SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

实时荧光定量聚合酶链式反应快速检测4种食源性致病弧菌

目的建立和优化4种食源性致病弧菌的实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)快速检测方法。方法基于副溶血性弧菌的toxR基因(GenBank ID:MH047287.1)、霍乱弧菌的ompW基因(GenBank ID:MF100046.1)、拟态弧菌的toxR基因(GenBank ID:EF693743)和创伤弧菌的vvhA基因(GenBank ID:KC821520.1)设计常规PCR引物和qPCR特异性引物和探针。分别建立副溶血性弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌和创伤弧菌4种食源性致病弧菌的单重qPCR检测体系,根据扩增曲线和Ct值对探针浓度进行优化,设置探针浓度梯度。结果4种弧菌的探针最适浓度均为0.1µmol/L。对设计的4种弧菌的引物分别进行常规PCR的扩增,其最低检出限均为1×10^(5) copies/µL,4种弧菌分别进行单重qPCR的最低检出限均为1×10^(1) copies/µL,扩增效率均接近100%。qPCR的灵敏度均高于常规PCR。特异性实验结果表明,4种目的弧菌DNA扩增出特异性曲线,其他的非目的基因未被扩增出扩增曲线。结论该方法准确度和灵敏度高,前处理简单快速,适用于4种食源性致病弧菌的荧光定量PCR快速检测。

多重实时荧光定量聚合酶链式反应在芝麻酱掺假鉴别中的应用

目的研究基于分子生物学技术,建立多重实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测芝麻酱中的植物源性成分,实现芝麻酱的快速掺假鉴别,突破单标准单物种检测的局限性。方法该研究以芝麻2S albumim mRNA基因、花生Ara b2基因、大豆Lectin基因、玉米adh1基因设计特异性引物和探针,优化反应体系,建立多重实时荧光定量PCR技术检测芝麻酱中的芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分,并应用于市售的芝麻酱样本检测分析。结果该方法高效低成本,特异性好,对小米、绿豆等10种非目标源性成分无特异性扩增;对芝麻源性成分、花生源性成分、大豆源性成分、玉米源性成分的最低检出限为100 pg/μL,具有较高的灵敏度;应用建立的方法,对市售21份芝麻酱样本进行检测分析,检测结果与标签标注不符合的有4份,标签标注符合率为80.95%,与参比方法检测结果一致。结论建立的多重实时荧光定量PCR技术对加工成品的检测具有较好的适用性,为芝麻酱的掺假鉴别提供了一种新的分子生物学方法。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

Taq Man探针实时荧光定量聚合酶链式反应检测低温酸乳中常见的霉菌和酵母

为提高低温酸乳中霉菌和酵母菌检测效率,根据保守基因延伸因子1α(elongation factor 1α,EF-1α)序列分别针对霉菌与酵母菌设计引物与探针,利用实时荧光定量聚合酶链式反应,基于TaqMan探针分别建立霉菌和酵母菌检测方法。以低温酸乳中常见真菌与乳酸菌基因组DNA为扩增模板进行特异性检验,并对方法灵敏度与重复性进行检验,同时构建标准曲线。结果表明:根据EF-1α基因设计的引物与探针特异性良好;所构建的标准曲线相关系数均大于0.99;该方法检测酵母菌的灵敏度为101 CFU/mL,检测霉菌的灵敏度为102 CFU/mL;重复性检验中组内与组间的变异系数均小于2%,表明方法具有良好的可靠性与稳定性,适用于低温酸乳中霉菌与酵母菌的快速检测。

