实时RT-PCR检测存活于乳中的单核细胞增多性李斯特菌

单增李斯特菌是一种可在低温下生长、能引起人畜共患病的食源性致病菌。为克服传统PCR检测的假阳性问题,有效的检测单增李斯特活菌,本研究提取单增李斯特菌的总RNA并进行反转录,以单增李斯特菌的必要毒力基因hlyA为靶基因,设计特异性引物和TaqMan探针进行实时PCR检测,研究了检测的特异性和灵敏度,考查了对人工污染牛乳进行检测的应用性。结果表明,所用引物和探针能较好的扩增目的基因,而对其他食源性致病菌无交叉反应。单增李斯特菌经1h增菌,可检出3×102CFU/ml。而经3h增菌,活菌检测限可达30CFU/ml。人工污染牛乳样品经6h增菌,检测限为17CFU/ml。此方法可应用于乳中单增李斯特菌的快速检测和污染状况调查。

口蹄疫病毒实时RT-PCR检测方法的建立

目的用TaqMan技术建立了一种实时RT-PCR的方法,用于检测口蹄疫病毒,并优选出最佳检测样品。方法设计合成一套引物和TaqMan探针,通过反应条件的优化,建立实时RT-PCR的方法,以扩增口蹄疫病毒的3D基因,并用该法检测患病仔猪的气管、前肢肌肉、皮肤、舌、颈浅淋巴结、脾脏、喉头、食管、腹股沟淋巴结、肺脏、扁桃体、肝脏、肾脏、胸肌、心脏、鼻黏膜、后肢肌肉、脑、骨髓、软腭和血清等样品。结果(1)该方法检测FMDV下限为0.01TCID50,其敏感性比普通RT-PCR高100倍,并具有较好的特异性和重复性,(2)FMDV感染仔猪血清、淋巴结、扁桃体和肝脏中病毒含量较高是检测口蹄疫病毒很好的样品。结论建立了一种实时RT-PCR检测口蹄疫病毒的方法。

构建cRNA作为标准曲线的实时RT-PCR检测方法

目的 建立一种新的基于LightCyclerTM技术 ,并通过构建cRNA标准曲线来对目的基因进行定量实时RT -PCR的检测方法。方法 以T7RNA聚合酶体外转录合成带有目的片段的cRNA作为标准品 ,并与样本同时进行反转录和PCR扩增 ,用此方法来检测目的基因在结直肠组织中的表达。结果 采用cRNA标准品制作的标准曲线具有较好的线性关系 (r>0 .99) ,而且在每次实验中都能取得较好的扩增效率 ,CEA与GAPDH的扩增效率分别大于 88.7%和 87.4 %。结论 此方法能较为准确的对组织中的目的基因表达进行定量检测。

运用SYBR GreenⅠ荧光实时RT-PCR法检测草莓中甲肝病毒

针对甲肝病毒的vp3/vp1壳蛋白区域设计引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测甲肝病毒的反应体系。此方法的病毒检测下限达到101TCID50,标准曲线为Ct=-3.052lg(TCID50)+34.57,线形范围101～105TCID50,相关系数0.9961。该方法对甲肝病毒检测特异,与轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒无交叉反应。针对甲肝病毒标准品检测的批内试验变异系数(CV)为0.85%～1.71%(n=5)、批间试验CV为0.76%～1.98%(n=3)。运用此方法随机检测45份草莓样品,检测出3份阳性样品。该检测方法灵敏、特异、重复性好,可应用于水果和蔬菜中甲肝病毒的快速检测。

