火鸡源性成分实时聚合酶链式反应检测方法ISO标准研制

选择火鸡染色体Z DNA序列的特异片段作为检测靶序列,建立了实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,该方法种间特异性和种内一致性良好。将靶序列克隆到pUC57质粒中,通过对不同稀释浓度的质粒样品进行real-time PCR测试,该方法绝对检测限为5拷贝/PCR反应。组织国际协同实验对方法进行验证,方法的假阳性率、假阴性率均为0%,绝对检测限为5拷贝/PCR反应。根据对各实验室不同稀释浓度的质粒样品的定性测试结果对方法进行分析,结果表明,实验室间标准偏差为0.30,低于最大允许值1;在检出概率为95%的情况下,方法的绝对检测限为3.2拷贝/PCR反应,低于最大允许值20拷贝/PCR反应。将该方法提交国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO),经过标准不同的制订阶段投票、征求意见,正式上升为ISO标准(ISO/TS20224-8:2022)。

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针,合成基因片段绘制标准曲线,在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后,对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%;基因组DNA检测敏感性为7.11×10^(2)fg/μL;纯培养物水平检测敏感性为1.0×10^(2)CFU/mL;重复性变异系数在0.10%~1.00%之间;标准曲线相关系数r^(2)为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法,该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短,仅为35 min的特点,可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌

目的 建立一种基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测方法。方法 针对选择铜绿假单胞菌gyrB基因设计特异性引物和探针。250mL水样经膜过滤后经过短时培养(36℃、4 h),优化提取菌体DNA流程,预冻干聚合酶链式反应预混液,采用实时荧光聚合酶链式反应进行检测。结果 样品中铜绿假单胞菌量为≥1 CFU/250 mL时,检测结果均呈阳性,整个检测用时6 h左右。该方法检测结果与国家标准方法(GB8538—2022)检测结果一致。结论 该方法特异性强、灵敏度高、用时短,可为预包装饮用水中铜绿假单胞菌监管和生产企业质控提供更为快速、精准的技术手段。

基于榛子过敏原2S albumin基因的实时荧光聚合酶链式反应检测方法开发

目的开发一种基于2Salbumin基因的实时荧光聚合酶链式反应检测方法(real-timefluorescent polymerase chain reaction,qPCR)用于检测食品中的榛子成分。方法从美国国家生物技术信息中心数据库中检索并选取具有高特异性的榛子2S albumin基因序列的DNA片段进行引物探针设计,建立一种新的用于检测微量榛子成分的实时荧光PCR方法,并对建立的方法的特异性、扩增效率、检出限和稳健性进行验证。结果本方法对检测目标呈现出高特异性,与其余12种非目标样品无交叉反应。扩增效率为99.42%,相关系数r2为0.9941,两者均符合实时荧光PCR方法验证指南要求。该方法检出限(limit of detection,LOD)为每个反应5拷贝(2.5copies/μL),可检测出食品中含有的微量榛子成分。使用正交实验设计评估该方法具有很好的稳健性(P=0.07),可转移到其他实验室及常规分析中使用。结论基于2S albumin基因组分的qPCR检测方法可用于识别食品中潜在的榛子成分,对于预防榛子过敏及开发减敏脱敏榛子食品研究具有很好的技术支撑。

基于Cycling探针的实时荧光聚合酶链式反应检测河鲀鱼中掺杂的横纹东方鲀成分

目的开发基于Cycling探针实时荧光聚合酶链式反应(real-time fluorescent polymerase chain reaction,RT-PCR)用于检测河鲀鱼中横纹东方鲀(Takifugu oblongus,T.oblongus)成分。方法基于细胞色素C氧化酶亚型I(cytochrome C oxidase subunit I,COI)基因为靶标设计RT-PCR引物及Cycling探针,开发横纹东方鲀成分检测方法,评价方法的特异性、扩增效率、灵敏度和稳定性。结果横纹东方鲀成分与密切相关的其他8种河鲀鱼、4种其他鱼类物种DNA无交叉反应,具有很好的特异性;方法扩增效率为93.47%;方法重复18次均给出阳性报告的最小稀释点(limitofdetection6,LOD6)为14.64pg/μL(相对应的质量含量为0.1%),95%置信水平条件下检出限为34.41 pg/μL(11.59~119.05 pg/μL,LOD_(95%)),稳定性分析(P=0.152)表明该方法可转移到其他实验室以及在常规分析中使用。结论本研究开发的Cycling探针RT-PCR方法可对河鲀鱼食品中掺杂0.1%的横纹东方鲀成分进行可靠追溯。

