白斑综合症病毒实时荧光LAMP检测方法的建立及应用

研究利用ESE-Quant tube scanner检测平台,建立了一套基于环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)的实时荧光检测方法,用于白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的检测;并在此基础上,与巢式PCR、Real-time PCR和其他已发表的4种LAMP方法在检测灵敏度、实际应用方面进行比较。结果显示,研究建立的实时荧光LAMP检测方法在63℃恒温反应30min可检测到最低为105倍稀释的基因组DNA模板,与Real-time PCR检测方法的灵敏度相当,高于巢式PCR和其他已发表的4种LAMP方法的检测灵敏度;而且特异性较好,与传染性皮下及造血组织坏死病毒等5种常见对虾病原DNA均无交叉反应。通过构建质粒进一步进行灵敏度测试显示,本研究建立的实时荧光LAMP检测方法最低检测限度为24个拷贝质粒DNA,检出时间亦为30min。通过对66份待检样品的检测结果显示,实时荧光LAMP检测方法的检出阳性率为7.57%,准确率为100%,高于其他WSSV的检测方法。因此,研究建立的WSSV实时荧光LAMP检测方法,操作简单,反应速度快,特异性好,灵敏度高,成本低廉,可以直观、实时地观察反应的进行情况,适合对虾养殖现场及诊断实验室的WSSV快速检测。

实时荧光LAMP技术快速检测变形杆菌

建立一种快速检测变形杆菌的方法。采用实时荧光LAMP(Real Amp)技术检测变形杆菌,分析Gen Bank中公布的变形杆菌atp D基因序列,针对其6个区域设计4条引物,利用实时荧光监测仪等温(62℃)扩增模板DNA,通过与电脑相连进行实时监测,对该方法检测变形杆菌的特异性、灵敏度、人工污染猪肉检出限等方面进行研究,并将该检测法的灵敏度与普通环介导等温扩增(LAMP)检测法进行比较。结果表明,Real Amp检测方法比普通LAMP检测方法更加方便快捷,20 min内即可判定结果;用于特异性试验的19株试验菌株中,6株变形杆菌呈阳性结果,其他13株非变形杆菌均呈阴性结果;检测纯菌的灵敏度为8.1CFU/m L,是普通LAMP检测方法的10倍;人工污染猪肉的检出限为81CFU/m L。本研究建立的Real Amp检测方法操作简单,耗时短,特异性强、灵敏度高,能够实现对变形杆菌的快速检测。

柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法的建立及应用

以柑橘溃疡病菌特异性高的假定蛋白基因(登录号:AE008923.1)为靶标,设计并筛选4条引物来特异性识别靶标序列中的6个独立区域,建立柑橘溃疡病菌LAMP实时浊度检测方法。该方法利用实时浊度仪检测反应过程中产生的焦磷酸镁白色沉淀,实现对LAMP整个反应过程的实时监控。从镁离子浓度、甜菜碱浓度、d NTPs浓度、引物浓度和反应温度5个变量参数对LAMP检测体系进行优化,并对方法的特异性、灵敏度、稳定性及实际样品检测效果进行评价。结果显示,该体系经优化后稳定性良好,可在66℃恒温条件下,60 min内完成检测;DNA检测下限可达0.02 ng/μL,灵敏度与荧光定量PCR方法相同,比常规PCR方法高1个数量级;能快速、准确地对田间疑似样品进行检测,与荧光定量PCR方法的检出情况一致,没有漏检。结果说明柑橘溃疡病菌实时浊度LAMP检测方法操作简便、所需时间短,特异性与灵敏度高,为柑橘溃疡病菌的快速筛查提供较好的途径。

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒实时荧光LAMP检测方法的建立及应用

笔者研究构建了一种基于ESE-Quant tube scanner设备的新型实时荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)IHHNV检测方法,评价其敏感性、特异性、反应速度和实际检测结果。结果表明,IHHNV实时LAMP检测方法在63℃条件下,30 min内检测到106稀释的基因组DNA,可检测到24个质粒拷贝;与27种包括多种水生动物以及对虾常见病原DNA均无交叉反应。通过对152份实际样品的检测,实时荧光LAMP检测方法的检出阳性率为59.87%,与real-time PCR方法相当,高于其他检测方法。本研究建立的IHHNV实时LAMP检测方法对现场诊断具有较大的应用潜力。

LAMP实时浊度法检测转基因植物NPTⅡ基因

根据转基因植物常用的选择标记基因NPTⅡ(HE582394.1)的序列,设计6条特异性LAMP引物,利用实时浊度仪对反应体系中扩增产物的实时监控筛选出最佳引物,最终建立转基因植物NPTⅡ基因的LAMP检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度、稳定性进行了评价。结果表明,该方法能够特异性检出含有NPTⅡ基因的植物及其加工产品,特异性高,灵敏度达0.5%。对转基因玉米MON863(含NPTⅡ基因)含量为10%、1%、0.5%、0%(W/W)的样品DNA分别进行扩增,其稳定性好,无假阳性和假阴性。所建立的LAMP方法适用于特异性筛选检测含NPTⅡ基因的植物及其加工样品。

