食品中蜡样芽胞杆菌实时荧光RPA检测方法的建立与应用

为实现简便快速地检测蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus),根据Gen Bank中蜡样芽胞杆菌16 S RNA序列设计特异性引物和exo探针,建立了一种实时荧光重组酶聚合酶扩增方法,在39℃恒温下仅需20 min即可完成检测。该方法特异性扩增蜡样芽胞杆菌16 S RNA基因片段,对其他芽胞杆菌和非芽胞杆菌无扩增;以蜡样芽胞杆菌基因组DNA作为模板,该方法的检测灵敏度为1.0×10-3ng/μL,同已发表的real-time PCR方法一致。人工污染实验表明,当大米饭中蜡样芽胞杆菌污染量≥1.5×104CFU/g时,即可通过real-time RPA方法检出,所需时间仅为6~13min;而当污染量≥1.5×105CFU/g时,才能通过real-time PCR方法检出,所需时间至少为30 min(Ct值为20~31)。

非洲猪瘟病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立

非洲猪瘟是一种跨境动物疫病,对世界养猪业危害严重。目前,该病的流行范围越来越广。为防止该病传入我国,当前急需建立快速、简便、可靠的检测方法。本研究通过分析非洲猪瘟病毒B646L基因保守区域,设计并合成了特异性引物和exo探针,建立了检测非洲猪瘟病毒的实时荧光RPA方法。利用该方法可在20 min内完成检测过程,最低可检测到16拷贝/反应;与猪的其他常见病原核酸无交叉反应;与荧光PCR方法具有相似的灵敏度和特异性;利用该方法对100份国内临床样品进行检测,结果均为阴性。本研究所建立的非洲猪瘟病毒实时荧光RPA检测方法具有简单、快速、敏感性高、特异性强的优点,在临床鉴别诊断、检验检疫和病原监测等方面具有广泛的应用价值。

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒实时荧光RPA快速检测方法的建立

针对淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了LCMV实时重组聚合酶等温扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-timeRPA)检测方法。该检测方法具有良好的特异性,与LCMV同步检测的其他鼠病毒均未出现交叉反应;该检测方法具有与RT-PCR一样的高敏感性;通过对LCMV感染鼠组织样本和LCMV阴性鼠血清样本的检测,证实建立的实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样20min内即可判读结果,可满足啮齿类动物LCMV快速检疫需要。

犬细小病毒实时荧光RPA检测方法的建立

由犬细小病毒(CPV)引起的犬细小病毒病是我国出入境口岸宠物检疫的重要疫病。为了提高检疫效率,本研究拟建立检测CPV的实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)方法并进行评价。本研究根据CPV衣壳蛋白基因序列设计RPA引物,以GB/T 27533-2011中的PCR方法作为参照,通过检测其他4种犬病毒和3种其他种属的细小病毒来分析实时荧光RPA的特异性、检测不同浓度的模板分析实时荧光RPA的灵敏度、检测CPV阳性或阴性犬的不同组织、血液、尿、粪便等样本以及7株CPV野毒株来分析实时荧光RPA的稳定性。结果显示,本研究建立的实时荧光RPA特异性好、灵敏度高,检测临床组织、体液、粪便样本以及野毒株时都具有良好的稳定性。结果表明,本研究建立的实时荧光RPA可满足CPV快速检测要求。

实时荧光RPA快速检测犬冠状病毒方法的建立

为提升口岸进出境犬猫科动物检疫工作效率,针对犬冠状病毒(CCV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了CCV实时荧光重组聚合酶等温扩增方法(real-time RPA)。结果表明,该方法具有良好的特异性,与其他犬病毒和同属的冠状病毒均未出现交叉反应;其敏感性高于传统的RT-PCR方法;将该方法应用于CCV感染犬的临床组织样本、体表样本及不同时期和地区分离样本的检测,证实该实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样20 min内即可判读结果,可满足犬猫科动物CCV快速检疫的需要。

