白藜芦醇对实验性自身免疫性心肌炎大鼠心肌巨噬细胞极化及心肌炎性损伤的影响

目的:探讨白藜芦醇(Res)对实验性自身免疫性心肌炎(EAM)大鼠心肌巨噬细胞极化及炎性损伤的影响。方法:建立EAM大鼠模型,分为对照组、EAM组、Resveratrol组,通过免疫荧光、HE染色观察心肌组织巨噬细胞浸润程度并对心肌病理损伤进行评分;采用Realtime PCR检测巨噬细胞极化标记分子诱生型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶1(Arg1)及炎症因子白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达变化,Western blot检测NLRP3炎性小体蛋白组分的表达变化。结果:EAM组大鼠心肌组织可见大量巨噬细胞浸润,伴有明显的心肌纤维断裂、溶解;IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA表达均较Control组显著增加(分别为P<0.05,P<0.05,P<0.01,P<0.01),而Arg1表达较Control组显著减少(P<0.05);Resveratrol可减少EAM大鼠心肌组织巨噬细胞浸润数量及心肌病理损伤积分(均P<0.05),减少IL-6、IL-1β、TNF-α、iNOS mRNA的表达(均P<0.05),增加Arg1的表达(P<0.01)。同时,与Control组比较,EAM大鼠心肌组织NLRP3和Caspase-p10、pro-Caspase-1及IL-1β蛋白表达明显升高(均P<0.05),Resveratrol可显著减少人NOD样受体家组蛋白3(NLRP3)、Caspase-p10、pro-Caspase-1及IL-1β蛋白表达,差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论:巨噬细胞浸润并向M1型极化参与EAM大鼠心肌炎性损伤;Res可能通过抑制M1型巨噬细胞向M2型极化、NLRP3炎症小体激活及相关炎性因子释放减轻EAM心肌损伤。

实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠发病中Tim-3的表达及其作用

目的探讨T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)发病中的表达和作用。方法选取4~5周龄雄性C57BL/6J小鼠共12只;采用随机数字表法将12只小鼠分为对照组(3只)和实验组(9只)。对照组(造模时间节点为造模后0 d)不做任何处理,实验组小鼠诱导建立EAU模型(按造模时间节点分为造模后7 d、14 d、21 d三个小组,每组3只小鼠)。将光感受器间维生素A类结合蛋白651-670和完全弗氏佐剂充分混合乳化后,在实验组小鼠的双侧大腿、尾根部及颈后部皮下注射配制好的免疫乳剂(每只注射200μL免疫乳剂,含500μg光感受器间维生素A类结合蛋白651-670),随后实验组每只小鼠腹腔注射1μg百日咳毒素。通过裂隙灯显微镜观察各组小鼠眼前节及眼底表现并采集图像。根据炎症程度采用Caspi分级标准对小鼠行临床评分及组织病理学评分。ELISA法检测小鼠血清中IFN-γ、IL-17的表达;实时荧光定量PCR法检测小鼠脾脏及眼球组织中Tim-3 mRNA的表达;Western blot法检测Tim-3蛋白的表达;免疫组织化学法检测脾脏组织Tim-3蛋白的表达。采用Graphpad Prism 9.0统计软件进行数据分析。结果造模后小鼠的眼前节临床评分、眼底临床评分、组织病理学评分均随造模后时间的延长呈升高趋势,各组间的评分差异均有统计学意义(均为P<0.05)。造模后小鼠血清中IFN-γ、IL-17的表达量均随造模后时间的延长呈升高趋势,且各组间的差异均有统计学意义(均为P<0.05)。造模后小鼠脾脏与眼球组织中Tim-3 mRNA的相对表达量均随造模后时间的延长呈下降趋势,且各组间的差异均有统计学意义(均为P<0.05)。小鼠眼球和脾脏组织中Tim-3蛋白的表达情况和mRNA相同。结论Tim-3在EAU发病进程中的表达随着炎症的加重呈下调趋势,Tim-3在葡萄膜炎发病进程中可能发挥着负性免疫调控作用。

