贵州蓝莓蜜TaqMan探针实时荧光PCR检测方法的建立与应用

该研究利用TaqMan特异性探针实时荧光PCR检测手段,建立了高效、精准鉴别贵州特色(中蜂)蓝莓蜜的方法。对贵州白竹林、麻卡和乌卡坪三个地域的蓝莓种植区蓝莓蜜进行采集(包括意蜂蓝莓蜜),同时购买市售蜂蜜及加拿大蓝莓蜜,该方法通过采集贵州麻江县白竹林地区蓝莓种植园及蜂场周围蓝莓同花期26种植物样本,基于植物基因组中trnL基因序列的多序列比对,设计蓝莓trnL基因特异性引物,并进行TaqMan探针验证。结果表明,本研究设计的TaqMan探针特异性强,建立的TaqMan探针实时荧光PCR检测方法能检测到蓝莓花粉DNA最低浓度为0.3 ng/μL;利用建立的方法对11种市售蜂蜜和贵州蓝莓蜜样本进行检测,发现贵州蓝莓蜜的Ct值为24~26,蓝莓花粉数在800~1700颗,其余蜂蜜Ct值在30以上,表明该方法能够有效实现贵州蓝莓蜜和其他蜂蜜的区分,具有良好的应用前景。

基于LNA-TaqMan探针实时荧光定量PCR检测技术的药用黄精掺伪研究

目的:建立一种快速、灵敏、有效的实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法,用于检测湖北黄精掺伪药用黄精。方法:基于锁核酸(LNA)-TaqMan探针实时荧光定量PCR技术,利用不同基原药用黄精样品的叶绿体DNA中trnC-petN基因序列差异,根据常见混伪品湖北黄精特异性差异位点设计筛选探针引物,并对引物及LNA-TaqMan探针的特异性进行验证。根据扩增曲线临界循环数(Ct)值的差值计算湖北黄精掺伪比例。结果:基于LNA-TaqMan探针能够特异性地检测出湖北黄精并确定掺伪比例,在湖北黄精掺伪1%时,仍可稳定检出。结论:该方法简便准确、稳定可靠,可以用于药用黄精掺伪湖北黄精定量检测。

TaqMan实时荧光PCR快速检测与鉴定单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品

利用TaqMan实时荧光PCR技术对单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品进行快速鉴定和验证。依据GB 4789系列标准的第一法对ACAS-PT526能力验证中的样品D15和样品D16进行检测,通过增菌、分离、初筛和鉴定等传统培养法检测。鉴定过程中还使用了鉴定试剂条API Listeria和全自动微生物鉴定系统。同时采用TaqMan实时荧光PCR技术对经过增菌的样品D15与样品D16的培养物和单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株的培养物进行快速鉴定。结果表明,经API Listeria试剂条鉴定,样品D15为单核细胞增生李斯特氏菌,鉴定百分率为98.6%,T值为1;经全自动微生物鉴定系统检测,样品D15为单核细胞增生李斯特氏菌,99%可能性;样品D16为金黄色葡萄球菌,99%可能性;经实时荧光PCR鉴定,样品D15 LB1增菌液培养物及李斯特显色培养基平板上的单菌落都具有显著的S型扩增曲线。综上得出,实时荧光PCR与GB 4789.30—2016的第一法试验结果一致,样品D15为单核细胞增生李斯特氏菌检出,样品D16为单核细胞增生李斯特氏菌未检出,TaqMan实时荧光PCR方法可用于微生物的快速检验,尤其是对盲样检测的辅助验证。

布鲁氏菌TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立与初步评价

目的建立快速、准确检测布鲁氏菌感染的TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。方法利用布鲁氏菌IS711基因序列设计特异性引物和探针,并对该方法的特异性、灵敏度及重复性进行评价。结果所建立的检测方法可对布鲁氏菌基因组进行特异性检测,对其他细菌无特异性扩增曲线。该检测方法基因拷贝数的检出限为3.8 copy/μL。批内变异系数在0.20%~2.01%,批间变异系数在0.71%~2.57%,具有较高的可重复性。采用qPCR检测临床标本,其灵敏度明显高于血培养检测,可对患者做出准确、及时的诊断。结论该实验建立的TaqMan qPCR检测方法能有效、快速准确地检测布鲁氏菌感染。