SYBR GreenⅠ实时RT-PCR定量检测前列腺癌患者外周血DD3mRNA

目的建立一种新的方法定量检测前列腺癌(PC)患者外周血DD3 mRNA方法扩增LNCaP细胞株阳性表达的DD3mRNA,并以其扩增产物为外标准,通过优选引物及优化PCR的各项参数,建立了SYBR Green实时RT-PCR定量检测PC患者外周血DD3 mRNA的方法,并以此方法检测了健康男性志愿者、良性前列腺炎(BPH)患者和PC患者外周血DD3 mRNA。结果所建立的SYBR Green实时RT-PCR方法最少可检测到10拷贝的核酸,在每反应108-103copies/ml范围内,CT值与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为-0.992^-1;扩增后仅有的熔解曲线特异峰显示很好的特异性;不同标准点批间变异系数范围为6.1%-13.7%(n=5)。结论基于双链嵌合染料SYBR Green建立的RT-PCR定量检测DD3 mRNA方法具有敏感性高、线性检测范围广、特异性强、重复性较好的特点;PC患者外周血中可检测到DD3 mRNA表达。

流感病毒H1/H3亚型通用双重短探针实时RT-PCR检测技术与标准质控品研究

采用TaqMan方法,在对人、禽、猪以及马流感病毒代表株HA序列多重比对基础上,设计合成动物流感病毒H1亚型和H3亚型的兼并引物和LNA和MGB修饰短探针,经反应条件优化,建立了针对流感病毒H1亚型及H3亚型的双重实时RT-PCR检测方法。应用建立的方法分别对人、禽、猪以及马流感病毒核酸进行检测,结果显示,建立的方法通用性良好,可有效检测和鉴别H1和H3亚型流感病毒,但对其他亚型的流感病毒以及新城疫病毒核酸检测结果为阴性,表明建立的方法特异性强。进一步经体外转录制备了猪流感病毒H1和H3亚型HA完成编码区的核酸标准品cRNA,经稀释、分装、定量、均匀性和稳定性检验后,作为方法的质控品对建立的方法进行评价,结果表明,所建立的双重短探针实时RT-PCR方法灵敏度可达2.0×102拷贝/反应。在对586份临床样品的检测中,进一步证实了该方法快速、灵敏且重复性好,可满足动物流感病毒H1/H3亚型的早期快速检测的需求。

双重荧光实时RT-PCR技术鉴定H9N2亚型禽流感病毒

采用双重荧光实时RT-PCR技术,建立一种简便易行的H9N2亚型禽流感病毒的快速鉴定方法。通过比对GenBank甲型禽流感病毒H9N2亚型的HA和NA基因序列,设计特异性针对HA和NA的引物,分别选用FAM和JOE两种不同荧光标记探针,构建双重实时荧光PCR一步法反应体系,同时检测样本中的HA和NA基因。结果显示:扩增曲线和特异性实验结果显示,该体系具有很好的扩增效率,且仅特异性识别H9N2亚型AIV的HA、NA基因,与相关病毒或其他亚型无交叉反应。采用重组质粒pMD19-T构建HA、NA阳性质粒,10倍梯度稀释液为模板,进行荧光定量PCR。结果证实,本研究所建立的双重荧光定量RT-PCR体系敏感性能达到10个RNA拷贝数。采用本方法检测60份感染动物样品及60份环境样品,与传统PCR方法相比,检测敏感性提高了100倍;与病毒分离鉴定方法比较,二者的鉴定结果完全吻合。该方法具有特异性强、灵敏度高、快速易操作等优点,是H9N2亚型禽流感病毒鉴定的有效方法。

一种新颖简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法的建立

为建立一种新颖、简便的荧光实时RT-PCR相对定量方法,根据实时定量标准曲线,推导出相对定量基因表达的公式.公式显示相对表达指数只与CT值和标准曲线的斜率相关.构建标准曲线的标准品需要通过克隆和体外转录获得,实验过程繁琐.当人为成比例增减标准品各个稀释度的具体拷贝数时,标准曲线的斜率并不改变,说明标准曲线斜率与标准品的具体拷贝数无关.因此,新的相对定量方法可以用任何一个待测样品的总RNA(或cDNA),经系列稀释后作为标准品,来构建相对定量标准曲线,获得斜率.与绝对定量法比较,新方法获得了基本相同的斜率和非常一致的定量结果(差异小于4%),而传统的2-#$CT法却表现出较大的定量误差.这些结果表明,新的相对定量方法是一种简便、准确和高效的定量基因表达的方法.