黄芪甲苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠T细胞免疫调节的影响

背景:多发性硬化初始阶段,中枢免疫细胞激活并释放大量炎症因子,引起白质脱髓鞘甚至累及灰质神经元。CD4^(+)T细胞不同亚群之间的分化平衡在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的病程进展中发挥着重要作用。课题组前期研究结果表明黄芪内有效成分黄芪甲苷能够调节EAE小鼠体内免疫反应,其是否对T细胞亚群分化具有调节作用尚未明确。目的:探究黄芪甲苷对EAE小鼠治疗效果及其对T细胞的免疫调控机制。方法:将C57BL/6雌性小鼠分为正常对照组、EAE疾病模型组和黄芪甲苷治疗组,每组8只,后2组使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)制备EAE模型,免疫后第10-28天,黄芪甲苷治疗组以40 mg/(kg·d)灌胃给药。免疫当天至第28天,记录各组小鼠的体质量及临床评分;免疫后第28天取小鼠脊髓制成冰冻切片行苏木精-伊红染色、固蓝染色观察脊髓病理改变,流式细胞术检测脾脏T细胞亚群百分比,Western blot法检测脊髓组织中γ干扰素、白细胞介素17、白细胞介素6的蛋白表达,ELISA检测脾细胞上清液中γ干扰素、白细胞介素17、白细胞介素6、白细胞介素4水平。结果与结论:(1)与EAE疾病模型组相比,黄芪甲苷治疗能够减少EAE小鼠体质量丢失(P<0.05),缓解临床症状(P<0.05),减轻脊髓炎症细胞浸润及髓鞘脱失病理改变(分别为P<0.01和P<0.05);(2)与EAE疾病模型组相比,黄芪甲苷治疗可抑制表达γ干扰素和白细胞介素17的CD4^(+)T细胞亚群比例(分别为P<0.001和P<0.001),上调表达白细胞介素10和转化生长因子β的CD4^(+)T细胞亚群百分比(分别为P<0.001和P<0.01);(3)黄芪甲苷可下调脊髓和脾脏中γ干扰素(分别为P<0.05和P<0.01)、白细胞介素17(分别为P<0.05和P<0.05)、白细胞介素6(分别为P<0.05和P<0.05)的表达,上调脾脏中抑炎因子白细胞介素4的表达(P<0.01);(4)结果说明,黄芪甲苷可以减轻EAE小鼠的临床症状,其机制与调节脾脏免疫细胞亚群进而抑制炎症细胞向中枢浸润、减少髓鞘脱失有关。

基于氧化应激及肠道菌群探讨逍遥补肾方对实验性自身免疫性甲状腺炎模型大鼠作用机制的影响

目的通过观察逍遥补肾方对实验性自身免疫性甲状腺炎模型(experimental autoimmune thyroiditis,EAT)大鼠氧化应激及肠道菌群的影响,探讨逍遥补肾方的疗效机制。方法将65只大鼠随机分为正常组10只,造模组55只。造模组采用高碘水喂养联合甲状腺球蛋白皮下注射复刻EAT大鼠模型,造模成功的EAT大鼠随机分为模型组、硒酵母组及逍遥补肾组,每组17只。硒酵母组予25.2 mg/(kg·d)硒酵母片水溶液,逍遥补肾组予11.79 g/(kg·d)逍遥补肾方溶液,正常组、模型组灌胃给予等体积的蒸馏水。连续灌胃8周后,采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测各组大鼠血清游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine3,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine,FT4)、促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)、甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody,TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(thyroid peroxidase antibody,TPOAb)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)水平,采用免疫荧光检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。收集各组大鼠的粪便进行16S rDNA高通量测序,分析肠道菌群多样性和物种丰度的变化,通过相关性分析筛选逍遥补肾方改善EAT大鼠的相关菌群。结果与正常组相比,模型组大鼠血清TSH、SOD、SOD/MDA、GPx明显下降,TPOAb、TGAb、MDA水平明显升高,ROS的免疫荧光强度明显增强(P<0.01)。给予治疗药物后,逍遥补肾组及硒酵母组的上述指标均较模型组有一定改善(P<0.01或P<0.05)。16S rDNA测序结果显示,逍遥补肾方能够调节厚壁菌门、拟杆菌门等相对丰度调节EAT大鼠的肠道菌群紊乱。脱硫弧菌属及粪球菌属是逍遥补肾组的优势菌群。结论逍遥补肾方能够调节EAT大鼠血清TSH及甲状腺双抗体水平,改善氧化应激状态,其作用机制可能与调节多种肠道菌群失调有关。

雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响

目的探讨雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响。方法取健康6~8周龄B10.RIII小鼠36只,随机分为正常对照组、EAU溶剂对照组、雷公藤红素干预组,每组12只。将光感受器间维生素A类结合蛋白161-180和完全弗氏佐剂充分乳化混合后,注射于EAU溶剂对照组和雷公藤红素干预组小鼠双侧大腿和尾部皮下,总体积200μL,每只小鼠注射光感受器间维生素A类结合蛋白161-180的量为50μg。免疫后第7-14天,雷公藤红素干预组小鼠每天接受0.5 mg·kg^(-1)雷公藤红素腹腔注射治疗,EAU溶剂对照组小鼠注射同等剂量的无菌PBS缓冲溶液。免疫后第14天,通过裂隙灯显微镜观察各组小鼠眼前节表现及行组织切片HE染色,并参照Caspi分级标准对各组小鼠进行临床评分及组织病理学评分;免疫荧光染色观察小鼠眼内小胶质细胞活化情况;Western blot检测小鼠视网膜中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg1)蛋白表达水平;qRT-PCR检测小鼠视网膜中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6 mRNA相对表达量。采用Graphpad Prism 9.0统计软件进行数据分析。结果免疫后第14天,通过裂隙灯显微镜观察发现,EAU溶剂对照组小鼠眼前节可见虹膜血管扩张充血明显、角膜水肿、前房渗出;而雷公藤红素干预组小鼠眼前节炎症明显减轻,可见虹膜血管轻度充血。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠临床评分均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。雷公藤红素干预组小鼠临床评分低于EAU溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果显示,免疫后第14天,EAU溶剂对照组小鼠出现严重的视网膜皱褶和脱离,炎症细胞弥漫浸润;而雷公藤红素干预组小鼠视网膜结构破坏轻微,可见少量炎症细胞浸润。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分低于EAU溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、EAU溶剂对照组、雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞密度分别为(1.00±0.12)%、(36.07±4.57)%、(1.83±0.36)%,与正常对照组相比,EAU溶剂对照组及雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞数增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组小鼠视网膜中iNOS、Arg1蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠视网膜中iNOS蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论雷公藤红素可抑制M1型小胶质细胞活化,减少EAU小鼠视网膜炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生,减轻炎症反应。

IgG受体FcγRⅡB调节实验性自身免疫性脑脊髓炎致神经元损伤及Th17/Treg免疫平衡的作用研究

目的:探究IgG受体FcγRⅡB对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型小鼠神经元损伤与Th17/Treg失衡的作用。方法:C57BL/6小鼠随机分组为对照组、EAE组、FcγRⅡB组、EAE+FcγRⅡB组,每组15只,皮下注射MOG35-55肽诱导EAE模型,并给予FcγRⅡB慢病毒液处理;造模后每日称量小鼠体质量,进行神经功能评分,持续30 d;30 d后处死小鼠,HE染色观察脑组织病理形态学变化,LFB染色评估脊髓髓鞘结构变化,免疫荧光染色检测脊髓大脑皮质神经元核抗原(NeuN)和Caspase-3表达,TUNEL染色检测神经元细胞凋亡,ELISA检测血清IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β水平,流式细胞术分析脾脏Th17、Treg细胞比例分布,Western blot测定脊髓组织维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)与Forkhead家族转录因子3(Foxp3)蛋白表达。结果:与对照组比较,EAE组小鼠体质量下降,神经功能评分升高,脑组织内炎症细胞浸润明显,脊髓中出现脱髓鞘迹象,NeuN荧光表达强度减弱而Caspase-3荧光表达强度增强,TUNEL阳性着色细胞多,细胞凋亡数增加,血清中IL-6和IL-17水平升高,IL-10和TGF-β水平降低,脾脏内Th17细胞比例升高,Treg比例降低,脊髓组织内RORγt蛋白表达上调,Foxp3蛋白表达下调(P<0.05);与EAE组比较,EAE+FcγRⅡB组小鼠体质量增加,神经功能评分降低,脑组织内炎症细胞浸润减轻,脊髓脱髓鞘现象得到改善,NeuN荧光表达强度增强,Caspase-3荧光表达强度减弱,TUNEL阳性着色细胞较少,细胞凋亡数减少,血清中IL-6和IL-17水平降低,而IL-10和TGF-β水平升高,同时脾脏内Th17细胞比例降低,Treg比例升高,脊髓组织内RORγt蛋白表达下调而Foxp3蛋白表达上调(P<0.05)。结论:FcγRⅡB对EAE小鼠具有神经保护作用,可减轻其脑组织炎症细胞浸润及脱髓鞘现象,作用机制可能与调节细胞因子水平及Th17/Treg细胞免疫平衡有关。