结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能分析

目的探讨结核分枝杆菌/利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert)检测对菌阴空洞肺结核的诊断效能。方法选取河北省胸科医院2021年4月至2022年10月期间行手术治疗的124例肺部空洞疾病患者相关病历资料,其中菌阴空洞肺结核86例(观察组),非结核肺部空洞疾病38例(对照组)。收集患者手术标本Xpert检测和外周血结核感染T细胞斑点(T-SPOT)试验结果,分析二者对菌阴空洞肺结核的诊断效能。结果Xpert检测和T-SPOT试验诊断菌阴空洞肺结核的敏感度为68.6%、75.6%,特异度为97.4%、68.4%。Xpert检测的敏感度低于T-SPOT试验(χ^(2)=5.832,P<0.001),特异度高于T-SPOT试验(χ^(2)=21.469,P<0.001)。2种方法在观察组中的阳性检出率均高于对照组[Xpert检测:68.6%(59/86)比2.6%(1/38);T-SPOT试验:75.6%(65/86)比31.6%(12/38)](均P<0.001)。受试者工作特征曲线分析结果显示,Xpert检测诊断菌阴空洞肺结核的曲线下面积为0.830,T-SPOT试验的曲线下面积为0.729,Xpert检测的准确度高于T-SPOT试验(P<0.001)。结论Xpert检测对菌阴空洞肺结核有比较可靠的诊断效能。

牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法,根据GenBank收录的牛冠状病毒AKS-01株N基因序列(KU886219)保守区设计特异性引物和探针,构建重组质粒并进行反应条件优化、特异性试验、重复性试验以及敏感性试验,建立一种检测BCoV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,建立的牛冠状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法特异性、敏感性和重复性均良好。该方法BCoV重组质粒标准品在5.75×10^(7)~5.75×10^(3)copies/μL时与Ct值呈现良好线性关系,该方法对牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型均无交叉反应,特异性良好;该方法对BCoV重组质粒标准品最低检测限为5.75×10^(1)copies/μL;批内和批间重复性试验结果稳定,变异系数均小于2%。利用所建立的TaqMan荧光定量PCR方法对收集的132份样品进行检测,与常规PCR相比,两者符合率为96.21%,可为BCoV的临床检测和流行病学调查提供技术支持。

TaqMan多重实时定量PCR快速检测3种常见食源性病原菌

建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌的多重实时定量PCR(qPCR)方法。依据大肠杆菌O157:H7 tir基因、单增李斯特菌mpl基因和蜡样芽孢杆菌entFM基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行灵敏度、特异性和稳定性试验,同步检测人工染菌牛奶样品中的病原菌并与国家标准方法作对比。结果表明,建立的多重qPCR方法灵敏度高,最低检出限为12 CFU/mL;特异性强,只对3种目标菌进行PCR扩增;稳定性好,各重复性试验中Ct值的变异系数<1%;所有受污染样品阳性检出率均为100%,与国家标准方法检测结果一致,且检测周期缩短至6 h。本研究建立的TaqMan多重qPCR方法能同时快速、准确地检测乳品中的大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌和蜡样芽孢杆菌,为食品安全提供技术支撑。

鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增(RAA)检测方法的建立及应用

为建立鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)的实时荧光重组酶辅助扩增(recombinase-aided amplification,RAA)检测方法,根据AngHV的ORF 95基因序列设计引物和探针,优化反应温度,确定反应时间,并应用该方法对采集的临床样品进行检测。结果表明:本研究中建立的实时荧光RAA检测方法的最佳反应温度为39℃,反应时间为20 min;实时荧光RAA检测方法的灵敏度、特异性及重复性评价显示,RAA检测AngHV的最低检测量为1×10^(2)copies/μL,可特异性地检测AngHV,与美洲鳗鲡腺瘤病毒(American eel adomavirus,AEAdoV)、蛙虹彩病毒(Rana grylio virus,RGV)、鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus,KHV)和对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)均无交叉反应;实时荧光RAA检测方法的组内和组间变异系数均小于5%,表明实时荧光RAA检测方法灵敏度高、特异性强和重复性好;应用该方法对采集的25份临床样品进行检测显示,实时荧光RAA检测方法与qPCR方法的检出率一致,均为92%,高于普通PCR的检出率(76%)。研究表明,本研究中所建立的鳗鲡疱疹病毒实时荧光重组酶辅助扩增RAA检测方法快速、灵敏、可靠、准确,可用于AngHV的临床快速检测和流行病学调查。

RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术在儿童支原体肺炎早期诊断及疗效判断中的价值

目的 考察实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)在儿童肺炎支原体肺炎(MPP)早期临床诊断中的价值及其在评价MPP转归以及判断药物疗效中的作用。方法 选取社区获得性肺炎(CAP)住院患儿451例,所有患儿在入院24 h内采集血清标本,采用被动凝集试验检测肺炎支原体(MP)特异性抗体[MP抗体检测(MP-Ab)],并采集咽拭子标本提取MP-RNA(MP-SAT法)。对MPP患儿在完成大环内酯类药物治疗第1疗程、完成大环内酯类药物治疗第3疗程时复查MP-Ab和MP-RNA。根据MPP诊断标准将其分为MPP组(n=183)和非MPP组(n=268)。比较MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性(敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值)。对病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物的MPP患儿进行动态观察,考察在大环内酯类药物(阿奇霉素)治疗MP不同时间点(入院时、完成第1疗程和完成第3疗程时)MP-SAT和MP-Ab的阳性率以及患儿临床和影像学表现(咳嗽、发热、肺部体征和CT表现)变化情况。结果 MP-SAT和MP-Ab诊断MPP的准确性比较差异无统计学意义(P>0.05);病程<7 d患儿组中MP-SAT诊断MPP的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值均优于MP-Ab(P<0.001或P<0.05或P<0.01)。病程<7 d入院前未使用大环内酯类药物治疗的MPP患儿共42例,该组患儿在入院时、完成阿奇霉素治疗第1疗程和完成阿奇霉素治疗第3疗程时,MP-SAT检测阳性率分别为88.09%(37/42)、88.09%(37/42)和9.52%(4/42);MP-Ab检测阳性率分别为26.19%(11/42)、100.00%(42/42)和100.00%(42/42),在不同时间点MP-SAT和MP-Ab阳性率比较差异有统计学意义(P<0.001,P<0.05,P<0.001)。该组患儿完成第3疗程时MP-SAT阳性率较入院时明显下降(P<0.001),临床症状(咳嗽、发热)、肺部体征及肺部CT表现较入院时明显好转(均P<0.001),MP-SAT结果与临床症状、肺部体征及肺部影像学表现变化趋势相一致。结论 SAT检测MP-RNA可作为儿童MPP的早期诊断依据,同时也可作为评价MPP转归及判断临床治疗效果的指标。

复合探针实时荧光RT-PCR法检测小儿上呼吸道感染甲型流感病毒的价值

目的 分析小儿上呼吸道感染甲型流感病毒应用复合探针实时荧光反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测的临床价值。方法选择2023年1月至2023年12月流感监测信息系统两家监测点上呼吸道感染甲型流感病毒感染的患儿80例监测标本进行回顾性分析,均开展复合探针实时荧光RT-PCR法检测,分析其诊断价值。结果 根据监测标本最终诊断结果显示,阳性标本68例、阴性标本12例。经复合探针实时荧光RT-PCR法检出67例,检出率为83.75%,敏感度为95.59%、特异度为83.33%、准确度为93.75%、阳性结果预测值为97.01%、阴性结果预测值为76.92%;批间批内变异系数均小于5%。结论 小儿上呼吸道感染甲型流感病毒应用复合探针实时荧光RT-PCR技术具有较高的敏感度、特异度及准确度,且检查结果快速,可为小儿上呼吸道感染甲型流感病变提供可靠的诊断,有利于制订合理的治疗方案。