一步法实时RT-PCR快速检测手足口病肠道病毒

目的探讨实时荧光RT-PCR在手足口病(HFMD)肠道病毒快速检测中的应用价值。方法以实时荧光RT-PCR检测64例临床初诊为HFMD患儿标本中总肠道病毒(EV)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)和肠道病毒71型(EV71),用RD细胞、Vero细胞和Hep-2细胞进行病毒分离培养,以免疫荧光法鉴别分离培养的EV71。结果64例标本中,EV(+)/EV71(+)为23.4%(15/64)、EV(+)/CA16(+)为48.4%(31/64)、EV(+)/EV71(-)/CA16(-)为10.9%(7/64)、EV(-)/EV71(-)/CA16(-)为17.2%(11/64)。实时荧光RT-PCR检测为EV71且病毒分离培养出现细胞病变效应的培养细胞经抗EV71单克隆抗体免疫荧光检测均为阳性,未发生细胞病变效应或非EV71的培养细胞均为阴性。结论实时荧光RT-PCR检测HFMD病原具有特异和快速等优点,与病毒分离培养具有较高的一致性,可用于手足口病的早期诊断和鉴别诊断。

实时RT-PCR定量检测前列腺癌患者外周血DD3 mRNA及其临床意义

目的探讨前列腺癌（PCA）患者外周血DD3mRNA的检测方法及其临床意义。方法建立SYBRGreenⅠ实时RT-PCR定量检测DD3mRNA,分别检测39例不同分期PCA患者（PCA组）、32例前列腺良性增生（BPH组）患者和26名健康男性（健康组）外周血中DD3mRNA含量,并进行对比分析。结果建立的SYBR Green实时RT-PCR方法最少可检测到10拷贝的核酸,在原始模板101-107拷贝范围内,CT值与起始模板浓度具有良好的线性关系;扩增后仅有的溶解曲线峰显示很好的特异性;批间变异系数范围为6.0%～14.8%。健康组DD3mRNA均为阴性,27例BPH组患者中4例结果检测在101数量级,而39例PCA组中26例阳性。PCA组未治疗患者和去势治疗患者DD3mRNA阳性率及定量值比较差异均有统计学意义（P〈0.01）,PCA组无骨转移患者和骨转移患者阳性率和定量值比较差异也均有统计学意义（P〈0.05）。结论基于双链嵌合染料SYBRGreen建立的RT-PCR定量检测DD3mRNA方法具有敏感性高、线性检测范围广、特异性强及重复性较好的特点。外周血DD3mRNA的丰度与前列腺癌的发生、发展及转归都有密切关系。

鸽微RNA病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立鸽微RNA病毒(pigeon megrivirus,PiMeV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。本研究根据GenBank中PiMeVs序列特征设计特异性检测引物,从信鸽粪便中检测到PiMeV阳性(命名为PiMeV-CHN001株),并对其3 C基因进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析,明确其基因特征后,设计特异性实时荧光定量RT-PCR检测(RT-qPCR)引物组,建立检测PiMeV的RT-qPCR方法。结果显示:PiMeV-CHN001株3 C基因全长为591 bp,编码197个氨基酸,和其他2株野鸽源PiMeV(MeV-B1株和MeV-B2株)核苷酸相似性分别为89.5%和92.0%。建立的检测PiMeV的RT-qPCR方法的标准曲线Y轴截距为37.93,斜率为-3.335,相关系数为1.00,扩增效率为99.4%。特异性强,仅PiMeV出现特异性扩增信号和特异性峰值[Tm值为(81.69±0.22)℃],对鸽源禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸽源禽I型副黏病毒(pigeon paramyxovirus type I,PPMV-1)、鸽输血传播病毒(pigeon torque teno virus,PTTV)、鸽腺病毒(pigeon adenovirus,PiAd)及鸽圆环病毒(pigeon circovirus,PiCV)检测均未见特异性扩增信号;敏感性优,最低检测限为54.0拷贝·μL^(-1);重复性好,批内和批间变异系数均低于1.5%。用建立的检测方法对42份信鸽粪便样品进行检测,发现2份阳性样品(阳性率为4.76%)。本研究首次证实我国大陆地区信鸽中存在PiMeV,丰富了PiMeV宿主谱信息;建立的RT-qPCR方法为后续开展PiMeV流行病学研究提供支撑。

