实时逆转录聚合酶链反应检测细胞因子表达相对定量方法的建立

目的 建立一种实时逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测细胞因子表达相对定量方法。方法 以肿瘤坏死因子α(TNFα)为待测基因 ,以葡萄糖 3 磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH)为内参照进行检测。当靶基因和内参照基因片段克隆入载体后 ,进行纯化和定量及系列稀释 ,建立标准曲线 ,确定实时RT PCR的扩增效率 ;同时优化反应条件 ,使扩增效率接近 10 0 %。然后 ,检测 14份待检标本的TNFα和GAPDH的循环阈值 (Ct)。结果 该法检测的最低拷贝数为 10 3,线性范围为 10 3 ～ 10 9拷贝 ,批内变异系数 (CV)和批间CV分别为 1%和 8%。采用 2 -ΔΔCt法进行数据分析后 ,处理组TNFα的相对表达量比对照组高 8 6～ 9 8倍 ,平均为 9 2倍。结论 新建立的方法敏感 ,重复性好 ,数据处理简便、可靠 。

实时逆转录荧光定量聚合酶链反应检测外周血GPC3mRNA在原发性肝癌患者中的表达及意义

目的探讨实时逆转录荧光定量聚合酶链反应(RealtimeQRT-PCR)检检测外周血磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 mRNA(GPC3 mRNA)在原发性肝癌(HCC)患者中的表达意义。方法采用Realtime QRT-PCR技术分别检测37例HCC、21例转移性肝癌、22例肝硬化患者和35例体检健康志愿者外周血中GPC3 mRNA的水平。结果 HCC患者外周血GPC3mRNA的阳性率为91.8%(34/37),表达水平为(1.5±0.9)×106copies/ml;转移性肝癌外周血GPC3 mRNA的阳性率为4.7%(1/21),表达水平为5.2×103copies/ml;肝硬化患者GPC3 mRNA的阳性率为4.5%(1/22),表达水平为2.6×103 copies/ml;体检健康志愿者外周血GPC3 mRNA无阳性表达。HCC患者手术前后血液中GPC3 mRNA的阳性率差异无统计学意义(P<0.05),但两者表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Realtime QRT-PCR检测外周血GPC3 mRNA是诊断早期HCC血微转移可行的实验方法。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌中Syndecan-1 mRNA和HPA-1 mRNA的表达及临床意义

背景与目的:侵袭转移是导致结肠癌死亡率增加的主要原因,如何阻断肿瘤的侵袭转移成为目前研究的热点。本研究旨在检测Syndecan-1基因和HPA-1基因在结肠癌组织中的表达水平,探讨二者与结肠癌侵袭转移及预后的关系。方法:用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测49例结肠癌、49例配对的癌旁组织(距癌2cm)和49例配对远离结肠癌的手术切缘正常组织(距癌5cm以上)的Syndecan-1和HPA-1基因的表达水平,分析二者与结肠癌临床病理特征的关系。结果:结肠癌中HPA-1mRNA的表达水平(40.56±11.75)显著高于癌旁组织(18.28±11.33)和正常组织(10.80±10.20)(P均<0.001),癌旁组织明显高于正常组织(P<0.05);正常结肠组织中Syndecan-1mRNA表达水平(61.21±12.96)显著高于癌旁组织(14.35±11.06)和结肠癌组织(10.12±8.58)(P均<0.001),癌旁组织明显高于结肠癌组织(P<0.05)。Syndecan-1mRNA的表达减弱和HPA-1的表达增强与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期显著相关(P均<0.05)。Spearman等级相关分析证明了Syndecan-1mRNA和HPA-1的表达呈明显负相关(r=-0.405,P<0.05)。结论:Syndecan-1mRNA在结肠癌组织中呈低表达,HPA-1mRNA在结肠癌组织中呈高表达,且Syndecan-1mRNA的表达减弱与HPA-1的表达增强可促进结肠癌的侵袭转移。联合检测Syndecan-1mRNA及HPA-1mRNA对于指导结肠癌临床治疗及判断预后有重要价值。