lncRNA 5033413D16Rik对实验性自身免疫性葡萄膜炎Th17细胞活性的抑制作用

目的探讨长链非编码RNA 5033413D16Rik(lncRNA 5033413D16Rik)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)中光感受器间维生素A类结合蛋白1-20(IRBP_(1-20))特异性辅助性T17(Th17)细胞活性的影响。方法选取SPF级8~10周龄C57BL/6雌性小鼠12只,采用随机数字表法分为EAU组和正常对照组,每组各6只。正常对照组小鼠不接受任何处理,将IRBP_(1-20)和完全弗氏佐剂充分乳化后主动免疫EAU组小鼠。免疫后13 d,行眼底检查并进行炎症评分,苏木精-伊红染色观察视网膜组织病理学改变;分离EAU小鼠脾脏及淋巴结中T细胞,实时荧光定量PCR检测lncRNA 5033413D16Rik相对表达量。将分离培养的T细胞分为短发夹RNA(shRNA)-5033413D16Rik转染组和shRNA-阴性对照(NC)转染组,分别转染相应shRNA,实时荧光定量PCR验证shRNA-5033413D16Ri的敲低效率。将2个组细胞分别与骨髓源性树突状细胞在Th17极化条件下共培养,实时荧光定量PCR检测2个组共培养细胞中转录因子维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、白细胞介素17(IL-17)、IL-23受体(IL-23R)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)mRNA相对表达量;ELISA试剂盒检测2个组共培养细胞上清中IL-17质量浓度;流式细胞仪检测2个组共培养细胞中Th17细胞百分比。结果成功建立小鼠EAU模型。实时荧光定量PCR检测结果显示,与正常对照组相比,EAU组小鼠T细胞中lncRNA 5033413D16Rik相对表达量显著降低,差异有统计学意义(t=-13.332,P<0.001)。与shRNA-NC转染组相比,shRNA-5033413D16Rik转染组T细胞中lncRNA 5033413D16Rik相对表达量显著降低,差异有统计学意义(t=-6.338,P<0.01)。shRNA-5033413D16Rik转染组共培养细胞中RORγt、IL-17、IL-23R和GM-CSF mRNA相对表达量分别为1.61±0.13、1.51±0.13、1.85±0.33和1.45±0.11,明显高于shRNA-NC转染组的1.00±0.01、1.00±0.01、1.00±0.01和1.00±0.01,差异均有统计学意义(t=-6.839、-8.221、-4.538、-4.189,均P<0.05);ELISA检测结果显示,shRNA-5033413D16Rik转染组共培养细胞上清中IL-17质量浓度为(2350.39±367.02)pg/ml,明显高于shRNA-NC转染组的(1513.31±310.37)pg/ml,差异有统计学意义(t=-3.016,P=0.039);流式细胞仪检测结果显示,shRNA-5033413D16Rik转染组共培养细胞中Th17细胞比例为(17.20±0.44)%,明显高于shRNA-NC转染组的(14.10±0.84)%,差异有统计学意义(t=-3.264,P=0.031)。结论lncRNA 5033413D16Rik可以抑制抗原特异性Th17细胞致病性相关基因的表达,负向调控IRBP_(1-20)特异性Th17细胞反应。

中国被毛孢治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用机制

目的探讨中国被毛孢治疗小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的作用机制。方法用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠诱导EAE模型,分为正常对照组、模型对照组、中国被毛孢菌粉组和地塞米松组,观察中国被毛孢菌丝体对EAE小鼠的细胞因子、HPA轴内分泌等指标的影响。结果模型组和地塞米松组脊髓切片的脱髓鞘评分、ACTH和CRH水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。地塞米松组、模型组FOXP3、IL-10和TGF-β水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论中国被毛孢菌丝体通过干预HPA轴对EAE小鼠起到治疗作用,中国被毛孢具有治疗多发性硬化症的潜力。

衣康酸二甲酯对树突状细胞分泌促炎因子以及实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠辅助性T细胞17的影响

目的探究衣康酸二甲酯(DMI)对树突状细胞(DCs)分泌促炎因子的作用,并初步研究其对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠光感受器间维生素A类结合蛋白1-20(IRBP_(1-20))特异性辅助性T细胞17(Th17)的影响。方法分离C57BL/6J小鼠双侧股骨和胫骨得到骨髓细胞,利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4将其定向诱导分化为骨髓来源的DCs。诱导分化6 d,将细胞分为DMI组和PBS组,分别用250μmol·L^(-1)DMI及等量的磷酸盐缓冲液(PBS)预处理3 h后,每组加入100μg·L^(-1)脂多糖(LPS)刺激24 h。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测两组DCs中促炎因子IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA相对表达量。采用IRBP_(1-20)、弗氏不完全佐剂及结核分枝杆菌H37RA主动免疫小鼠构建EAU模型,免疫后13 d,将分离的EAU小鼠脾脏及淋巴结T细胞与PBS或DMI处理的DCs在含有IRBP_(1-20)的培养基中共培养,并向Th17方向极化。流式细胞仪检测共培养细胞中Th17细胞比例。ELISA检测共培养上清液中IL-17水平。qRT-PCR检测共培养细胞中维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、IL-17、IL-23R和GM-CSF mRNA相对表达量。结果qRT-PCR检测结果显示,DMI组DCs中IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA相对表达量均明显低于PBS组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,DMI组共培养细胞中Th17细胞比例明显低于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测结果显示,DMI组共培养上清液中IL-17水平明显低于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。DMI组共培养细胞中IL-17、RORγt、IL-23R和GM-CSF mRNA相对表达量均明显低于PBS组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论DMI能够抑制DCs中促炎因子IL-6、IL-1β和IL-23的表达,进而负向调控IRBP_(1-20)特异性Th17细胞反应。

