鸭坦布苏病毒TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立一种有效、快速、准确的鸭坦布苏病毒(DTMUV)TaqMan探针实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本试验针对NCBI发布的DTMUV E基因保守序列设计特异性引物和探针,建立qPCR反应体系。通过制备的标准质粒建立标准曲线,评估该方法的特异性、敏感性和重复性,并使用该方法对临床样本进行检测。结果显示,所建立的标准曲线相关系数为0.999 5,有良好的线性关系;该方法可特异检测DTMUV;对标准质粒的最低检测限为2.72×10^(2) copies/μL,是普通PCR的100倍;CT值组内变异系数为0.97%~1.32%,组间变异系数为1.24%~1.79%;人工感染DTMUV的20份鸭胚成纤维细胞样本以及12份人工攻毒2 d的雏鸭脾脏组织样本和12份泄殖腔棉拭子样本阳性率为100%(44/44);疑似感染的12份活鸭泄殖腔棉拭子阳性率为25.00%(3/12),14份病死鸭脾脏组织样本阳性率为28.57%(4/14)。结果表明,本试验建立的TaqMan探针qPCR方法有良好的敏感性、准确性和重复性,能特异检测DTMUV,适用于临床快速检测,为DTMUV的分子流行病学调查和临床疾病诊断提供了技术支撑。

常规PCR与实时荧光定量PCR(qPCR)技术敏感性比较

对70匹采自青海省海南藏族自治州兴海县和贵南县喜马拉雅旱獭体表寄生蚤2科3属3种,包括斧形盖蚤(Callopsylla dolabris)、谢氏山蚤(Oropsyllasilantiewi)、人蚤(Pulex irritans)进行巴尔通体检测,并对11个阳性样品进行常规PCR和实时荧光定量PCR(qPCR)的敏感性比较。通过常规PCR反应产物和qPCR反应产物琼脂糖凝胶电泳分析,发现qPCR检测敏感性高于常规PCR。此项技术的应用将对巴尔通体感染的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效方法。

口蹄疫病毒直接实时荧光RT-qPCR检测方法的建立

根据口蹄疫病毒VP1基因保守序列,设计出1对口蹄疫病毒引物FMD-F、FMD-R及特异性探针FMD-Pb序列,建立了一种简便、快速、高效的口蹄疫病的直接实时荧光RT-qPCR(dRT-qPCR)检测方法。结果表明,在特异性方面,对口蹄疫病毒7个血清型的检出率100%;在灵敏度方面,其与常规提取RNA方法对比,阳性检出率差别很小;在对133份未知样本检测方面,dRT-qPCR方法检出阳性88份,常规方法检出阳性84份。dRT-qPCR方法的检测结果更可靠,适于对大量样本进行检测。

BVDV和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含BVDV和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,构建了实时荧光定量PCR(qPCR)标准曲线,并对双重qPCR方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。试验结果显示,qPCR最适退火温度为54.0℃,BVDV引物浓度为0.2μmol/L,IBRV引物浓度为0.3μmol/L,BVDV探针浓度0.2μmol/L,IBRV探针浓度为0.1μmol/L。BVDV的RNA最低检测限为100拷贝/μL,IBRV的DNA最低检测限为1拷贝/μL,并具有良好的特异性和重复性,为BVDV和IBRV的同时、快速、定量检测提供了有效的方法。