火鸡源性成分实时聚合酶链式反应检测方法ISO标准研制

选择火鸡染色体Z DNA序列的特异片段作为检测靶序列,建立了实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)检测方法,该方法种间特异性和种内一致性良好。将靶序列克隆到pUC57质粒中,通过对不同稀释浓度的质粒样品进行real-time PCR测试,该方法绝对检测限为5拷贝/PCR反应。组织国际协同实验对方法进行验证,方法的假阳性率、假阴性率均为0%,绝对检测限为5拷贝/PCR反应。根据对各实验室不同稀释浓度的质粒样品的定性测试结果对方法进行分析,结果表明,实验室间标准偏差为0.30,低于最大允许值1;在检出概率为95%的情况下,方法的绝对检测限为3.2拷贝/PCR反应,低于最大允许值20拷贝/PCR反应。将该方法提交国际标准化组织(International Organization for Standardization,ISO),经过标准不同的制订阶段投票、征求意见,正式上升为ISO标准(ISO/TS20224-8:2022)。

用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。

实时逆转录-聚合酶链反应绝对定量实验优化的研究

目的 探讨优化实验反应条件 ,使实时逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)绝对定量能获得准确可靠的结果。方法 建立质粒标准品作为外参照 ;以管家基因GAPDH作为内参照 ,并对Mg2 + 、引物与探针比例、Buffer等进行优化。结果 优化条件后 ,RT PCR反应的扩增效率接近了理论最佳值 ,并可使靶基因与管家基因扩增效率保持一致 ,保证了方法的稳定性和可靠性。结论 为了获得可靠、重复性好的实时RT PCR绝对定量结果 ,应对实验方法进行优化。

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

人乳腺癌特异性基因1 mRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应检测试剂盒的建立及应用

目的建立人乳腺癌特异性基因1(BCSG1)mRNA实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)检测试剂盒,并评价其在乳腺癌循环肿瘤细胞检测中的应用价值。方法优化试剂盒中各组分的浓度、确定试剂盒的稳定性、灵敏度及特异性,并检测外周血样品中BCSG1 mRNA的表达水平。结果优化了试剂盒中的引物、探针,成功制备了定值标准品,通过设立阴、阳性质控品的方法,解决了试剂盒的特异性、灵敏性、准确性及质量控制等关键技术问题,特异度及准确性均为95%以上,灵敏度为100拷贝/ml(全血)。外周血标本中BCSG1 mRNA的检测结果为,12例临床确诊已转移的乳腺癌患者均为阳性,21例临床未确诊转移的乳腺癌患者中12例为阳性,其余9例为阴性,15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均为阴性。结论建立的BCSG1 mRNA实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有很高的临床应用价值,可用于检测外周血样品中BCSG1mRNA的表达量,检测结果可作为乳腺癌患者诊疗过程中的重要监测指标。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测结肠癌患者血CK19 mRNA水平及其意义

目的:了解结肠癌患者外周血CK19mRNA的水平,探讨其临床意义。方法:采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应,检测结肠癌患者75例、炎症性肠病(IBD)患者30例、健康志愿者41例外周血CK19mRNA的水平。结果:75例结肠癌患者外周血CK19mRNA的水平为(12600±73100)copies/mL,其中39例阳性,阳性率为52%。健康志愿者未检测到CK19mRNA。CK19mRNA水平与肿瘤病理分期和分化程度相关;CK19mRNA阳性组中CK19蛋白阳性者显著多于CK19mRNA阴性组(P<0.05)。结论:外周血CK19mRNA可作为结肠癌辅助诊断指标,定量检测外周血CK19mRNA有助于结肠癌微转移的监测。

实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白的表达

目的应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测兔火器伤骨折愈合过程中骨形态发生蛋白(BMP)-2mRNA水平。方法建立外固定架固定一期治疗兔股骨火器伤骨折的动物模型和BMP-2 mRNA表达水平的SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR方法,分别于术后第1、2、3、4周取断端组织,通过实时荧光定量RT-PCR检测标本标本中BMP-2 mRNA水平。结果在对照组,创伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在1周开始增高,在第2周达到高峰后下降,第4周即可恢复正常。而实验组,受枪伤的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平在第3周表达最高,与对照组相比,升高较慢,表达量也偏低(P<0.05)。结论BMP-2mRNA SYBR G reenⅠ荧光定量RT-PCR可以很好地反应枪击伤对兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平的影响。枪击伤后的兔骨组织BMP-2 mRNA表达水平与对照组相比升高较慢,表达量也偏低。