斑点叉尾鮰病毒实时荧光LAMP检测方法的建立

斑点叉尾鮰病毒(Channel catfish virus, CCV)属于大DNA病毒,是一种能引起斑点叉尾鮰(Letalurus punetaus)病毒性疾病的重要病原。研究以编码产物为磷酸激酶的CCV ORF77基因为靶标,设计了能识别靶基因上的8个独立区域的6条特异引物,利用基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立了用于CCV的实时荧光LAMP快速检测方法。结果显示,建立的实时荧光LAMP检测方法在63℃恒温反应45min条件下,反应大约12min后出现明显的峰值,最低检测限度为100个拷贝的病毒质粒DNA,检出时间为35min;并且具有良好的特异性,与白斑综合症病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、真鲷虹彩病毒(RSIV)、传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)和新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)等常见水生动物病原DNA均没有交叉反应;同一样品于试验内及试验间重复性试验发现,20个平行样品的扩增曲线基本重合,表现出良好的重复性。通过对实际样品的检测结果显示,实时荧光LAMP检测方法能够特异性的检出CCV。因此,研究建立的CCV实时荧光LAMP检测方法操作简单、检测快速、特异性好、灵敏度高、结果可靠,能为斑点叉尾鮰养殖现场和实验室的斑点叉尾鮰疱疹病毒病病原的快速诊断和实时监测方面提供技术支撑。

实时可视化LAMP快速检测高危亚型HPV病毒方法的建立

目的:建立实时可视化LAMP快速检测高危亚型人乳头瘤病毒的方法。方法:基于HPV病毒基因中的L1区保守序列,构建重组标准质粒。应用钙黄绿素作为可视化荧光染料,通过环介导等温扩增技术手段,检测结果可由肉眼观测和荧光检测信号来判读。结果:应用LAMP技术检测HPV病毒,大部分高危亚型的检测限可达到10^3 copies/μL,其中HPV16,HPV33,HPV59,HPV73亚型灵敏度可达10^1 copies/μL;15种高危亚型样品的检测结果显示不存在交叉反应,表明其特异性良好;针对318例临床样本,LAMP的阳性检出率达到79.56%(253/318),与反向杂交试剂盒检测结果基本持平。结论:本研究针对15种高危亚型HPV病毒,建立高效快捷的实时可视化LAMP检测方法,其临床样本符合率高达91.20%,因而具有广泛的市场推广前景和潜在的临床应用意义。

环介导等温扩增技术的应用及研究进展

环介导等温扩增(LAMP)技术自2000年被发明以来以其快速、灵敏、低耗等特点,引起众多研究者的关注。该技术在人、动物、植物、环境等相关微生物的检测、监控等领域得到了广泛研究与应用,其检测灵敏度普遍高于传统PCR 。但是传统LAMP技术对于产物检测存在耗时、易造成污染等问题,以及在野外或医疗点检测时存在判读不便的弊端。就LAMP技术与其他多种产物检测技术结合后的方法如目视LAMP、实时LAMP、微流控LAMP、横向流LAMP及电化学LAMP进行了总结、举例及讨论。目视LAMP具有费用低、适合多环境下使用的特点;实时LAMP、微流控及电化学LAMP法能够有效提高样品检测的准确度,且可减少检测时间;横向流LAMP具有可操作性强、便于判读等特点。根据目前LAMP技术的研究进展及各技术优劣势的分析,预测 LAMP技术未来发展的方向和重点可能为研发手持便携式检测仪。

3种新城疫病毒核酸扩增检测方法的比较研究

本研究利用3种方法对新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)进行检测,并对这3种检测方法的灵敏度和特异性作出比较。根据新城疫病毒的融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,利用水浴LAMP法、PCR及LAMP实时浊度仪进行检测。通过对恒温水浴中的反应温度、反应时间及反应液中Mg2+浓度进行优化获得最佳反应条件,结果用凝胶电泳分析;用优化的温度进行LAMP实时浊度仪检测,同时都与PCR方法进行比较。结果显示,获得了最佳反应条件,水浴LAMP方法最低检测限是1.58pg,比PCR高100倍,而LAMP实时浊度仪检测灵敏度比水浴LAMP方法高10倍,最低检测限是0.158pg。3种方法对其他非新城疫病毒均无检出。结果表明,新城疫病毒水浴LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强、操作简单等特点,有望在核酸扩增领域取代PCR技术,LAMP浊度仪法检测灵敏度更高,但是所需仪器和试剂比较昂贵。

原料乳中志贺氏菌的实时荧光环介导等温扩增技术研究

为了建立原料乳中志贺氏菌快速检测的有效方法,提高志贺氏菌的检出效率。研究根据Gen Bank中志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因(ipa H),设计特异性LAMP引物,将SYBR GreenⅠ荧光染料结合到LAMP扩增技术中,通过实时荧光监测仪优化Mg^(2+)、d NTPs、温度和引物等反应条件,建立了实时荧光环介导等温扩增技术检测志贺氏菌的反应体系,对纯菌的菌悬液及原料乳人工污染样品中的志贺氏菌进行检测,并对该检测方法的特异性、灵敏度进行了研究,并与普通的LAMP检测方法进行比较。结果表明,该检测方法特异性强灵敏度高,纯菌的菌悬液灵敏度和人工污染样品的检出限都能够达到100 cfu/m L,且灵敏度高于普通的LAMP检测方法。综上所述,研究建立的实时荧光LAMP检测方法灵敏度高、特异性强、耗时短,且检测结果直观易于分析,适用于快速准确监测原料乳中志贺氏菌的污染情况。