基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应法的A1/A2牛奶鉴别试剂盒的开发及应用

目的基于扩增阻滞突变系统-聚合酶链式反应(amplification refractory mutation system polymerase chain reaction,ARMS-PCR)技术,开发A1A2牛奶鉴别试剂盒,并对市场上A2牛奶产品进行检测应用,实现对A2牛奶的鉴别检测。方法本研究先利用D-loop基因片段设计了牛内参基因引物探针组(标记FAM荧光)。随后,在β-酪蛋白基因突变位点分别设计了A1基因引物探针组和A2基因引物探针组(均标记VIC荧光)。基于ARMS-PCR技术构建了双通道ARMS-PCR反应体系与程序,进而成功开发了A1A2牛奶实时荧光ARMS-PCR试剂盒。为进一步验证试剂盒性能,将其应用于市场上A2牛奶的检测,并将检测结果与DNA测序法结果对比。结果本试剂盒特异性强,检测DNA灵敏度为0.1 ng/L;10份市售实际样品的应用检测结果与测序结果一致。结论本试剂盒特异性好,灵敏度高、准度度高,适用于A2牛奶的真实性鉴别。

TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌

目的建立TaqMan探针双重荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法。方法通过比对沙门氏菌和志贺氏菌的基因组序列,选择同源性高、保守性好的区域设计特异性引物和探针,经过引探筛选、浓度调试等一系列优化,建立了食源性沙门氏菌和志贺氏菌双重荧光PCR核酸检测方法,并对其特异性、质粒最低检出限、菌液敏感性、重复性、稳定性以及实际样品进行了验证。结果该方法与大部分食源性致病菌无交叉反应,特异性强;沙门氏菌和志贺氏菌质粒的最低检出限可达5 copies/μL,沙门氏菌菌液敏感性为1.0×10^(2) cfu/mL,志贺氏菌菌液敏感性10 cfu/mL;质粒和菌液核酸梯度的批内和批间变异系数均在0.177%~1.958%之间,小于5.0%,具有较强的稳定性;标准曲线相关系数(r^(2))均大于0.999。结论本研究成功建立了一种TaqMan探针双重荧光PCR技术同时检测食源性沙门氏菌和志贺氏菌的方法,该方法扩增时间短,只需要30 min即可,而且特异性强、稳定性好,可用于疑似沙门氏菌和志贺氏菌污染样品的检测,为食品安全的快速检测提供技术支撑。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

火鸡源性成分实时聚合酶链式反应检测方法ISO标准研制

选择火鸡染色体Z DNA序列的特异片段作为检测靶序列,建立了实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,该方法种间特异性和种内一致性良好。将靶序列克隆到pUC57质粒中,通过对不同稀释浓度的质粒样品进行real-time PCR测试,该方法绝对检测限为5拷贝/PCR反应。组织国际协同实验对方法进行验证,方法的假阳性率、假阴性率均为0%,绝对检测限为5拷贝/PCR反应。根据对各实验室不同稀释浓度的质粒样品的定性测试结果对方法进行分析,结果表明,实验室间标准偏差为0.30,低于最大允许值1;在检出概率为95%的情况下,方法的绝对检测限为3.2拷贝/PCR反应,低于最大允许值20拷贝/PCR反应。将该方法提交国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO),经过标准不同的制订阶段投票、征求意见,正式上升为ISO标准(ISO/TS20224-8:2022)。

定量荧光聚合酶链式反应在流产组织染色体畸变分析中的诊断价值

目的评估在以拷贝数变异测序(CNV-seq)为主要遗传学检测手段对流产组织进行染色体畸变分析中辅以定量荧光聚合酶链式反应(QF-PCR)检测的诊断价值。方法采用QF-PCR及CNV-seq技术同时检测2021年9月至2022年11月海口市妇幼保健院收集的110例流产组织样本。此外,QF-PCR技术将额外检测50例健康人群外周血样本进行数据补充。QF-PCR体系为自建体系,在13、18、21、性染色体共选择17个位点并将其分为两组。Panel A组由D13S796、D13S256、D18S386、D18S535、D21S11、D21S1446、DXS6809、HPRT构成;Panel B组由D13S371、D13S634、D18S51、D18S535、D18S819、D21S1409、D21S1412、DYS218、DXS981、AMEL构成。分析QF-PCR在判别13、18、21、性染色体非整倍体时与CNV-seq结论一致性、QF-PCR为CNV-seq进行母源污染鉴定能力,以及QF-PCR进行13、18、21、性染色体非整倍体的分型能力。结果对110例流产组织进行检测,两种方法结论一致例数占比为93.6%。其中QF-PCR避免了5例CNV-seq自身局限性造成的不准确结论,2例为QF-PCR的检测失败。在母源细胞污染鉴定能力上,15个短串联重复序列的观察杂合度、期望杂合度与个体识别能力值范围分别为0.737~0.950、0.593~0.941、0.817~0.975;D13、D18、D21与DX的累积He依次为0.9999、0.9998、0.9998与0.9985,累积个体识别能力大于0.999999999999999999999999999999;自建的QF-PCR方法在分型能力上表现良好,其干扰因素影响较小。结论QF-PCR联合CNV-seq检测可能成为未来孕早期流产组织遗传学分析的主要方法。它不仅能够降低CNV-seq的误诊率、鉴别母体细胞污染。采用自建QF-PCR体系还能够显著降低联合检测成本。