2021—2022年我国沿海养殖虾类中虾肝肠胞虫(EHP)流行病学调查

2013年以来,我国沿海各省市养殖对虾中先后出现虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)感染且感染率居高不下,使我国虾类养殖产业遭受了严重经济损失。为查明2021—2022年沿海省市养殖虾类中EHP的流行情况,本研究在沿海地区开展了养殖虾类EHP流行情况调查,共采集样品936份,并采用Taq Man实时荧光定量PCR(TaqMan qPCR)和组织病理检测对样品进行分析。TaqMan qPCR检测结果表明,2021和2022年所采集的虾类样品中,EHP的阳性检出率分别为10.67%(54/506)和13.72%(59/430);2021和2022年主要在凡纳对虾(Penaeus vannamei)中检出EHP阳性,阳性检出率分别为14.10%(54/383)和16.71%(58/347),且检出EHP阳性的凡纳对虾主要来自山东、辽宁、广东、河北和天津等省市;1份脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)样品中检出EHP阳性,罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、克氏原螯虾(Protocrayfish cruzi)、斑节对虾(P.monodon)、日本对虾(P.japonicus)和中国对虾(P.chinensis)等虾类样品中未检出EHP阳性。对TaqMan qPCR检测呈阳性的凡纳对虾进行组织病理检测,在其肝胰腺上皮细胞中观测到分散或成簇的EHP孢子以及处于生长阶段的EHP原质团。本研究表明,2021—2022年EHP仍在我国沿海地区养殖的凡纳对虾中流行,尽管其流行率较前几年呈下降趋势,但其对凡纳对虾养殖产业的危害仍不容忽视。

转基因大豆中外源基因g10evo-epsps的qPCR检测方法的建立和验证

耐除草剂基因g10evo-epsps在我国转基因农作物研发中常常被用作目标性状基因或筛选标记基因,因此可作为转基因成分检测的重要筛查基因,但目前缺少相应的检测方法。本研究旨在建立g10evo-epsps基因特异性的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,从而为转基因大豆的监测提供一种稳定可靠的方法体系。本研究基于转基因大豆中的g10evo-epsps基因序列设计了qPCR检测引物和探针,并对检测方法的特异性、灵敏度、准确度和精确性进行了实验室内验证。结果显示,建立的g10evo-epspsqPCR检测方法能够特异性检测转基因大豆ZUTS-33中的g10evo-epsps目的基因;标准曲线分析表明,3次重复试验的扩增效率在90%以上,R2均大于0.99;方法的检测限(LOD)为不高于8拷贝,定量限(LOQ)推测为16拷贝;对含量为4.5%、2%、0.5%、0.09%和0.045%的转基因大豆ZUTS-33基因组DNA进行准确度分析,发现该方法测定的平均值和预期值之间的偏差为0.00%~11.11%,3次重复试验的RSDr为2.30%~17.10%。结果表明本研究建立的g10evo-epsps qPCR检测方法能够满足转基因大豆筛查检测的要求,为转基因大豆监管和标识提供技术支撑。

肺癌组织中GALNT7的表达变化及其临床意义

目的 探讨N-乙酰氨基半乳糖转移酶7(GALNT7)在肺癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系。方法 收集2016年2月至2018年2月深圳市龙华区人民医院90例接受手术切除的肺癌患者癌组织及配对癌旁正常组织标本。采用免疫组织化学法检测肺癌组织及癌旁正常组织中GALNT7蛋白表达;采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测肺癌组织及癌旁正常组织中GALNT7 mRNA的相对表达水平;分析GALNT7 mRNA表达与肺癌患者的临床病理特征及预后的关系。Kaplan-Meier法分析GALNT7表达与患者生存率之间的关系;Cox比例风险回归模型分析影响患者预后的独立因素。结果 GALNT7蛋白在肺癌组织中的高表达率为55.56%(50/90),显著高于癌旁正常组织中的11.11%(10/90),差异有统计学意义(P<0.05)。肺癌组织的GALNT7 mRNA表达水平为1.51±0.25,显著高于癌旁正常组织(1.02±0.18),差异有统计学意义(P<0.05)。GALNT7 mRNA表达与肿瘤大小、吸烟史、TNM分期、分化程度及淋巴结转移有关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,GALNT7低表达组患者的5年生存率显著高于高表达组(P<0.05);多因素Cox回归分析显示,淋巴结转移、GALNT7水平是影响肺癌患者预后的独立因素(P<0.05)。结论 GALNT7异常高表达参与肺癌的发生,且有作为肺癌患者预后预测分子标志物的潜力。