非洲猪瘟实时荧光RPA诊断方法建立及应用

【目的】非洲猪瘟(African swine fever,ASF)自2018年首次暴发于我国沈阳后,迅速扩散至全国,对我国养猪业造成了沉重打击。研究针对其病原非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)建立一种快速核酸检测技术,为及时发现、准确处理ASF疫情提供一种快速诊断方法。【方法】针对ASFV保守的B646L(p72)基因,设计并筛选合适的引物、探针组合,利用基于重组酶-聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的实时荧光RPA方法,对反应体系、反应条件、样品处理步骤等进行优化;利用质控品,对检测方法的特异性和灵敏度进行评价。对1 009份临床样品进行检测,并利用OIE推荐的实时荧光定量PCR方法(qPCR)和病毒分离,进一步验证该方法的检测结果。【结果】筛选得到一套合适的引物、探针,建立了针对ASFV p72基因的实时荧光RPA检测方法,优化后的反应体系总体积为25μL,在实时荧光定量PCR仪器上,最适反应条件为39℃10 s,39℃20 s,40个循环,扩增反应时间约20 min;室温裂解法可取代传统核酸提取方法作为本检测的样品处理方法;使用优化后的条件,可在30 min内实现样品处理、核酸扩增和结果判定的整个过程,特异性评价结果显示本方法对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)、圆环病毒1型/2型(PCV1/2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)样品扩增结果均为阴性;敏感性评价结果显示本方法对基因I型、II型、IX型ASFV的模拟样品均可检出,对II型ASFV阳性模拟血样品可检测至10拷贝/μL,对已知阳性临床组织样品可检至1:103.0稀释度,与OIE推荐的实时荧光定量PCR(qPCR)方法的检测灵敏度一致。通过对1 009份临床样品进行检测,实时荧光RPA诊断方法检出17份阳性,其结果与qPCR方法完全一致;病毒分离获得17份阳性培养物。【结论】建立的实时荧光RPA核酸检测方法操作简便,耗时短,具有较高的灵敏度和特异性,为临床提供了一种新型、简单、特异、快速诊断非洲猪瘟的方法。

出血性大肠埃希菌O157:H7可视化和实时荧光RPA检测方法的比较

目的以检测出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7为目的,基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,分别建立可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法。方法根据出血性大肠埃希菌O157:H7的rfbE基因设计引物和探针,进行特异性、灵敏度检测,建立实时荧光RPA检测方法。结合SYBR Green I在核酸反应中的颜色变化特征,设计可视化RPA检测方法。结果建立的实时荧光RPA检测方法和可视化RPA检测方法,分别在35℃时反应不超过25 min即可检测EHEC O157:H7。设计的引物和探针仅对EHEC O157:H7出现特异性结果。两种检测方法的检测限低于10-5 ng/μL。结论EHEC O157:H7的可视化RPA检测方法和实时荧光RPA检测方法操作简便,且特异性强、敏感性高,可为EHEC O157:H7的现场快速检测和实验室检测提供新方法。

斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶实时荧光RPA快速检测方法研究

斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶在肉质和产品形态上十分相似,相互难以区分,市场上商品名称混乱,进出口货物中标签和实物不符等现象屡有发生。本实验根据3种鱼的保守基因序列,设计并筛选出3对特异性重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)的引物和探针,建立了基于实时荧光RPA技术的斑点叉尾鮰、半滑舌鳎和低眼无齿巨鲶的物种成分快速检测方法,并对方法进行特异性和灵敏性分析。结果表明,建立的实时荧光RPA检测方法具有较好的特异性和灵敏性,且简单、快速,整个扩增时间仅需20 min,为相关产品的物种成分鉴定提供了快捷、准确的检测依据。

犬副流感病毒实时荧光RPA检测方法的建立

为快速监控犬猫科动物中犬副流感病毒(CPIV)的感染情况,本研究针对CPIV核衣壳蛋白基因的保守序列,设计特异性引物和荧光探针,建立了CPIV实时荧光重组酶聚合酶等温扩增方法(real-time RPA)。结果表明,该方法具有良好的特异性,与其他犬病毒和同属的副黏病毒均未出现交叉反应;其敏感性与RT-PCR方法相近;将该方法应用于CPIV感染犬的临床组织样本、体表样本的检测,证实该实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA方法检测周期仅30min即可完成结果判读,满足了犬猫科动物CPIV快速检测的需要。