实时荧光聚合酶链式反应检验用于乙型肝炎病毒DNA检测的价值分析

目的:探讨实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检验用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA检测中的价值。方法:选取2020年1月—2023年1月清镇市第一人民医院收治的乙型肝炎患者112例为研究对象,均经标准abbot药盒检测确诊,包括HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAg(+)(临床习惯称为“大三阳”)62例、HBsAg(+)、HBcAb(+)、HBeAb(+)(临床习惯称为“小三阳”)50例。患者均接受酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验HBV-DNA。将标准abbot药盒检测结果作为金标准,评价酶联免疫吸附法检验与实时荧光PCR检验的诊断效能。结果:临床最终诊断结果显示“大三阳”62例(阳性)、“小三阳”50例(阴性),酶联免疫吸附法检出阳性50例、阴性62例,实时荧光PCR检验检出阳性58例、阴性54例;实时荧光PCR检验诊断准确度、特异度、灵敏度高于酶联免疫吸附法检验,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:与酶联免疫吸附法检验比较,HBV-DNA检测中采取实时荧光PCR检验,可提高对“大三阳”与“小三阳”的诊断效能。

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猪源性成分

针对猪线粒体细胞色素b基因序列设计特异的引物和探针,建立食品中猪源性成分实时荧光聚合酶链式反应检测方法,并经特异性和敏感性试验验证其可行性。结果表明:该体系可扩增猪肉DNA片段,长度为98bp,其他常见畜、禽肉成分均无法正常扩增。该体系灵敏度低至1pg,且阴性样品扩增后的Ct值限制在35循环以后。对于各模拟肉类样品中掺杂的猪源性成分,其检测限均达1%,经市售加工食品检测验证,表明所建立的猪引物探针体系具有特异性好、灵敏度高、快速、高效等优点,可用于对食品中猪源性成分的掺假鉴别检测。

利用可视基因膜芯片技术与实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析肉制品中动物源性成分

为调查了解肉制品中动物源性成分,以帮助判别掺假情况,应用可视基因膜芯片检测技术对市售的肉松、香肠、肉卷、预制调理肉、肉干及肉脯等23份样品动物源性成分进行筛查分析,同时,针对筛查结果采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法进一步确证。结果表明:可视基因膜芯片检测法与实时荧光定量PCR法检测结果一致,提高了未知样品的筛查效率;在本次随机分析的样品中,动物源性成分检测结果与标签标示不一致的情况占比高达21.7%,肉制品掺假虚标情况不容忽视。

食品中热损伤沙门氏菌选择性增菌及实时荧光聚合酶链式反应检测

为了能够高效检测食品中的亚致死损伤沙门氏菌,首先采用热激胁迫的方法得到亚致死损伤沙门氏菌细胞,进而基于选择性增菌培养液SEL建立一种实时荧光聚合酶链式反应检测技术。结果表明:在SEL中经过20h增菌培养后,无论是否经过修复培养,1～2CFU/5mL SEL的亚致死损伤细胞都能得到完全修复并增菌至109CFU/mL水平;依此建立的实时荧光聚合酶链式反应检测技术的纯菌扩增效率为95.41%,检测限为4CFU/反应体系,在人工污染碎食品样品中的检测限为3CFU/10g碎牛肉,而且与传统培养检测方法的结果相吻合。本方法在24h内即可完成食品中热损伤沙门氏菌的修复、选择性增菌以及实时荧光聚合酶链式反应检测,可应用于食品中沙门氏菌污染状况调查及高效检测。

实时荧光聚合酶链式反应检测食品中香蕉成分

根据香蕉叶绿体rbcL基因序列,选择高度保守区域设计特异性引物和探针,建立食品中香蕉成分检测的实时荧光聚合酶链式反应检测方法。结果显示,该组引物探针对香蕉有很强的特异性,除香蕉外,其余55种对照样品均未检测到荧光信号;该检测方法对食品中香蕉成分的检测灵敏度为0.0001ng/μL香蕉DNA和0.001%(m/m)香蕉粉。该方法能对食品中香蕉成分进行准确、快速的检测,具有特异性好,灵敏度高的优点。

纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应快速检测海产品中副溶血性弧菌

采用副溶血性弧菌单克隆抗体、纳米免疫磁分离技术,结合实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法,建立海产品中副溶血性弧菌纳米免疫磁分离-实时荧光PCR检测方法。副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为103 CFU/mL水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌情况下,该方法检测灵敏度达到140 CFU/mL;通过134株副溶血性弧菌和74株非目标菌的测试,实时荧光PCR技术具有良好的特异性;在食品基质添加实验中,其检测限为2 CFU/25 g样品,增菌时间缩短到8 h。

实时荧光聚合酶链式反应检测转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系

目的:建立实时荧光聚合酶链式反应检测转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系的鉴定方法。方法:以转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2为研究对象,在转基因小麦外源片段与小麦染色体重组的边界序列分别设计引物和探针,以其他多种转基因产品和非转基因小麦为对照进行特异性实验,以B73-6-1样品模拟制备10个含量梯度的添加样品进行灵敏度实验。结果:本研究设计的引物和探针具有很好的品系鉴定特异性,检测灵敏度可达到0.01%(m/m)。结论:该方法特异性好、灵敏度高,可快速、准确地鉴定转基因小麦B73-6-1、B72-8-11b和B102-1-2品系。

实时荧光聚合酶链式反应检测食用大豆油中动物源成分

为了从植物油中检出动物成分,在前人对引物研究结果基础上,自行设计2条动物线粒体16S rRNA基因特异性探针,采用实时荧光聚合酶链式反应检测技术对5份分别掺有猪油、牛油、羊油、鸡油和鱼油的大豆油样本进行检测。结果表明:5份模拟掺假大豆油中的动物线粒体16S rRNA基因片段均可被特异性检出,说明鉴别方法可靠;该法能检测出大豆油中0.05%的动物油脂成分,是一种很敏感的检测方法。

实时荧光聚合酶链式反应技术与国标方法检测致病菌的应用与研究

目的比较实时荧光聚合酶链式反应技术(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)与国标方法在食品致病菌检测中的异同。方法应用RT-PCR法及国标GB 4789系列对采集的60件畜产品、禽产品、水产品和乳及乳制品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌以及副溶血性弧菌同时进行检测。结果除了金黄色葡萄球菌检测结果均为阴性外,其他3种致病菌2种方法都有检出,但RT-PCR方法的阳性率均高于国标方法。对于沙门氏菌,国标方法阳性率为1.67%,RT-PCR方法阳性率3.33%;单核细胞增生李斯特氏菌国标方法阳性率为7.50%,RT-PCR方法阳性率为15.00%;副溶血性弧菌国标方法阳性率为8.33%,RT-PCR方法阳性率为11.67%。结论在本实验条件下,RT-PCR技术的阳性检测结果多于国标GB4789系列,并且结果可完全覆盖国标GB4789。各企业实验室甚至政府主导的食品风险监测项目可根据产品特点,合理应用RT-PCR技术以减少人员工作量,方便产品放行并提高工作效率。

检测乙酰微小杆菌的双重实时荧光定量聚合酶链式反应方法的建立

以鲜切叶菜中的乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)为研究对象,建立定量检测E.acetylicum的双重实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)方法。以前期试验发掘到的微小杆菌(Exiguobacterium sp.)的特异性基因P401_RS0117025和E.acetylicum的特异性基因oxi_50582462为检测靶点,对其设计特异性探针,并对反应体系进行优化,以12株E.acetylicum为阳性对照,以4株微小杆菌属内其他种的菌株以及10株非微小杆菌的腐败菌/致病菌作为阴性对照,对建立的RT-PCR进行特异性检测;通过标准曲线的制备、灵敏度、可重复性来评价该方法的有效性。最后,应用该RT-PCR方法对不同贮藏日期鲜切叶菜中的E.acetylicum进行检测。结果表明:本研究设计的探针特异性良好;检测靶点P401_RS0117025与oxi_50582462的标准曲线的R2值分别为0.994和0.999,且重复性好;该方法的DNA检测限为1.629×10^(-7)ng/μL,纯菌菌落检测限为3.4 CFU/m L,并能对鲜切叶菜中的E.acetylicum进行灵敏检测。此外,还建立了"Ct(阈值)-Nt(菌体浓度)"的数量关系,能对供试样品中的E.acetylicum进行绝对定量。总之,本研究建立了准确、灵敏、高效检测食品中腐败菌E.acetylicum的RT-PCR定量方法,为食品货架期预测提供了理论依据。