实时荧光定量PCR法对ICU患者痰液标本中鲍曼不动杆菌耐药基因的检测及其评价

目的研究实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在重症监护室(ICU)患者痰液标本中检测鲍曼不动杆菌耐药基因的效果。方法选择2021年3月至2022年12月南阳市中心医院纳入的68例ICU患者进入试验,分别收集其痰液标本,通过实时荧光定量PCR法测定标本内鲍曼不动杆菌耐药基因情况,统计鲍曼不动杆菌及耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的检出率,并观察耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌的药敏试验结果,最后分析OXA-51基因检查结果和耐药基因OXA-23检查结果。结果68例ICU患者的痰液标本中,通过传统培养方式检出鲍曼不动杆菌33株,阳性检出率48.53%;耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌共检出23株,阳性检出率33.82%;基因检测OXA-51阳性显示鲍曼不动杆菌有37株,阳性检出率54.41%;OXA-23阳性显示耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌有25株,阳性检出率36.76%。针对碳青霉烯类药物产生耐药的鲍曼不动杆菌所占比例占75.76%。耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌对于大部分药物耐药,耐药性较低的药物分别有头孢哌酮舒巴坦、米诺环素、替加环素、黏菌素等。传统培养和耐药基因的阳性检出率相比,差异并无统计意义(P>0.05);经Kappa检验显示为0.879,证实两种方式的检查结果的一致性较好。传统培养和耐药基因的阳性检出率相比,差异并无统计意义(P>0.05);经Kappa检验显示为0.712,证实两种方式的检查结果的一致性一般。结论实时荧光定量PCR法的效果明显,可成为鲍曼不动杆菌耐药基因检测的主要方式。

猪肺炎支原体和猪鼻支原体TaqMan双重荧光PCR检测方法的建立及应用

为建立一种可快捷鉴别检测猪肺炎支原体(Mhp)和猪鼻支原体(Mhr)的方法,针对Mhp的183基因和Mhr的p37基因保守片段,分别设计合成引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立一种可同时检测Mhp和Mhr的TaqMan双重荧光PCR方法,并评价其特异性、敏感性和重复性。结果表明,该方法特异性强,检测其他常见猪呼吸系统病原不发生交叉反应;对标准品pMD18-T-Mhp-183、pMD18-T-Mhr-P37的最低检测限分别达45.2 copies/μL和29.7 copies/μL,比普通PCR检测灵敏度提高10^(3)~10^(4)倍;该方法检测结果的批内与批间变异系数均小于2%。用该方法检测145份广西自治区内临床样品,从中检出82份Mhp和9份Mhr阳性样品。该方法可用于临床样品快速检测及实验室Mhp和Mhr的鉴定,可为Mhp和Mhr在猪群中的早期监测提供技术支持。

猪源盖塔病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪盖塔病毒感染是由盖塔病毒(GETV)引起母猪妊娠初期胎儿死亡、初生仔猪发病的一种繁殖障碍性疾病。猪是自然界中GETV的主要扩增宿主,可以产生足够高的病毒血症滴度来感染叮咬的蚊子并维持GETV的传播周期,所以定期对猪群进行GETV监测对于预防潜在的GETV暴发具有重要意义。本研究通过分析GETV E2蛋白基因特征,设计特异性引物和探针,条件优化后建立检测GETV感染的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:以阳性质粒为标准品建立的标准曲线在1×10^(2)~1×10^(7)copies/μL内呈现良好的线性关系,扩增效率为1.61;该检测方法的最低检出限低至3.16 TCID50/mL,远远低于普通PCR的检测限3.16×10^(3)TCID50/mL;组内、组间重复性试验的变异系数均小于2%,具有良好的重复性和稳定性。本研究建立的方法能够快速有效的检测和定量GETV,为猪群中GETV监测提供可靠的检测方法。

猪细小病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种猪细小病毒(PPV)快速准确PCR检测方法,根据PPV VP2基因的保守序列设计并合成1对特异性引物和1条特异性探针,建立了可检测PPV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。建立的检测方法敏感性高,最低可检测8.76×10^(1)copies/μL的PPV VP2基因标准品;特异性试验结果显示,该方法检测猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验组内与组间变异系数均低于2%,重复性良好。用该方法检测102份临床样本,检出阳性样本16份,阳性检出率为15.69%,将检测出的阳性样本进行PCR扩增并测序,证实检测样品中确实存在PPV。该方法敏感性高、特异性强,适用于PPV的定量检测及猪细小病毒病的流行病学调查。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

