序列为靶标,根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物,以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品,将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合。利用筛选的探针引物组合,对不同拷贝数的阳性对照品进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的最低检出限;接着以新型布尼亚病毒、新型冠状病毒、森林脑炎病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒、寨卡病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的特异性;最后用26例临床样本,检测与RT-qPCR的一致性。结果在42℃恒温条件下,对于SFTSV RNA,40 min内最低检出限可达100 copies/μl。当SFTSV核酸扩增为阳性时,其他病毒检测结果为阴性;对26例怀疑为发热伴血小板减少综合征患者样本的检测显示,RT-ERA检测的敏感性和特异性分别约为88.9%和100.0%;kappa值为92.3%。结论建立了一种酶促重组等温扩增实时荧光技术的SFTSV核酸检测方法,具有简单快速、敏感特异等优点。该方法在SFTS病原监测上有一定的应用前景。

实时荧光重组酶聚合酶扩增检测大肠埃希氏菌O157

目的建立实时荧光重组酶聚合酶扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-time RPA)检测大肠埃希氏菌O157的分析方法。方法根据大肠埃希氏菌O157的rfbE基因(S83460.1),设计特异性引物和exo探针,分别进行引物探针筛选和特异性、灵敏度以及稳定性探究,并对人工污染样品和实际样品进行检测,验证本研究方法的实用性。结果本方法在37℃恒温20 min内可完成对大肠埃希氏菌O157的定性检测,目的DNA的检测限为0.01ng/μL,目的菌的检测限为10~3CFU/mL。在稳定性实验中,选择从100~0.001 ng/μL的10倍梯度稀释的目的DNA进行每个浓度8个平行的测试,0.01 ng/μL及以上浓度的DNA的8个平行均可稳定检出。对于大肠埃希氏菌O157的初始污染量为4 CFU/25 g的牛奶和鸡肉人工污染样品,增菌9 h后,可检出其中的目的菌。用本方法和国标方法GB 4789.36-2016同时检测20份实际样品,结果一致。结论该方法快速、简便,可作为一种常温下大肠埃希氏菌O157的快速检测手段,应用于基层实验室或现场检测。

鱼类产品中嗜水气单胞菌重组酶聚合酶扩增结合CRISPR/Cas12a快速检测及耐药性分析

目的建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合簇状规则间隔短链重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein,CRISPR-Cas)新方法,检测鱼类产品中嗜水气单胞菌,并分析其耐药性。方法采用基于最新的CRISPR基因编辑技术建立RPA结合CRISPR/Cas12a新方法,快速检测嗜水气单胞菌,同时采用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法比对两种方法的检出率。筛查嗜水气单胞菌分离株的耐药性,采用纸片扩散法测定耐药表型,采用荧光染料(SYBR green,SYBG)实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定耐药基因,分析耐药表型与耐药基因结果的一致性。结果在74例鱼类样品中,基于RPA-CRISPR/Cas12a和LAMP同时检测出6例嗜水气单胞菌。分析耐药性测试结果发现,分离株对5大类10种抗生素的耐药情况差异较大,耐药表型与耐药基因结果一致性较高。结论所建立的RPA-CRISPR/Cas12a方法适用于嗜水气单胞菌快速检测。而细菌耐药性的产生机制比较复杂,耐药表型的产生在一定程度上受耐药基因调控。研究结果为水产品中嗜水气单胞菌快速检测和耐药性筛查提供新思路和方法。

实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

柑桔黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)检测

为了建立黄龙病菌的重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)快速检测体系,丰富柑桔黄龙病的高效简便检测方法,以黄龙病菌株psy62全基因组中的单拷贝tufB-secE-nusG-rplKAJL-rpoB基因簇序列和5拷贝核糖核苷酸还原酶β亚基基因(nrdB)序列设计并筛选特异性引物,经灵敏度比较和检测特异性验证,建立该病的RPA检测体系,并经PCR、RPA和实时荧光PCR对87份柑桔样品的黄龙病菌进行对比检测,验证RPA检测体系的适用性。结果表明,建立的黄龙病菌RPA检测方法能特异性检测柑桔黄龙病;灵敏度与实时荧光PCR相当,是PCR的100倍;扩增过程只需20 min,大幅提高检测效率;对田间疑似柑桔黄龙病的送检样品检测结果与实时荧光PCR一致,比PCR的检出率高。

重组酶聚合酶扩增技术及其在寄生虫检测中的应用

重组酶聚合酶扩增技术（RPA）是以T4噬菌体体内核酸复制机制为原理，以多种蛋白及酶参与的一种新型核酸等温扩增技术，可在37--42qC条件下，20min内将核酸扩增至可检测水平。具有较高的敏感性和特异性，且操作简单，可在非实验室条件下实现对核酸的快速检测。自2006年问世后，已广泛应用于农业、食品安全、医学和转基因检测等多个领域。本文综述了RPA技术的研究进展及其在寄生虫检测中的应用。