胞内劳森菌实时荧光RPA方法的建立及初步应用

本研究基于胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis)16S rRNA基因保守序列,设计特异性引物和exo探针,建立了一种能够快速检测胞内劳森菌的实时荧光重组酶聚合酶扩增方法(real-time RPA)。进一步对real-time RPA方法的特异性和灵敏性进行了分析,对临床疑似病例的猪粪便和回肠样品进行了检测,并同real-time LAMP和real-time PCR检测结果进行了比较。结果表明,该方法能够在39℃等温条件下,20 min内实现对胞内劳森菌的有效检测;所建立的方法特异性强,仅对L.intracellularis产生特异性扩增,对其他常见引起猪腹泻的病原均无扩增;灵敏性高,以L.intracellularis基因组DNA为模板,检出限为1.4×10^2fg/μL;在60份临床样品中,该方法对L.intracellularis的检出率为66.7%(40/60),同real-time LAMP和real-time PCR方法一致。本研究所建立的real-time RPA方法反应快速、特异性强、灵敏性高,可用于猪场胞内劳森菌的快速检测。

快速检测犬瘟热病毒的实时荧光RPA方法的建立

针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因保守序列,设计特异性引物和荧光探针,并进行了敏感性和特异性试验,建立了CDV实时重组聚合酶等温扩增(real-time recombinase polymerase amplification,real-timeRPA)检测方法。结果表明,该实时荧光RPA方法在39℃恒温反应25min能特异性扩增目的基因,与其他犬病毒以及CDV同属的麻疹病毒均未出现交叉反应;该检测方法具有与RT-PCR一致的敏感性;通过对CDV阳性犬的组织样品、体表样品和不同时期分离鉴定的临床样本的检测,证实建立的实时荧光RPA方法具有良好的稳定性和可靠性。与现有的核酸检测方法相比,该实时荧光RPA检测方法在核酸上样25min内即可判读结果,可满足CDV快速检疫的需要。

新型冠状病毒实时荧光双重逆转录RPA的建立及其在食品检测中的应用

旨在建立一种新型冠状病毒实时荧光逆转录重组酶聚合酶恒温快速的检测技术(RT-RPA)用于新型冠状病毒的检测与监测。根据新型冠状病毒保守的特异性S基因以及N基因序列,设计了两套RPA引物、探针;同时基于N基因等靶标序列构建重组载体,构建新型冠状病毒假病毒颗粒(VLPs)作为阳性质控品。经验证,筛选出一套基于S基因以及N基因的双重RPA引物、探针组合,其分析敏感度S基因引物探针可达10 copies/reaction,N基因引物探针分析敏感度可达102 copies/reaction;分析特异性良好,与H1N1流感病毒、PEDV、TGEV、FMDV、PPRV以及RV病毒无交叉反应。该方法建立后,应用于食品、动物组织器官及临床样本的检测。该方法可特异性从上述样本中检测到新型冠状病毒,表明其具有速度快(20 min)、双靶标、灵敏度高、操作简便,对仪器设备要求低等优点,可用于新型冠状病毒在食品、动物产品以及临床样本中的快速筛查。

非洲猪瘟病毒实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)检测方法的建立

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究利用重组酶聚合酶扩增技术(RPA),针对ASFVB646L(p72)基因设计了3组引物和探针,并进行筛选、反应条件优化、灵敏性、特异性和重复性试验,建立了实时荧光RPA方法。结果显示,该方法在39℃、20 min内即可检测10个拷贝的DNA分子,且与猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应,检测5.5×106至5.5×100拷贝/μL共7个稀释度样品在各时间点的荧光强度,变异系数范围在0.38%~28.30%。该等温、快速扩增方法可用于ASFV的定性检测,为中国ASFV感染的早期诊断提供技术支持,对疫情暴发后相应控制方案的制定具有重要意义。