应用微量蛋白质定量分析评估临床样本炎性反应状态

目的比较实时荧光定量PCR(qPCR)和微量蛋白质定量分析方法在乳腺癌患者外周血单核细胞中炎性相关因子caspase-1和IL-1β表达检测中的效果差异。方法收集10例乳腺癌患者的术前、术后2 h配对外周血样本各约6 mL,分离出外周血单核细胞并通过脂多糖活化;分别用qPCR和微量蛋白质定量分析方法,检测caspase-1和IL-1β在单核细胞中的mRNA和蛋白质表达水平,并使用了β-actin进行了数据归一化,比较两种检测方法结果的异同,并评估其优缺点。结果绝大部分患者经过手术应激后外周血单核细胞数量明显增加。在mRNA水平上,与术前相比,术后caspase-1和IL-1β在50%(5/10)和40%(4/10)的患者中呈现升高趋势,其余表现为降低(分别为40%和50%)或改变甚微无统计学意义(均为10%)。而微量蛋白质定量分析结果显示,与术前相比,术后caspase-1和IL-1β蛋白在60%(6/10)和60%(6/10)的患者中呈现升高趋势,其余表现为降低(分别为30%和20%)或改变较小无统计学意义(分别为10%和20%),且80%的患者在术后出现了明显增加的caspase-1和IL-1β活性切割电泳条带。重要的是,有30%和40%的患者手术前后caspase-1和IL-1βmRNA和蛋白质水平变化不一致。结论微量蛋白质定量分析方法具有样本用量少、灵敏度高、重复性好、操作相对简单等优点,更适于临床样本的炎性反应状态评估。

基于SYBR Green Ⅰ的桑树皱叶病毒qPCR检测方法的建立及应用

根据桑树皱叶病毒(mulberry crinkle leaf virus,MCLV)cp基因的核苷酸序列,设计了3对用于实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)的引物,以含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,通过PCR和熔解曲线分析筛选出1对适合用于qPCR的特异性引物。以10倍梯度稀释的含有cp基因全长序列的重组质粒为模板,进行SYBR GreenⅠqPCR并制作标准曲线,建立了MCLV的qPCR检测方法。该方法对MCLV cp基因的检测灵敏度≥47.8个拷贝/μL。利用建立的qPCR方法对大田样品进行检测,结果显示15个样品都为MCLV感染阳性,其中病毒含量最高的样品的病毒拷贝数为5.26×10^4个拷贝/μL,最低的样品为8.36×10^2个拷贝/μL。MCLV qPCR检测体系的建立可以为培育健康桑树种苗、预防病毒病的发生提供精准保障技术,也为研究桑树不同生长时期或不同组织中病毒滴度变化奠定了基础。

基于qPCR检测方法的溺死诊断研究

目的针对水体中常见的硅藻、蓝藻和气单胞菌,设计相应引物,采用qPCR方法进行检测,验证该方法的特异性和检测灵敏度,并探讨其在溺死诊断中的应用价值。方法设计与溺死相关的浮游生物特异引物ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD;扩增20种浮游生物标准株DNA以确定其特异性和灵敏度;检测38只实验兔的肺、肝、肾组织的样本,计算设计的6对引物扩增产物的总体检测阳性率,并与相应的硅藻电镜检验结果对比,验证所建立方法诊断溺死的有效性。结果ND、UPA两对引物能特异扩增硅藻属,CBR能特异扩增蓝藻属,AER、HLYA、rPOD能特异扩增气单胞菌属;以上6对引物扩增产物均能达到0.0001ng的检测灵敏度。实验兔的qPCR检测结果显示,16只溺死兔肺组织均为阳性,且分别有13例肝和14例肾呈阳性,总体诊断阳性14例,阳性率可达87.50%;16只死后浸泡兔和6只空白对照兔中,只有5例死后浸泡兔的肺组织检出阳性,其余皆为阴性。电镜结果显示,16只溺死兔的肺、肝、肾均为阳性,16只死后浸泡兔和6只空白对照兔中,只有5例死后浸泡兔的肺组织电镜检出硅藻阳性,其余皆为阴性,与qPCR结果相一致;经统计学分析,上述两种方法对38只实验兔的总体诊断结果差异没有统计学意义(P=0.49>0.05),对38只实验兔的所有肺、肝、肾样本检测的诊断阳性率差异没有统计学意义(P=0.29>0.05)。结论上述6对引物结合qPCR检测方法进行溺死诊断,具有较高的灵敏度,且特异性较好,具有良好的应用前景。