实时荧光聚合酶链式反应技术在慢性乙型肝炎患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值

目的探讨实时荧光聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术在慢性乙型肝炎(CHB)患者血清标本HBV DNA定量检测中的应用价值。方法选取2015年4月至2018年6月南阳市第二人民医院收治的109例CHB患者作为研究组,同期81例HBV早期感染者作为对照组。均以FQ-PCR技术检测血清标本HBV DNA水平,同时研究组接受拉米夫定治疗,采用FQ-PCR技术动态监测血清标本HBV DNA变异情况,对比两组入院首次HBV DNA表达水平及研究组治疗前后HBV DNA表达水平和变异率。结果入院首次检测研究组HBV DNA表达水平高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。经单因素方差分析,治疗后3、6、9个月HBV DNA表达水平对比,差异有统计学意义(P<0.05);两两对比,治疗后9、6个月HBV DNA表达水平低于治疗后3个月,治疗后3个月低于治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗后9个月HBV DNA变异率高于治疗后6个月,治疗后6个月高于治疗后3个月、治疗前,差异有统计学意义(P<0.05)。结论实时FQ-PCR技术检测血清标本HBV DNA水平可客观反映HBV感染、复制活性,可为临床诊断、疗效评估提供数据支持。

沙门氏致病菌标准阳性模板的构建及实时荧光定量聚合酶链式反应检测

目的:构建重组质粒作为标准阳性模板,建立食品中沙门氏致病菌实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法。方法:以致病性沙门氏菌inv A基因上特异性片段为目标,设计并合成引物和Taq Man探针,将目标片段连接到PGM-T载体上构建重组质粒,建立实时荧光定量检测体系,并考察方法的灵敏性、特异性、重复性和准确性。结果:构建出致病性沙门氏菌特异性基因片段的重组质粒,能够作为实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法的标准阳性模板,标准曲线方程为Y=-3.151 lg X+42.86(R2=0.999),灵敏度80拷贝反应体系,能特异区分沙门氏菌与类型的细菌,同时,批内和批间的变异系数均小于5%,具有良好的重复性。结论:本方法能够实现对食品中致病性沙门氏菌进行定性定量检测。

实时荧光聚合酶链式反应法检测食品中猫源性成分

根据猫线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化还原酶亚基1(ND1)基因中的保守序列设计猫特异性引物和Taq Man探针,建立食品中猫源性成分的实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。通过实时荧光PCR反复验证,结果表明,引物和Taq Man探针对猫源性成分的特异性良好,检测灵敏度可达1 pg,适用于食品中猫源性成分的快速鉴定。通过对随机抽取的市售肉制品的检测,尚未发现掺有猫源性成分的行为。

多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼5种常见食源性致病菌

目的 建立一种可同时检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella) 5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法 根据5种致病菌特异性基因片段设计并合成引物,优化多重PCR体系条件,并对多重PCR体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品进行检测。结果 建立的多重PCR方法可同时扩增5种目的菌株的特异性条带,且不与非靶标细菌发生交叉反应。敏感性实验结果显示,该方法对无乳链球菌、嗜水气单胞菌、沙门菌、霍乱弧菌、大肠杆菌纯培养物基因组DNA的检出限均为0.4 ng/μL。人工模拟样品检测结果显示,该方法可以快速且准确地检测上述5种食源性致病菌,且检出限可达到2×10^(1)CFU/g。结论 本研究建立了一种可同时检测无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌5种罗非鱼常见食源性致病菌的多重PCR检测方法。该方法的建立为罗非鱼常见食源性致病菌的快速检测提供了重要的技术手段。