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针,合成基因片段绘制标准曲线,在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后,对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%;基因组DNA检测敏感性为7.11×10^(2)fg/μL;纯培养物水平检测敏感性为1.0×10^(2)CFU/mL;重复性变异系数在0.10%~1.00%之间;标准曲线相关系数r^(2)为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法,该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短,仅为35 min的特点,可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌

目的 建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测方法。方法 针对选择铜绿假单胞菌gyrB基因设计特异性引物和探针。250mL水样经膜过滤后经过短时培养(36℃、4 h),优化提取菌体DNA流程,预冻干聚合酶链式反应预混液,采用实时荧光聚合酶链式反应进行检测。结果 样品中铜绿假单胞菌量为≥1 CFU/250 mL时,检测结果均呈阳性,整个检测用时6 h左右。该方法检测结果与国家标准方法(GB8538—2022)检测结果一致。结论 该方法特异性强、灵敏度高、用时短,可为预包装饮用水中铜绿假单胞菌监管和生产企业质控提供更为快速、精准的技术手段。

利用可视基因膜芯片技术与实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析肉制品中动物源性成分

为调查了解肉制品中动物源性成分,以帮助判别掺假情况,应用可视基因膜芯片检测技术对市售的肉松、香肠、肉卷、预制调理肉、肉干及肉脯等23份样品动物源性成分进行筛查分析,同时,针对筛查结果采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法进一步确证。结果表明:可视基因膜芯片检测法与实时荧光定量PCR法检测结果一致,提高了未知样品的筛查效率;在本次随机分析的样品中,动物源性成分检测结果与标签标示不一致的情况占比高达21.7%,肉制品掺假虚标情况不容忽视。

实时荧光聚合酶链式反应检测转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系

目的:建立实时荧光聚合酶链式反应检测转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系的鉴定方法。方法:以转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2为研究对象,在转基因小麦外源片段与小麦染色体重组的边界序列分别设计引物和探针,以其他多种转基因产品和非转基因小麦为对照进行特异性实验,以B73-6-1样品模拟制备10个含量梯度的添加样品进行灵敏度实验。结果:本研究设计的引物和探针具有很好的品系鉴定特异性,检测灵敏度可达到0.01%(m/m)。结论:该方法特异性好、灵敏度高,可快速、准确地鉴定转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系。

纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应快速检测海产品中副溶血性弧菌

采用副溶血性弧菌单克隆抗体、纳米免疫磁分离技术,结合实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,建立海产品中副溶血性弧菌纳米免疫磁分离-实时荧光PCR检测方法。副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为103 CFU/mL水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌情况下,该方法检测灵敏度达到140 CFU/mL;通过134株副溶血性弧菌和74株非目标菌的测试,实时荧光PCR技术具有良好的特异性;在食品基质添加实验中,其检测限为2 CFU/25 g样品,增菌时间缩短到8 h。