酶促重组等温扩增实时荧光法快速检测肺炎支原体方法的建立及应用

利用酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)技术建立快速检测肺炎支原体的实时荧光检测方法。针对肺炎支原体P1基因设计特异性引物和探针,优化反应条件,分析其敏感性和特异性,并对临床样本进行验证。ERA实时荧光法在25-40℃均具有扩增能力,在35℃条件下对肺炎支原体的扩增效果最好,20 min内可完成扩增;该法对肺炎支原体的检出限为10^(3) copies/μL;并对其他6种呼吸道病原体进行检测,均无扩增曲线产生,有较好的特异性;以荧光定量PCR法检测结果为标准,ERA实时荧光法对34份临床样本的检测结果的诊断敏感度为96.15%、特异度为100%、阳性预测值为100%、阴性预测值为88.89%。本研究构建的ERA实时荧光法可以快速简单、灵敏和特异地检测出肺炎支原体,满足现场检测的需求。

重组酶聚合酶扩增技术检测新型隐球菌DNA

目的探讨应用重组酶聚合酶(RPA)技术对新型隐球菌快速核酸检测,建立新型隐球菌的即时检测(POCT)方法。方法磁珠法提取新型隐球菌标准菌株ATCC32609、150株阴性质控菌株(本实验室质控菌株和临床分离菌株)DNA。在新型隐球菌DNA的5.8SrRNA编码基因区域设计6对候选引物,以ATCC32609作为建立RPA反应体系的参考菌株,凝胶法RPA基础试剂盒筛选可稳定扩增出新型隐球菌DNA片段的引物。依次稀释ATCC32609的McF2.0菌悬液,半定量法观察扩增反应阳性引物+ATCC32609的扩增反应,扩增反应阳性引物+150株阴性对照菌株验证该反应特异性。对扩增反应阳性引物设计探针,实时荧光RPA法观察ATCC32609的扩增反应,150株阴性对照菌株验证该反应特异性。取实验室保存10株新型隐球菌临床分离株和100份临床样本(包括脑脊液50份、痰15份、胸腹水15份、静脉血20份),分别用荧光法RPA和oasig实时荧光PCR法进行DNA扩增,观察是否存在扩增反应。结果引物2、5、6的目的条带清晰,无弥散拖尾现象,引物扩增反应阳性;对ATCC32609菌悬液1∶105稀释加入引物后扩增反应阳性;引物2、5、6均属于新型隐球菌编码核糖体RNA的DNA片段,比对结果符合率为100%;引物6扩增阴性对照菌株后,凝胶电泳未见扩增条带。引物6设计探针实时荧光反应结束时可见S形阳性扩增曲线;所有阴性对照菌株扩增结果阴性;对ATCC32609菌悬液1∶105稀释后加入引物6和探针仍可见阳性扩增曲线;以引物6和相应探针对10株新型隐球菌菌株扩增后均可见S形阳性扩增曲线。荧光法RPA试剂、oasig实时荧光PCR法检测100份临床样本中扩增反应阳性的分别为40、40份。结论RPA技术检测新型隐球菌DNA,实时荧光法RPA技术检测新型隐球菌DNA方便快捷、准确性高。

建立仙台病毒实时荧光重组酶等温扩增检测方法

目的国标标准规定清洁级和SPF级小鼠必须排除仙台病毒(Sendai virus,SeV)。为了提升效率,简化操作步骤,本研究建立了一种新型分子检测方法——实时荧光重组酶等温扩增技术(real-time RPA)用于检测SeV。方法针对SeV融合蛋白编码基因的保守序列,设计特异性扩增引物及探针并建立检测方法,并评价该检测方法的特异性、敏感性、稳定性和可靠性。最后将该检测方法和团标PCR方法进行优势比较。结果该方法具有很好的特异性,与小鼠肝炎病毒等六种病原微生物无交叉反应。其敏感性、稳定性和可靠性均可,并能够在25 min内完成,远远快于PCR方法。结论本研究建立的SeV实时荧光RPA是一种操作简单,高效直观且特异性好的检测方法。

实时荧光核酸恒温扩增技术和实时荧光定量聚合酶链反应检测解脲脲原体的效果比较

目的比较实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)在解脲脲原体(UU)检测中的效果,以选择更为准确和快速的临床检验方法。方法选择2018年1月—2020年1月在福建中医药大学附属福鼎医院就诊的89例临床疑似UU感染患者作为研究对象,同时使用SAT和qRT-PCR检测所有患者尿液和分泌物样本。比较两种方法的阳性检出率、敏感度、特异度、准确度。结果SAT的阳性检出率明显高于qRT-PCR〔69.7%(62/89)比51.7%(46/89),P<0.05〕;SAT和qRT-PCR检测的敏感度分别为100.0%、78.0%,特异度分别为90.0%、100.0%,准确度分别为96.6%、85.4%,阳性预测值分别为95.2%,100.0%;阴性预测值分别为100.0%、69.8%。结论SAT对疑似UU感染的标本检测阳性率较高,有助于快速、准确筛查,值得临床推广。

猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增快速诊断方法的建立和应用

旨在建立一种针对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法。以猪流行性腹泻病毒cDNA为模板,在重组酶和聚合酶的共同作用下实现对目的基因的扩增,本研究设计了用于重组酶聚合酶扩增的引物,优化了重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应体系,检测了反应的特异性和敏感性,确定了反应的最佳温度和时间,通过结合琼脂糖凝胶电泳和侧流层析试纸条的方法进行分析和鉴定。试验结果显示反应的最佳温度和时间为30℃、20 min,反应可以检测到的最低质粒拷贝数为102 copies·μL^(-1),且在对猪的丁型冠状病毒、传染性胃肠炎病毒、轮状病毒和圆环病毒2型的检测中具有良好的特异性。综上所述,通过对RPA反应条件的摸索与优化,成功建立了猪流行性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增结合琼脂糖凝胶电泳(Basic RPA)和侧流层析试纸条(LF-RPA)的检测方法,两种方法相比较于RT-PCR,有更短的检测时间且具有更高的敏感性,对仪器、场地和检测环境的要求更低,为今后PEDV的临床诊断及快速检测提供了更多的选择和更有效的技术支持。

重组酶聚合酶扩增核酸试纸条快速检测诺如病毒方法的建立与应用

旨在建立快速检测GⅠ型诺如病毒的方法与快速检测GⅡ型诺如病毒的方法。分别以GⅠ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅠ-F、Nov-GⅠ-R与探针Nov-GⅠ-probe、以GⅡ型NoV特异性保守序列作为靶序列设计并合成RPA引物Nov-GⅡ-F、Nov-GⅡ-R与探针Nov-GⅡ-probe,利用RPA检测试剂盒建立RPA扩增体系,并通过核酸检测试纸条对扩增产物进行分析鉴定。通过检测不同拷贝数的重组GⅠ型NoV阳性质粒对GⅠ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,通过检测不同拷贝数的重组GⅡ型NoV阳性质粒对GⅡ型NoV快速检测方法的灵敏度进行评价,并与普通PCR方法和实时荧光PCR方法进行比较;以星状病毒、MS2噬菌体基因组、人轮状病毒和人腺病毒重组质粒作为模板对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法的特异性进行评价;应用建立的两种方法对市场上采集的20份食品样品进行GⅠ型NoV检测与GⅡ型NoV检测。GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法检测到最低质粒拷贝数均为101 copies/μL,且两种检测方法对其余病毒均具有良好特异性;对于从市场采集的潜在携带NoV的食品样品进行检测,结果均为阴性。本研究建立的针对GⅠ型NoV快速检测方法与GⅡ型NoV快速检测方法相较于普通PCR与实时荧光PCR具有检测时间短、特异性强、灵敏度高以及检测操作简单快捷的优点,更适用于市场流通领域食品及医学检测等现场快速检测的应用。

基于重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条快速检测鲤疱疹病毒2型的方法研究

为建立CyHV-2的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析(RPA-LFD)快速检测鲤疱疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)的方法,针对鲤疱疹病毒2型的DNA聚合酶基因设计引物和探针,优化反应温度和时间条件,建立了鲤疱疹病毒2型的RPA-LFD检测方法,并将样品简易处理方法运用于该方法对实验室保存的鲫组织样品进行检测。结果显示,该RPA-LFD检测方法最佳反应条件为40℃20 min,最低检出限为6×10^(0) copies/μL,与荧光PCR的灵敏度相当,与其他鲤疱疹病毒等无交叉反应;运用该方法并结合待检样品简易处理方法(直接RPA法)对50份鲫组织样品进行处理和检测,其结果与运用国家标准(GB/T 36194-2018)中荧光PCR方法检测结果一致。本文建立的RPA-LFD检测方法具有操作简单、反应迅速、灵敏度高、特异性强的优点,适于在水产养殖场和基层部门用于鲤疱疹病毒病的辅助诊断和监测。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针,合成基因片段绘制标准曲线,在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后,对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%;基因组DNA检测敏感性为7.11×10^(2)fg/μL;纯培养物水平检测敏感性为1.0×10^(2)CFU/mL;重复性变异系数在0.10%~1.00%之间;标准曲线相关系数r^(2)为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法,该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短,仅为35 min的特点,可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。