西瓜细菌性果斑病菌现场快速双模荧光RPA检测方法的建立

瓜类细菌性果斑病菌(bacrerial fruit of blotch,BFB)是中国检疫性病害,其传播非常迅猛,且目前没有商品化抗病品种。为建立西瓜果斑病菌现场快速荧光重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)检测方法,针对细菌性果斑病菌特异性序列设计并筛选出了RPA最佳的引物和探针组合,利用两种模式[实时荧光监测RPA(real time RPA,RT-RPA)和终端荧光可视化检测RPA(end point RPA,EP-RPA)]对RPA的结果进行分析,并与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果进行对比。结果显示,建立的细菌性果斑病菌双模荧光RPA检测方法特异性强,且其对病原物的检测灵敏度与qRT-PCR的灵敏度相当。在实际样品检测中,RT-RPA、EP-RPA和RT-PCR的检测结果一致性为100%。在检测时间上,EP-RPA的检测时间为20 min,RT-RPA平均检测时间约为5 min,qRT-PCR的平均检测时间约为44 min;RPA的检测速度最快,而且不依赖大型的仪器,方便快捷,适用于现场检测。该恒温快速检测方法的建立为植物病害的现场检测提供了新的技术支持。

实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测Ⅱ型鲤疱疹病毒

【背景】Ⅱ型鲤疱疹病毒(Cyprinid Herpesvirus 2,CyHV2)感染鲫引起的疱疹病毒性造血器官坏死病(Herpes Viral Haematopoietic Necrosis,HVHN)是鲫养殖业的主要病害,造成严重的经济损失。目前尚无治疗HVHN的有效药物。对CyHV2进行早期监测和有效防控是阻止该病暴发的有效手段。【目的】建立一种针对CyHV2的orf72基因的实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)检测方法,并评价其特异性和灵敏度。【方法】通过比较CyHV2五株毒株间orf72核苷酸序列,在保守区设计特异性引物和探针。设置5个反应温度,优化实时荧光RPA反应的条件。在最优的条件下验证实时荧光RPA检测方法在不同水产动物病毒间的特异性。以梯度稀释的CyHV2阳性DNA为模板比较实时荧光RPA与qPCR的灵敏度。【结果】实时荧光RPA能在37.8°C条件下20 min内快速准确地检测CyHV2病毒,而且种间特异性高,与其他病毒无交叉反应,反应灵敏度与qPCR相同。【结论】研究建立的实时荧光RPA可用于CyHV2的现场快速检测,具有一定应用价值。

实时荧光重组酶聚合酶扩增技术(RPA)快速检测鼠疫耶尔森菌

目的建立基于实时荧光重组酶聚合酶扩增(RPA)的鼠疫耶尔森菌快速检测技术。方法以鼠疫菌特异基因序列YPS723为靶标,设计实时荧光RPA引物探针并进行筛选;构建含有基因待检片段的重组质粒进行实时荧光RPA方法灵敏度的评价;将15种非鼠疫菌细菌基因组混合后进行实时荧光RPA方法特异性验证;将鼠疫菌基因组掺入人血清和小鼠全血中模拟自然感染状态,以评估实时荧光RPA检测的实用性。结果筛选出的实时荧光RPA引物、探针在39℃条件下15 min内即可在便携装置上获得检测结果,最低检测模板质粒浓度为10拷贝/μl,与其他细菌无交叉反应且重复性良好。实时荧光RPA对人血清模拟样本和小鼠全血模拟样本中鼠疫菌基因组的检出限为50 fg/μl,且在模拟样本盲测中正确率达100%。结论该研究开发了一种快速、便携、灵敏度高、特异性好的实时荧光RPA方法用于鼠疫菌的检测。

转基因玉米Bt11品系特异性荧光RPA检测

重组酶聚合酶介导的等温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)作为一种新型等温扩增技术,具有反应时间短、灵敏度高、特异性强等特点,在转基因检测领域得到了广泛关注。本研究针对转基因玉米Bt11外源插入链接区域设计筛选了特异性引物和探针,建立了快速准确的荧光RPA检测方法,在39℃条件下,20 min内完成扩增并且能够实时监测,可以准确有效地检测到50个拷贝的靶标片段。而且,对于背景复杂的植物基因组DNA能够得到准确的扩增曲线。本研究不仅可以满足常规实验室检测,通过RPA便携式仪器,还可以满足转基因植物现场检测,具有广阔的应用前景。