实时荧光定量PCR检测鸭源鹅细小病毒方法的建立与应用

为建立一种快速且准确检测鸭源鹅细小病毒(D-GPV)的实时荧光定量PCR方法,本研究通过分析D-GPV基因序列的保守区设计并合成一对特异性引物,构建携带NS1基因的重组质粒作为标准品,绘制实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性、特异性、重复性试验和临床样品的检测。结果显示,该方法标准曲线的的线性关系良好,相关系数为0.999;灵敏度高,检测底限为10拷贝;特异性与重复性好,与其他病毒无交叉反应,批间和批内变异系数均低于1%。该方法对人工感染D-GPV鸭泄殖腔拭子和咽拭子样品的检测结果显示,鸭在攻毒后第1 d即可以通过口腔和泄殖腔向外排毒,排毒量在第3 d达到高峰,排毒持续期可达到42 d。本研究所建立的实时荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于临床样品中的D-GPV检测。

鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

鸽腺病毒通用型实时荧光PCR检测方法的建立与应用

鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAdV)是影响鸽产业健康发展的重要病原之一。为实现PiAdV的高通量快速检测,根据GeneBank登录的PiAdV-A种和PiAdV-B种病毒pⅧ基因序列的共同保守区域设计特异性检测引物和探针,经反应条件优化,建立了一种PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法,并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示:该方法的最佳探针浓度为0.2μmol/L,与鸽群其他常见病毒无交叉反应,对PiAdV的最低检测限为56.9 copies/μL,比常规PCR敏感性高100倍,组内和组间重复变异系数均小于1.8%。利用该方法和常规PCR方法对20份疑似PiAdV感染样品进行检测,发现PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法的病毒阳性检出率高于常规PCR方法。结果表明,本研究建立的PiAdV通用型实时荧光PCR检测方法特异性强、敏感性高、可靠性好,可用于PiAdV感染的临床检测及流行病学调查。

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

牛支原体和丝状支原体丝状亚种双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病均为重要的牛传染病,两者均可致牛出现呼吸系统症状,临床上难以区分。为建立鉴别诊断牛传染性胸膜肺炎和牛支原体病的双重Taq Man荧光定量PCR检测方法,本研究根据这两种病的病原丝状支原体丝状亚种和牛支原体的基因组保守区域(丝状支原体丝状亚种nt826-nt1742,牛支原体nt189-nt618)分别设计引物与探针,通过优化反应体系与反应条件,建立同时检测这两种病原的Taq Man荧光定量PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法仅对丝状支原体丝状亚种模拟样品和牛支原体检测结果为阳性,而巴氏杆菌、牛传染性鼻气管炎病毒、无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、关节炎支原体Leachii株检测结果均为阴性,特异性较强。分别以1.0×10~7拷贝/μL~1.0×10~1拷贝/μL的p EASY-Mmm和p EASY-Mb质粒标准品为模板,进行敏感性试验,结果显示,该方法对丝状支原体丝状亚种和牛支原体重组质粒标准品的检测限均为1.0×10~1拷贝/μL,敏感性较高。对不同浓度质粒标准品混合物的重复性试验结果显示,组内与组间重复性试验变异系数均小于2.5%,重复性较好。利用该方法对112份临床样品(104份鼻拭子、8份肺组织样品)检测,结果显示,丝状支原体丝状亚种检测结果和已发表PCR方法检测结果一致,均为阴性,而本实验建立的方法检测出4份牛支原体阳性样品,且经测序证实检出样品为真实阳性样品,而已发表的多重PCR方法检测该病原结果均为阴性。本研究建立了能够同时检测丝状支原体丝状亚种和牛支原体的双重Taq Man荧光定量PCR方法,其特异性强、敏感性高、重复性好,可用于各种临床样品的检测,为这两种病原的快速检测和流行病学调查提供了技术手段。