三峡库区香溪河沉积物厌氧氨氧化菌的时空分布

为了解三峡库区香溪河段沉积物中厌氧氨氧化菌(AnAOB)的时空分布,利用实时荧光定量PCR技术(qPCR)检测香溪河5位点沉积物中AnAOB丰度,并通过Spearman相关性分析探讨理化因子对AnAOB丰度的影响。结果表明,香溪河沉积物中存在AnAOB,丰度介于1.45×10^(4)~3.16×10^(9)g^(-1),不同位点不同时间AnAOB的数量有较大变化。时间上(2016年沉积物0~10 cm),5位点的AnAOB丰度皆在秋季最高,a和e位点显示同样的分布规律,即秋季>冬季>春季>夏季。空间上(0~2 cm),2016年春冬两季AnAOB丰度在e位点最高,夏秋两季在d位点最高。2017年香溪河沉积物AnAOB丰度为b>a>e>c>d,夏季e>c>d>a>b,冬季c>d>e>b>a;d和e位点(0~10 cm)有随着沉积物深度增加,AnAOB丰度先增加后降低的趋势。Spearman相关分析证实,AnAOB丰度与沉积物中总氮(TN)(P<0.01)、硝态氮和有机碳(TOC)(P<0.05)浓度显著相关;双因素方差分析结果证明不同理化因子和不同季节下AnAOB丰度无显著性差异(P<0.05)。

MUCT短程硝化和反硝化除磷系统中Candidatus Accumulibacter的代谢活性和菌群结构

采用实现亚硝酸型硝化的MUCT工艺处理低C/N实际生活污水,在短程硝化的基础上实现反硝化除磷.研究短程硝化建立与破坏过程中,亚硝酸盐积累率的变化对系统除磷性能及CandidatusAccumulibacter菌群结构的影响.结果表明:MUCT除磷以反硝化除磷为主,平均反硝化除磷率高达88%.磷去除率与亚硝酸盐积累率具有很好的正相关性.短程硝化阶段磷的平均去除率比全程硝化阶段高30%以上,证明了亚硝酸盐更适合作为低C/N比污水反硝化除磷的电子受体.以多聚磷酸盐激酶基因(ppk1)作为遗传标记,采用实时荧光定量PCR方法考察不同亚硝酸盐积累率下Accumulibacter的丰度、各主要进化分支的菌群结构和相对丰度.当系统处于全程硝化状态时,存在少量以硝酸盐为电子受体的Acc-I型反硝化聚磷菌,低于总Accumulibacter的5%;当系统进入短程硝化状态后,Acc-I逐渐消失.运行期间以亚硝酸盐作为电子受体进行反硝化除磷的Acc-IID始终是优势聚磷菌,达到总Accumulibacter的92%以上,甚至接近100%,保证了亚硝酸型反硝化除磷的稳定运行,亚硝酸盐浓度是影响其丰度变化的重要因素.

低温胁迫下油棕WRKY转录因子基因的表达特性分析

【目的】研究低温胁迫下WRKY转录因子基因表达特性,并分析其与油棕抗寒性的相关性,为阐明WRKY转录因子在油棕生长和低温响应机制中的功能和作用提供理论参考。【方法】以油棕品种XJS30和SJ64为材料,对其进行低温驯化处理(0 h、1 d和7 d)及冷处理(10℃4 h、8℃4 h、6℃4 h、4℃4 h和2℃4 h),利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测不同处理时间的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因表达特性,并分析其与油棕抗寒性的相关性。【结果】WRKY1和WRKY7基因在低温驯化结束时的表达量较冷处理结束时高,说明其在低温驯化过程中对XJS30的抗寒性构成发挥调控作用。WRKY22、WRKY40和WRKY55基因均在XJS30冷处理中表达量最高,说明其在冷处理过程中对XJS30的抗寒性发挥调控作用。WRKY1基因在低温驯化结束时的表达量较冷处理结束时低,说明其在冷处理过程中对SJ64的抗寒性发挥调控作用。WRKY7基因在低温驯化结束时的相对表达量较冷处理结束时高,说明其在低温驯化过程中对SJ64的抗寒性构成发挥调控作用。【结论】油棕的WRKY1、WRKY7、WRKY22、WRKY40和WRKY55基因均属于低温应激反应型基因。