功能化外泌体对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠治疗的研究

目的:探究负载髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的293F细胞来源的外泌体(EXO)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的治疗效果。方法:利用Western印迹、透射电子显微镜以及Nanosight对超速离心分离的293F细胞上清EXO进行表征;利用流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞摄取EXO的生物学功能;利用EXO特异性锚定肽EXP将MOG抗原肽修饰于EXO表面,流式细胞术检测EXO与MOG抗原肽的结合效率(EXO_(MOG));活体成像检测EXO_(MOG)的体内分布;利用小鼠的临床评分、体重变化以及收样时小鼠脾细胞中调节性T细胞变化和脊髓染色,评估EXO_(MOG)对EAE小鼠的治疗效果;利用组织形态学染色检测EXO_(MOG)治疗对各组小鼠不良反应。结果:超速离心可成功分离EXO,且分离的EXO具有被细胞摄取的生物学功能;EXP外泌体锚定肽介导MOG抗原肽高效负载于EXO表面,且不影响EXO的体内分布;在EAE小鼠上测试结果显示:与未治疗组和MOG组相比,EXO_(MOG)组小鼠治疗后第24天的体重显著增加(P<0.05),行为学评分显著降低(P<0.05),且治疗后小鼠脾脏中CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞显著增高(P<0.05);病理染色结果表明:EXO_(MOG)组小鼠的各组织器官未见明显病理学改变。结论:EXO_(MOG)能够有效缓解小鼠EAE疾病进展且未检测到相关不良反应。

莱鲍迪甙B通过线粒体凋亡途径对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的保护作用

目的探讨莱鲍迪甙B在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型中的保护作用及相关机制。方法培养BV2细胞,将细胞按完全随机法分为正常对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)炎症细胞模型组、莱鲍迪甙B干预组。给予BV2细胞1μg/mL LPS培养24 h制备LPS炎症细胞模型。莱鲍迪甙B干预组于造模前给予10μmol/L莱鲍迪甙B干预4 h。利用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,采用免疫荧光法观察细胞形态学变化,采用Western blot检测细胞抗活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3抗体(Caspase-3)、抗Bcl-2相关X蛋白抗体(Bax)和抗B细胞淋巴瘤因子-2抗体(Bcl-2)表达情况。选取6~8周龄雌性C57BL/6小鼠30只,随机分为正常对照组、EAE模型组、莱鲍迪甙B干预组,每组各10只。利用MOG_(35-55)多肽皮下注射法构建EAE动物模型。莱鲍迪甙B干预组小鼠于造模后第8天给予腹腔注射莱鲍迪甙B(按体重1 mg/kg),持续15 d。采用HE染色观察小鼠脊髓组织病理学变化,采用Western blot检测脊髓组织Caspase-3、Bax和Bcl-2表达情况,采用透射电镜观察小鼠脑组组织内凋亡小体。结果(1)细胞实验结果:与正常对照组相比,LPS炎症细胞模型组的细胞S期比例下降,细胞核染色质固缩明显,细胞凋亡率上升,Caspase-3表达水平增加,Bax/Bcl-2比值升高(均P<0.01)。与LPS炎症细胞模型组相比,莱鲍迪甙B干预组细胞S期比例上调,细胞核染色质固缩现象改善,细胞凋亡率下降,Caspase-3表达水平降低及Bax/Bcl-2比值降低(均P<0.01)。(2)动物实验结果:与正常对照组相比,EAE模型组小鼠脊髓组织炎症细胞浸润增多,Caspase-3表达水平增加及Bax/Bcl-2比值升高(均P<0.01),小鼠脑组织的细胞形态异常,出现凋亡小体。与EAE模型组小鼠相比,莱鲍迪甙B干预组小鼠脊髓组织Caspase-3表达水平下降及Bax/Bcl-2比值下降(均P<0.01),小鼠脑组织细胞形态基本正常。结论莱鲍迪甙B对EAE模型小鼠具有神经保护作用,其作用机制与莱鲍迪甙B抑制细胞凋亡途径有关。