实时逆转录聚合酶链式反应检测活的金黄色葡萄球菌

针对基于DNA水平的聚合酶链式反应(DNA-PCR)检测食品中金黄色葡萄球菌时会出现假阳性结果的缺点,建立一种能够区分死、活金黄色葡萄球菌的检测方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因,自设计Taqman探针、引物,采用一步法逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),以femA mRNA为检测对象,发现只有活的金黄色葡萄球菌显阳性,死亡的则呈阴性;纯培养时,重复检测变异系数为0.15,灵敏度为9×102CFU/mL,检出限可达1/3 CFU/3 mL。实验表明,该研究所建立的一步法逆转录聚合酶链式反应检测法,不仅灵敏度高、特异性强,而且能够有效地区分死、活金黄色葡萄球菌。

TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应在强直性脊柱炎IL-2RαmRNA检测的应用价值

目的:利用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)检测强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞白细胞介素-2受体α(IL-2Rα)mRNA的表达水平,并进行疾病的活动性相关分析。方法:用 Primer Express v2.0软件,根据GenBank提供的序列,在人IL-2Rα mRNA的第2和第3外显子之间设计一对引物和一条TaqMan探针。提取总RNA,加入已优化的一步法FQ-RT-PCR反应体系,扩增产物经凝胶电泳后切胶回收,并与pUCm-T载体连接。制备好的重组质粒转化感受态细胞进行克隆。经测序分析确定为特异性片段后,用T7RNA聚合酶转录为cRNA,作为FQ-RT-PCR系列浓度标准品。评价FQ-RT-PCR检测 IL-2Rα mRNA的特异性、线性、精密度和探针稳定性等。定量测定HLA-B27阳性活动组与阴性非活动组强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞IL-2Rα mRNA基因的表达水平,结合血浆可溶性白细胞介素-2受体 (sIL-2R)浓度,探讨与炎症活动的相互关系。结果:成功构建了cRNA标准品。该方法的线性范围为7～107 cells/ml,其批内CV8.4%,批间CV9.6%;扩增产物克隆的双向测序结果经BLAST比较、分析,证实为IL- 2Rα mRNA特异性片段。对各30例HLA-B27阳性与阴性的强直性脊柱炎的测定表明:与正常人对照组结果比较,HLA-B27阳性组与HLA-B27阴性组IL-2Rα mRNA和sIL-2R都有明显增加(P<0.01)。IL-2Rα mRNA对炎症活动评价的灵敏度为96.7%。结论:FQ-RT-PCR具有灵敏、特异、结果重复性好等优点;IL- 2Rα mRNA与sIL-2R比较更能反映强直性脊柱炎患者的免疫状态,可能为免疫药物的疗效评价和药物筛选提供基因表达水平上的信息。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法 ,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,好=8.1,P<0.005。结论 通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3mRNA表达水平

目的采用SYBR Green I实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,建立检测前列腺癌抗原3(DD3)mRNA的标准,定量检测人体不同组织中该基因的表达水平。方法从LNCaP细胞中采用RT- PCR法扩增特异性DD3基因片段,将其与pMD18-T载体连接,转化宿主菌JM109,对质粒标准进行聚合酶链反应(PCR)检测及测序。纯化后检测质粒拷贝浓度,制备梯度浓度标准品。应用LightCycler荧光定量PCR仪对标准品进行检测。取正常人乳腺组织、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢、正常前列腺组织、前列腺增生及前列腺癌组织,定量检测DD3 mRNA表达。结果建立稳定的检测DD3 mRNA的标准,正常人乳腺、膀胱、结肠、尿道、肺、睾丸、精囊、卵巢中无DD3 mRNA表达,在正常前列腺及前列腺增生组织中低表达,两者间差异无显著性 (P>0．05);在前列腺癌中高表达(P<0．05)。结论应用SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR技术检测 DD3 mRNA表达水平简便、可行、经济。DD3基因的表达具有良好的前列腺癌特异性。