梨火疫病菌活菌快速定量检测方法的建立

【目的】将叠氮溴化丙啶(PMA)与实时荧光定量PCR技术(qPCR)相结合,建立一种快速检测梨火疫病菌活菌的方法,为病害的检疫和早期诊断,开展病原学、流行规律研究及制定科学防控措施严防病害入侵提供技术支持。【方法】以梨火疫病菌(Erwinia amylovora)质粒pEA29设计特异性引物EaP29F1/EaP29R1,通过优化PMA的质量浓度和曝光时间,确定区分梨火疫病菌死活菌的PMA预处理最优反应条件,再以活菌DNA为模板进行qPCR的特异性扩增。设置不同比例死活菌混合体系,验证PMA-qPCR反应的可靠性。【结果】当梨火疫病菌浓度为1×10^8 CFU·mL^-1、PMA浓度为25μmol·L^-1、曝光时间为10 min时,能完全抑制死菌的扩增,仅以活菌体DNA为靶标进行选择性扩增。当活菌比例为10%~100%时(浓度为6.0×10^7~6.0×10^8 CFU·mL^-1),PMA-qPCR测得的活菌数与理论活菌数值均在同一个数量级,二者存在良好的线性关系(R^2=0.9928)。灵敏度检测结果表明,6.0×10^3~6.0×10^8 CFU·mL^-1范围内,梨火疫病菌活菌数与Ct值线性相关(R^2=0.9947),检测灵敏度下限为6×10^3 CFU·mL^-1(12 CFU/qPCR反应)。用建立的PMAqPCR方法检测人工接种发病的香梨、苹果、杜梨枝条,PMA-qPCR能准确检测其中的活菌,结果与菌落计数结果相符。【结论】本研究建立的PMA-qPCR检测方法能定量检测梨火疫病菌病活菌数量,具有灵敏、准确和高效的优点,避免了常规qPCR检测死菌导致的“假阳性”。

拟穴青蟹ANT2基因的克隆与低温胁迫表达分析

腺苷酸转移酶(ANT)是线粒体中最丰富的蛋白质之一,其主要作用是介导ADP/ATP在细胞质和线粒体基质之间的运输.为探讨该基因在拟穴青蟹(Scylla paramamosain)低温适应中的作用,采用反转录PCR(RT-PCR)、cDNA末端快速扩增技术(RACE)等技术,从拟穴青蟹中获得了ANT2的cDNA全长序列,并运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测了ANT2在不同组织和不同温度下的表达谱.该序列全长1 348bp,开放阅读框(ORF)为930bp,编码309个氨基酸残基.同源分析显示,该蛋白具有3个保守的线粒体跨膜功能结构域,形成能量分子传导转运通道,催化细胞质中ADP和线粒体内ATP的跨膜交换.qPCR结果表明ANT2基因在拟穴青蟹多个组织中均有表达,且表达量不同,表明ANT2基因具有组织表达特异性.第1期仔蟹在10,15,20,25℃不同温度条件下,在1,3,12,24,36h,10和15℃组表达量显著低于20和25℃组(p<0.05);且在1,3,6,12,24h,10℃组的表达量显著低于15℃组表达量(p<0.05).15℃组在48h内,ANT2呈现高低起伏的表达模式.拟穴青蟹第1期仔蟹ANT2基因表达变化,提示该基因与能量代谢功能相关,可能参与拟穴青蟹低温胁迫应答.