补肾益髓胶囊对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠大脑内BDNF和Nogo A的影响

目的观察补肾益髓胶囊对EAE小鼠大脑内脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)和勿动蛋白(Nogo A)表达的影响,探讨本方促进EAE小鼠轴突损伤修复再生的可能机制。方法小鼠背部皮下注射抗原MOG35-55,诱导EAE模型。每天观察小鼠的体质量变化和神经功能评分,发病第18天(发病急性期)和第40天(发病缓解期)取小鼠大脑,HE染色观察其病理改变,用免疫组化(immunohistochemistry,IHC)法测定小鼠大脑中BDNF和Nogo A的变化。结果补肾益髓胶囊明显减轻病灶部位的炎性细胞浸润,明显增加不同时间点BDNF在大脑皮层(P<0.01)、脑室下(P<0.01)及侧脑室旁(P<0.01)的表达,并且可以减少Nogo A在大脑上述不同部位的表达(P<0.05,P<0.01)。结论补肾益髓胶囊的神经保护作用机制可能与其能够促进神经营养因子BDNF及降低抑制因子Nogo A的表达相关。

1,25(OH)_2D_3干预实验性自身免疫性甲状腺炎TH1/TH2细胞失衡的研究

目的观察1,25(OH)2D3对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)大鼠炎症及Th1/Th2细胞的干预效果。方法 48只雌性Wistar大鼠随机分为预防组(n=10),治疗组(n=10),阳性对照组(n=12)和阴性对照组(n=16)。除阴性对照组外,其余大鼠均给予pTG免疫致敏。预防和治疗组每只大鼠使用维生素D35μg/kg.,隔日腹腔注射,分别从建模0～6周和2～8周作干预,阴性对照组和阳性对照组应用花生油作对照。各组大鼠在处死后取甲状腺组织做病理学检查,检测血清自身抗体,及细胞因子的改变。结果阴性对照大鼠的甲状腺结构完整;阳性对照组大鼠甲状腺滤泡结构破坏严重,部分滤泡萎缩或消失,1,25(OH)2D3干预组大鼠甲状腺结构保持较完整,萎缩滤泡减少,淋巴细胞浸润不明显。与阴性对照组相比,预防组其自身抗体及细胞因子水平均无显著性差异;治疗组大鼠血清抗体水平与同时期的阳性对照相比水平明显降低(P<0.05),但较阴性对照明显升高(P<0.05);与阳性对照组相比,治疗组大鼠IFN-γ及IL-12水平显著下降(P<0.05),IL-4和IL-10水平升高(P<0.01)。结论在EAT大鼠建模开始就使用1,25(OH)2D3可使大鼠甲状腺组织保持较完整形态,维持血清抗体及细胞因子正常范围。对EAT大鼠,1,25(OH)2D3有可能减缓病理损害,调整细胞因子的失衡。

Fasudil对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞的作用

目的:确认法舒地尔(Fasudil)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的治疗效果,观察法舒地尔对小胶质细胞和星形胶质细胞的作用。方法:成年雌性C57BL/6小鼠用MOG35-55肽免疫制作慢性EAE模型,分别随机在免疫后第3天(Fasudil早期治疗组)和发病时给予Fasudil(Fasudil晚期治疗组),以同样方式给予生理盐水作为对照。观察临床症状和体质量变化;采用免疫荧光组织化学染色、Western blot法检测脊髓小胶质细胞和星形胶质细胞iNOS和p-NF-κB/p65的表达,ELISA测定脊髓匀浆中IL-1β和TNF-α水平。结果:Fasudil推迟EAE起病,减轻EAE症状,抑制脊髓中小胶质细胞iNOS以及星形胶质细胞p-NF-κB/p65表达,并伴随炎性因子IL-1β和TNF-α释放降低。结论:Fasudil可抑制EAE小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞炎性分子的释放。

龙胆泻肝汤对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

目的探讨龙胆泻肝汤对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)的治疗作用。方法 Lewis大鼠随机分为对照组6只、EAU组18只和LXT组18只,光感受器间维生素A结合蛋白免疫EAU组和LXT组大鼠。观察大鼠生理特征及眼部炎症变化,出现葡萄膜炎症时给予LXT组大鼠龙胆泻肝汤灌胃;免疫后12 d比较各组大鼠眼组织病理学差异;免疫后每隔4 d检测房水蛋白及血清中白蛋白、球蛋白变化。结果成功制备了EAU大鼠模型;免疫后5 d大鼠开始出现葡萄膜炎症状,12 d炎症最重。EAU大鼠肛温在1 d、7 d、10 d和12 d高于对照组(P=0.020、0.000、0.015、0.001);免疫后12 d,EAU组房水蛋白浓度为(36.03±3.23)g·L-1,LXT组为(24.67±2.60)g·L-1,差异有显著统计学意义(P=0.000);组织病理学显示EAU组视网膜结构破坏程度明显高于LXT组(P.000)。EAU组免疫后4 d、8 d及12 d白蛋白均低=0于对照组(P=0.045、0.000、0.033),LXT组4 d和8 d白蛋白低于正常(P=0.045、0.005),但12 d时恢复至正常;12 d时EAU组球蛋白明显高于正常(P=0.047),LXT组未见明显异常。结论龙胆泻肝汤能有效减轻EAU大鼠前房炎症,减少炎症细胞浸润,保护眼部组织结构,增强机体抗氧化能力,调节免疫状态,对EAU发挥治疗作用。