帕利亚姆病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

本研究拟建立帕利亚姆病毒(Palyam virus,PALV)血清型特异性实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)方法用于临床样本或媒介中PALV血清型鉴定。根据我国流行PALV毒株的基因节段2序列,设计扩增引物和TaqMan探针,建立PALV血清型特异型qRT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏性与重复性进行评估;以我国分离的28株PALV和90份核酸阳性血液样本评估检测方法的可靠性;利用建立的方法对采集库蠓样本中携带的PALV进行血清型鉴定。结果显示,建立的PALV血清型qRT-PCR检测方法具有良好的特异性与灵敏性,可检出核酸拷贝数下限在22至28 copies·μL^(-1)。对28株PALV的qRT-PCR检测结果与病毒测序鉴定结果一致;对PALV不同感染阶段哨兵动物血液(90份)中的qRT-PCR鉴定结果与分离病毒的血清型鉴定结果一致;建立的方法可准确鉴定库蠓中携带PALV的血清型。本研究建立的PALV血清型qRT-PCR定型方法具有良好的特异强、敏感性与重复性,可用于PALV感染动物与媒介中PALV血清型的鉴定,具有良好的应用价值。

鸽A群轮状病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

鸽A群轮状病毒(group A rotavirus,RVA)是影响养鸽业健康发展的主要病原之一。为实现鸽RVA的高通量快速检测,根据目前国内外流行的鸽RVA VP6基因保守区域设计特异性引物与探针,建立了一种可以特异性检测鸽RVA的实时荧光RT-PCR方法,并对该方法的灵敏度、特异性和重复性进行了评估。结果显示,该方法灵敏度高,最低检测限为7.22×10^(2)copies/μL;特异性强,与鸽群其他常见病毒无交叉反应;重复性好,组内与组间重复变异系数均小于1.5%。利用该方法和普通RT-PCR方法对200份临床样品进行检测,发现荧光RT-PCR方法的病毒阳性检出率高于普通RT-PCR方法,二者符合率为94.00%。结果表明,本研究建立的实时荧光RT-PCR方法敏感、特异、准确,重复性好,可为开展鸽RVA的临床检测及流行病学调查提供技术支持。

BVDV-1型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示:建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。

柑桔衰退病毒RB和VT基因型实时定量PCR检测方法建立和应用

为定量检测样品中柑桔衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)RB和VT基因型含量,以RB基因型的p33基因、VT基因型的ORF1a基因为靶标,建立了RB和VT基因型的特异性实时定量PCR方法。该方法检测RB和VT基因型质粒浓度下限均为2×10^(1) copies/μL,灵敏度为普通PCR的1000倍;对RB和VT基因型进行检测,质粒拷贝数对数(x)与Ct值(y)的标准曲线方程分别为y=-3.3255 x+37.8453和y=-3.2737 x+36.2839,R^(2)分别为0.9991和0.9954,扩增效率分别为99.85%和102.05%;方法的重复性良好,组内和组间Ct值变异系数均小于2.07%。对田间样品检测发现,不同样品之间RB基因型含量差异和VT基因型含量差异均较大。该方法特异性强,灵敏度高,适用于田间样品检测。