SPF级小鼠肺支原体实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了建立及应用SPF级小鼠肺支原体实时荧光定量PCR检测方法,试验根据GenBank中肺支原体16S rRNA基因序列的高度保守区域设计引物,建立了可快速、准确检测肺支原体的实时荧光定量PCR（qPCR）检测方法,并对该方法进行特异性、敏感性、重复性以及疑似支原体感染样本检测,并评论其可行性。结果表明：所建立的qPCR方法具有良好的线性关系,标准曲线的相关系数R^2=0.999;5种相关的细菌检测结果均为阴性,特异性好;其检测灵敏度为10 copies/μL;组间样本的变异系数均小于3%,重复性好;对60份疑似支原体感染的小鼠咽拭子样本检测结果比采用ELISA方法以及常规PCR更灵敏。说明SPF级小鼠肺支原体的qPCR方法较之于ELISA方法及常规PCR具有快速、灵敏性高、特异性强、稳定性好等特点,能更好地进行小鼠肺支原体的快速检测和诊断。

乙型脑炎病毒微滴式数字 PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立微滴式数字PCR(ddPCR)检测方法,用于乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)的核酸检测。方法 设计特异性扩增JEV的引物探针并优化条件建立ddPCR检测方法,检测其他病毒核酸,观察有无交叉反应判断其特异性。用实时荧光定量PCR(qPCR)与ddPCR法分别对梯度稀释后JEV体外转录核酸进行检测以评价方法的敏感性;用不同浓度的病毒核酸进行独立重复实验以评价方法的重复性;用乙型脑炎IgM抗体阳性标本评价临床标本,健康人血清用于阴性验证。结果 本法检测与其他病毒核酸无交叉反应;RT-qPCR和RT-ddPCR方法对JEV的最低检出限分别为10^(0)和10^(-1),对应分别为6.73 copies/μL和0.75 copies/μL;各浓度检测拷贝数变异系数均在2.0%以下,检出率为100.0%;12份乙型脑炎IgM抗体阳性标本中检出7份阳性(58.3%),健康人血清的阴性率为100.0%。结论 本研究建立的RT-ddPCR检测JEV方法有较好的特异性、敏感性、重复性和临床标本适应性,可作为乙型脑炎病原学监测的一种技术手段。

新型填料A/O生物滤池处理低碳氮比农村污水脱氮

针对低碳氮比导致低污染农村污水生物处理时出水总氮(total nitrogen, TN)质量浓度高不能满足排放标准的问题,以普通砾石A/O生物滤池为对照组(1号),采用芦竹和活性炭分别作为缺氧段和好氧段填料的A/O生物滤池(2号)处理人工模拟农村污水并研究其脱氮效果.结果表明,当进水化学需氧量(chemical oxygen demand, COD)、氨氮(ammonia nitrogen, NH+4-N)和TN质量浓度分别为(79.47±14.21)、(34.49±2.08)和(34.73±3.87)mg·L-1时,两套装置对COD、NH+4-N和TN的去除率分别为(88.00±7.00)%和(89.00±10.00)%、(90.00±2.00)%和(97.00±7.00)%、(37±15)%和(68±7)%,表明添加新型填料芦竹和活性炭能显著增强A/O生物滤池对NH+4-N和TN的去除.高通量测序结果显示, 1号装置中参与硝化过程的微生物主要为Proteobacteria(变形菌门), 2号则是变形菌门和Nitrospirae(硝化螺旋菌门)共同作用;1号装置缺氧段中发挥反硝化作用的主要细菌门类包括Chloroflexi(绿弯菌门)、变形菌门、Bacteroidetes(拟杆菌门)和Planctomycetes(浮霉菌门),而2号缺氧段中则主要是拟杆菌门、变形菌门、Firmicutes(厚壁菌门)和Patescibacteria.实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)结果表明, 2号装置中生物膜的硝化功能基因(amoA和Nitrospira 16S rDNA)、反硝化功能基因(narG、nosZ、nirS和nirK)和厌氧氨氧化功能基因(ANAMMOX)丰度均高于1号装置,除narG和nosZ基因外,其余几种都有1~2个数量级的差别.