黄芪糖蛋白对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的免疫调节作用

目的探讨黄芪糖蛋白(HQGP)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的治疗效果及可能机制。方法用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)诱导C57BL/6雌性小鼠建立EAE模型。分为黄芪糖蛋白治疗组和EAE对照组,隔天记录小鼠临床评分和体质量变化。HE染色和免疫荧光技术检测脊髓组织炎细胞浸润;MTT法检测细胞活性;Griess法检测一氧化氮(NO)释放;ELISA测定肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)分泌,γ干扰素(IFN-γ)释放;流式细胞术检测CD4+T细胞亚群变化。结果 HQGP处理可减轻EAE症状,抑制中枢神经系统炎细胞浸润。抑制脾淋巴单核细胞活性、NO和TNF-α、IL-6分泌,促进IFN-γ的分泌。增加CD4+CD25+、CD4+IL-10+、CD4+IFN-γ+T细胞亚群的比例。结论 HQGP通过调节T细胞亚群比例,抑制炎症细胞因子释放,减轻EAE炎症反应。

MOG诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及外周神经系统CD4^+ T及CD8^+ T调节性细胞变化

目的：观察实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢及外周CD4^＋CD25^＋调节性T细胞（CD4^＋CD25^＋Treg），CD8^＋CD28^-调节性T细胞（CD8^＋CD28^-Treg）表达的变化情况，并探讨相关的细胞免疫学机制。方法：雌性C57BL／6小鼠随机分为未使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35—55（MEVGWYR-SPFSRVVHLYRNGK）（MOG35-55）免疫的对照组和使用MOG35-55免疫诱导的EAE小鼠模型组，采用临床症状评分记录小鼠行为学变化、HE染色观察CNS炎症细胞浸润及病理改变，使用流式细胞术（FCM）检测小鼠中枢及外周CD8^＋CD28^-Treg，CD4^＋CD25^＋Treg细胞表达水平。结果：MOG35-55诱导的EAE模型组动物出现典型的EAE临床行为学及病理学表现，FCM检测EAE模型组小鼠脾细胞CD4^＋CD25^＋Treg较对照组升高但无统计学差异，CD8^＋CD28^-Treg表达水平明显低于对照组（P〈0．01），EAE模型组中枢有CD4^＋CD25^＋Treg，CD8^＋CD28^-Treg淋巴细胞的浸润，且CD4^＋CD25^＋Treg，CD8^＋CD28^-Treg在中枢的表达均高于外周，对照组中枢神经系统未检测到淋巴细胞浸润。结论：CD4^＋CD25^＋Treg，CD8^＋CD28^-Treg均参与调控EAE的病理过程，CD4^＋CD25^＋Treg，CD8^＋CD28^-Treg在EAE小鼠中枢及外周分布及变化的不同，提示其进人中枢神经系统（CNS）并参与调节中枢局部炎症。

左归丸和右归丸对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠中枢神经系统IL-10、TGF-β蛋白表达的研究

目的观察大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型脑、脊髓组织白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)与组织生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)免疫组化的表达,探讨滋阴补肾法(左归丸)与温阳补肾法(右归丸)治疗EAE的作用机制。方法用髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)免疫Lewis大鼠诱导EAE模型,120只大鼠采用数字表法随机分为正常组、模型组、激素组、左归丸组及右归丸组,正常对照组(n=24)和模型组(n=24)每天给予3mL0.9%氯化钠注射液灌胃;激素组(n=24)免疫后每天给予3mL0.9%氯化钠注射液灌胃,发病后改为醋酸泼尼松混悬液5mg/(kg.d-1)灌胃;左归丸组(n=24)免疫后给予左归丸混悬液2g/(kg.d-1);右归丸组(n=24)免疫后给予右归丸混悬液3g/(kg.d-1),直至处死。分别于免疫后15d(急性期发病)和免疫后27d(缓解期)选取各组大鼠,取脑和脊髓组织切片进行IL-10、TGF-β免疫组化染色。结果造模后15d,模型动物的脑和脊髓组织IL-10、TGF-β表达(指表达染色IOD值,下同)明显减少,第27天,模型动物脊髓组织IL-10表达明显减少。第15天,左归丸组与右归丸组大鼠脑组织IL-10表达较模型组明显升高(P<0.01);左归丸组大鼠脊髓组织IL-10表达也较模型组明显升高(P<0.05);右归丸组与激素组大鼠脑TGF-β表达较模型组升高,右归丸组大鼠脊髓TGF-β表达较模型组升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。造模后27d,左归丸组、右归丸组、激素组脊髓组织IL-10表达均较模型组显著增高(P<0.01);左归丸组大鼠脊髓组织TGF-β表达较模型组与激素组升高(P<0.05)。模型组、激素组、左归丸组与右归丸组脊髓IL-10表达均较免疫后15d明显升高(P<0.05);左归丸组大鼠脊髓TGF-β表达较免疫后15d明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论左归丸和右归丸可上调EAE大鼠中枢神经系统IL-10、TGF-β表达,作用优于激素。两者整个病程中均对IL-10表达有促进作用,不同点为右归丸促进急性期脑组织TGF-β的表达,而左归丸则促进缓解期脊髓TGF-β的表达。