用逆转录—聚合酶链反应检测马铃薯卷叶病毒

用逆转录—聚合酶链反应检测马铃薯卷叶病毒张彤，哈斯阿古拉，张鹤龄，刘莉（内蒙古大学生物工程中心，呼和浩特，０１００２１）关键词卷叶病毒，反转录－ＰＣＲ，诊断马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｌｖｉｎｉｓ，ＰＬＲＶ）属黄化病毒组（Ｌｕｔｅｏｖｉ...

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

逆转录聚合酶链反应检测结直肠癌淋巴结微转移的临床意义

背景与目的:结直肠癌淋巴结微转移灶是否有预测预后价值目前尚有争议,本文对结直肠癌患者淋巴结微转移情况进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测,研究微转移对临床分期和预后的影响。方法:用RT-PCR技术检测56例结直肠癌患者肠旁及系膜淋巴结中细胞角质蛋白CK20mRNA,揭示微转移灶的存在,并与常规病理苏木精伊红(HE)染色和免疫组化染色结果进行比较;分析HE染色和RT-PCR检测结果对判定临床病理分期和统计生存率的影响。结果:共检测432个淋巴结,HE染色、免疫组化染色和RT-PCR法淋巴结转移检出率分别为57.2%、62.3%和73.1%。HE染色和免疫组化的检出率无显著性差异(P>0.05),而HE染色和RT-PCR法检测结果有显著性差异(P<0.05)。56例患者中,按HE染色结果确定的PN0、PN1和PN2期,其5年无复发转移生存率分别为80%、60%和50%;通过RT-PCR技术检测,升级后的PN0、PN1和PN2期5年无复发转移生存率分别为100%、61.9%和55.6%,两种方法分析的结果有显著性差异(P<0.05)。结论:HE染色未确切指出淋巴结微转移癌;RT-PCR法检测CK20mRNA可以推断淋巴结微转移癌的存在,从而有助于确定结直肠癌临床分期和预测预后。

逆转录-聚合酶链式反应检测果树RNA病毒

为调查主要果树携带苹果褪绿叶斑病毒 (ACLSV)、苹果茎沟病毒 (ASGV)、苹果茎痘病毒 (ASPV)和李属坏死环斑病毒 (PNRSV)的情况 ,以指示植物为试材 ,优化了四种病毒的逆转录 -聚合酶链式反应 (RT—PCR)检测体系。使用该优化体系检测了苹果树、樱桃树、桃树中携带上述四种病毒的情况。结果 :建立了特异性强、灵敏度高、成本低的RT—PCR检测体系 ;同时又证明主要果树被这几种病毒单独感染和复合感染的程度均较高。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测5种养殖石斑鱼的神经坏死病毒

神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus)是导致多种海水鱼类神经性病害的致病原。发病及死亡的石斑鱼除了表现神经异常症状外,无明显的临床病症,体表及内脏组织也未发现明显病变及寄生虫感染。2003年4～8月,应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从福建南部人工养殖的5种石斑鱼即紫石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)、马拉巴石斑鱼(E.malabaricus)、青石斑鱼(E.awoara)、赤点石斑鱼(E.akaara)和云纹石斑鱼(E.moara)中检出5个神经坏死病毒分离株。检测了76份石斑鱼样品,这些石斑鱼NNV病毒的平均感染率约为90%。对这些病毒的RT-PCR产物421bp核酸进行了测序和序列分析,其相同的序列超过99%。将这些序列与GenBank的石斑鱼(Epinephelusspp.)神经坏死病毒相关基因序列作比较,同源性在97%以上。对神经坏死病毒在石斑鱼体内的分布也进行了分析,在脑和眼组织的检出率最高,部分病鱼的肝、脾和肾组织也能检出病毒。结合流行病学特征,可确认神经坏死病毒为该传染病的主要致病原。RT-PCR方法是检测NNV等病原的一种理想的诊断方法。