基于榛子过敏原2S albumin基因的实时荧光聚合酶链式反应检测方法开发

目的开发一种基于2Salbumin基因的实时荧光聚合酶链式反应检测方法(real-timefluorescent polymerase chain reaction,qPCR)用于检测食品中的榛子成分。方法从美国国家生物技术信息中心数据库中检索并选取具有高特异性的榛子2S albumin基因序列的DNA片段进行引物探针设计,建立一种新的用于检测微量榛子成分的实时荧光PCR方法,并对建立的方法的特异性、扩增效率、检出限和稳健性进行验证。结果本方法对检测目标呈现出高特异性,与其余12种非目标样品无交叉反应。扩增效率为99.42%,相关系数r2为0.9941,两者均符合实时荧光PCR方法验证指南要求。该方法检出限(limit of detection,LOD)为每个反应5拷贝(2.5copies/μL),可检测出食品中含有的微量榛子成分。使用正交实验设计评估该方法具有很好的稳健性(P=0.07),可转移到其他实验室及常规分析中使用。结论基于2S albumin基因组分的qPCR检测方法可用于识别食品中潜在的榛子成分,对于预防榛子过敏及开发减敏脱敏榛子食品研究具有很好的技术支撑。

基于Cycling探针的实时荧光聚合酶链式反应检测河鲀鱼中掺杂的横纹东方鲀成分

目的开发基于Cycling探针实时荧光聚合酶链式反应(real-time fluorescent polymerase chain reaction,RT-PCR)用于检测河鲀鱼中横纹东方鲀(Takifugu oblongus,T.oblongus)成分。方法基于细胞色素C氧化酶亚型I(cytochrome C oxidase subunit I,COI)基因为靶标设计RT-PCR引物及Cycling探针,开发横纹东方鲀成分检测方法,评价方法的特异性、扩增效率、灵敏度和稳定性。结果横纹东方鲀成分与密切相关的其他8种河鲀鱼、4种其他鱼类物种DNA无交叉反应,具有很好的特异性;方法扩增效率为93.47%;方法重复18次均给出阳性报告的最小稀释点(limitofdetection6,LOD6)为14.64pg/μL(相对应的质量含量为0.1%),95%置信水平条件下检出限为34.41 pg/μL(11.59~119.05 pg/μL,LOD_(95%)),稳定性分析(P=0.152)表明该方法可转移到其他实验室以及在常规分析中使用。结论本研究开发的Cycling探针RT-PCR方法可对河鲀鱼食品中掺杂0.1%的横纹东方鲀成分进行可靠追溯。

实时荧光聚合酶链式反应检验用于乙型肝炎病毒DNA检测的价值分析

目的:探讨实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检验用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测中的价值。方法:选取2020年1月—2023年1月清镇市第一人民医院收治的乙型肝炎患者112例为研究对象,均经标准abbot药盒检测确诊,包括HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAg(+)(临床习惯称为“大三阳”)62例、HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAb(+)(临床习惯称为“小三阳”)50例。患者均接受酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验HBV-DNA。将标准abbot药盒检测结果作为金标准,评价酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验的诊断效能。结果:临床最终诊断结果显示“大三阳”62例(阳性)、“小三阳”50例(阴性),酶联免疫吸附法检出阳性50例、阴性62例,实时荧光PCR检验检出阳性58例、阴性54例;实时荧光PCR检验诊断准确度、特异度、灵敏度高于酶联免疫吸附法检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:与酶联免疫吸附法检验比较,HBV-DNA检测中采取实时荧光PCR检验,可提高对“大三阳”与“小三阳”的诊断效能。

五重实时荧光聚合酶链式法快速筛查食用淀粉及其制品中植物源性成分

目的 建立五重实时荧光聚合酶链式方法 快速筛查食用淀粉及其制品中植物源性成分。方法 首先设计豌豆、绿豆、木薯、玉米的特异性引物、探针,建立多重实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法 ,再验证方法 的特异性和绝对灵敏度,最后通过样品掺假模拟实验验证方法 的检出限。结果 该方法 的特异性强,仅能检出豌豆源性、绿豆源性、木薯源性、玉米源性成分;灵敏度较高,对绿豆源性和木薯源性的检测灵敏度可达到1×10^(–1) ng/μL水平,豌豆源性和玉米源性的检测灵敏度可达到1×10^(–2) ng/μL水平。结论 本研究建立的五重实时荧光PCR方法 可用来区分市场上淀粉及其制品中的豌豆源性、绿豆源性、玉米源性和木薯源性成分,具有较好的应用价值。