大黄素对实验性自身免疫性甲状腺炎小鼠辅助型T细胞亚群的影响

目的:研究大黄素对实验性自身免疫性甲状腺炎(experimental autoimmune thyroiditis,EAT)小鼠甲状腺的保护作用和机制。方法:通过过量碘剂诱导非肥胖型糖尿病(non-obese diabetic,NOD)小鼠建立EAT动物模型,造模4周后各实验组摄入不同剂量的大黄素。造模8周后检测小鼠血浆甲状腺球蛋白(Tg Ab)及甲状腺炎症程度以观察大黄素对EAT小鼠的保护作用。流式细胞术检测小鼠外周血、脾脏T细胞亚群,分析大黄素对EAT小鼠外周血、脾脏Th1、Th2细胞流式检测频率的影响。ELISA法检测血浆IL-4、IFN-γ水平。结果:(1)甲状腺病理学观察,各大黄素实验组较模型组甲状腺淋巴细胞浸润程度减轻,分级比较差异有统计学意义(P<0.01);(2)造模后的各组小鼠血浆Tg Ab水平明显升高,各实验组升高幅度低于模型组,组间有统计学差异(P<0.01);(3)造模后的各组小鼠血浆IL-4、IFN-γ、外周血单核细胞以及脾脏淋巴细胞中CD_3^+CD_4^+IL-4^+、CD_3^+CD_4^+IFN-γ^+、CD_3^+CD_8^+IL-4^+和CD_3^+CD+8IFN-γ^+T细胞频率均较对照组明显增高(P<0.01),但各实验组升高幅度低于模型组小鼠。结论:过量碘剂诱导NOD小鼠自身免疫性甲状腺炎造模是可行的;大黄素对造模小鼠甲状腺炎自身免疫反应有一定抑制作用。大黄素通过抑制CD_4^+CD_8~T淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ,从而抑制造模小鼠的自身免疫反应。

Nrf2和HO-1在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠脊髓中的动态表达及依达拉奉保护机制的研究

目的:探讨依达拉奉对实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmuneen cephalomyelitis,EAE)大鼠的影响及作用机制。方法:应用豚鼠脊髓匀浆抗原(GPSCH)免疫Wistar大鼠建立EAE模型,随机分为对照组、EAE组、依达拉奉小剂量组、依达拉奉大剂量组及地塞米松组(DXM),比较各组不同时间点的发病率并进行神经功能评分,脊髓组织切片进行HE染色、三色染色观察病理变化,免疫组化染色观察Nrf2及血红素加氧酶(HO-1)表达。结果:依达拉奉大剂量组(8.33%)和DXM组(0%)的发病率均低于EAE组(58.3%)(P<0.05);在发病高峰期时,依达拉奉大剂量组(0.32±1.10)、DXM组(0)各大鼠神经功能评分明显低于EAE组(2.06±2.01)及依达拉奉小剂量组(1.21±1.51)(P<0.05);依达拉奉大剂量组(1.25±1.67)、DXM组(0)大鼠16天时脊髓组织内炎症细胞浸润形成的血管袖套数目明显低于EAE组(8.17±3.49)及依达拉奉小剂量组(7.67±4.37)(P<0.05);依达拉奉大剂量组的轴突及髓鞘损伤程度较EAE组和依达拉奉小剂量组轻;与正常组比较,EAE组、依达拉奉小剂量组、依达拉奉大剂量组及DXM组大鼠的脊髓组织中Nrf2及HO-1表达均上调,依达拉奉大剂量组的表达数目最高,且与其他组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:依达拉奉可以降低EAE大鼠的发病率,减轻发病时神经功能损伤的程度以及脊髓内炎性细胞浸润的程度,其神经保护作用可能是通过上调Nrf2及HO-1的表达,发挥抗氧化应激作用来实现的。