术中实时RT-PCR检测胃癌患者腹腔冲洗液癌胚抗原mRNA的初步研究

目的探讨术中实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)定量检测胃癌腹腔冲洗液癌胚抗原信使核糖核酸(CEAmRNA)诊断腹腔游离癌细胞的可行性、可靠性及其临床意义。方法采用实时RT-PCR技术检测98例胃癌患者手术前后腹腔冲洗液CEAmRNA水平,并与常规RT-PCR、细胞学检查结果进行比较分析。结果全组腹腔冲洗液细胞学检查(PLC)阳性率为38.8%(38/98),常规RT-PCRCEAmRNA检测阳性率为52.0%(51/98),两者差异有显著性意义(P<0.01)。腹腔冲洗液CEAmRNA浓度术前为犤172.11±63.07(范围0～5.623×106)犦拷贝(copies)/ml,术后为犤606.32±76.21(范围2.564×102～4.677×107)犦copies/ml,术后显著高于术前(P<0.01)。肿瘤侵犯浆膜,病期Ⅲ、Ⅳ期,细胞学检查及RT-PCRCEAmRNA阳性者腹腔冲洗液CEAmRNA水平显著升高(均P<0.01),而淋巴结转移与否及肿瘤细胞分化程度不同组之间的腹腔冲洗液CEAmRNA水平比较,差异无显著性意义(均P>0.05)。PLC(-)PCR(-)组、PLC(-)PCR(+)组和PLC(+)PCR(+)组3组间腹腔冲洗液CEAmRNA浓度比较,差异有显著性意义(均P<0.05)。本研究将判断腹腔游离癌细胞的CEAmRNA界值初步定为21.73copies/ml。结论实时RT-PCR定量检测胃癌患者腹腔冲洗液CEAmRNA,是诊断腹腔游离癌细胞快速、敏感、可行的方法。

实时定量RT-PCR检测马动脉炎病毒

选取马动脉炎病毒 (EAV )基因组中高度保守的开放阅读框 7(ORF7)序列 ,设计了特异性引物和 Taq Man探针 ,利用一步法的实时定量 RT- PCR来定量检测 EAV。使用含有选定检测序列的克隆标准品做标准曲线 ,证明该方法可以检测出含有 5 (4.77)个 RNA分子 ,即可从组织培养液 (TCF)中检出一般含有 5 PFU/μL 病毒拷贝。对猪生殖呼吸道综合征病毒、马疱疹病毒无交叉反应 ,特异性好。用疫苗用种毒 (Bucyrus标准株 )肌肉注射于马驹后 ,定量 RT- PCR比病毒分离试验更能灵敏地检出呼吸道排出的病毒。对 4 5 6份临床鼻腔分泌物样品检测 ,定量 RT- PCR检出 6份阳性 ,而病毒分离只检出 2份阳性。一步法实时定量 RT- PCR检测样品中的 EAV,在快捷、准确、方便和高通量方面优于细胞培养病毒分离的检测方法 ,可以作为检测马病毒性动脉炎 (EVA )

实时RT-PCR检测西尼罗病毒

目的建立西尼罗病毒快速、敏感和特异的实时RTPCR法,用于西尼罗病毒疾病的早期诊断。方法对Vero细胞增殖的西尼罗病毒分别进行常规RTPCR和实时RTPCR法扩增,以PFU/ml为参考标准,比较二者的敏感性和特异性。并用实时RTPCR法检测西尼罗病毒感染的小鼠组织标本。结果采用所建立的实时RTPCR法和常规RTPCR法可分别检测到0.02PFU/ml和2PFU/ml的西尼罗病毒RNA,前者的敏感性比后者高100倍。而对其他黄病毒科成员的检测均为阴性,表明该方法是特异的。采用这种实时RTPCR法可从西尼罗病毒感染小鼠的血液、脾脏、肾脏和脑组织标本中检测出病毒核酸,且在感染后第2天最先自血液和脾脏中检测到病毒,在感染后1周的脑组织中的病毒滴度最高。结论本研究建立的实时RTPCR法具有很高的敏感性和特异性,因此该方法可用于西尼罗病毒疾病的早期监测和流行病学研究。