不同品种小鼠实验性自身免疫性睾丸炎模型的建立

[目的]研究ICR、BALB/C以及C57三种品系的雄性小鼠对实验性自身免疫性睾丸炎(EAO)的易感性。[方法]将每种品系的12只健康雄性小鼠随机分为对照组与EAO组,每组6只。对小鼠进行皮下注射,每次0.2mL,注射3次,两次间隔2周。对照组小鼠皮下注射完全弗氏佐剂(CFA)乳化的PBS;EAO组小鼠皮下注射完全弗氏佐剂乳化的同系睾丸匀浆。在第一次免疫注射50d后,取小鼠附睾尾与输精管检测精液品质;取小鼠睾丸制作切片,HE染色后用于组织病理学观察。[结果]结果显示,与对照组相比,BALB/C小鼠EAO组的精子密度显著降低,ICR与C57小鼠EAO组的精子密度无显著变化;3种品系小鼠EAO组的精子活力和活率都显著降低;BALB/C小鼠EAO组的睾丸损伤严重,ICR与C57小鼠EAO组的睾丸损伤不太明显。[结论]由此表明,BALB/C品系的小鼠比ICR与C57小鼠更易诱导EAO。

雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响

目的探讨雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响。方法取健康6~8周龄B10.RIII小鼠36只,随机分为正常对照组、EAU溶剂对照组、雷公藤红素干预组,每组12只。将光感受器间维生素A类结合蛋白161-180和完全弗氏佐剂充分乳化混合后,注射于EAU溶剂对照组和雷公藤红素干预组小鼠双侧大腿和尾部皮下,总体积200μL,每只小鼠注射光感受器间维生素A类结合蛋白161-180的量为50μg。免疫后第7-14天,雷公藤红素干预组小鼠每天接受0.5 mg·kg^(-1)雷公藤红素腹腔注射治疗,EAU溶剂对照组小鼠注射同等剂量的无菌PBS缓冲溶液。免疫后第14天,通过裂隙灯显微镜观察各组小鼠眼前节表现及行组织切片HE染色,并参照Caspi分级标准对各组小鼠进行临床评分及组织病理学评分;免疫荧光染色观察小鼠眼内小胶质细胞活化情况;Western blot检测小鼠视网膜中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg1)蛋白表达水平;qRT-PCR检测小鼠视网膜中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6 mRNA相对表达量。采用Graphpad Prism 9.0统计软件进行数据分析。结果免疫后第14天,通过裂隙灯显微镜观察发现,EAU溶剂对照组小鼠眼前节可见虹膜血管扩张充血明显、角膜水肿、前房渗出;而雷公藤红素干预组小鼠眼前节炎症明显减轻,可见虹膜血管轻度充血。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠临床评分均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。雷公藤红素干预组小鼠临床评分低于EAU溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果显示,免疫后第14天,EAU溶剂对照组小鼠出现严重的视网膜皱褶和脱离,炎症细胞弥漫浸润;而雷公藤红素干预组小鼠视网膜结构破坏轻微,可见少量炎症细胞浸润。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分低于EAU溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、EAU溶剂对照组、雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞密度分别为(1.00±0.12)%、(36.07±4.57)%、(1.83±0.36)%,与正常对照组相比,EAU溶剂对照组及雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞数增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组小鼠视网膜中iNOS、Arg1蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠视网膜中iNOS蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论雷公藤红素可抑制M1型小胶质细胞活化,减少EAU小鼠视网膜炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生,减轻炎症反应。

衣康酸二甲酯对树突状细胞分泌促炎因子以及实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠辅助性T细胞17的影响

目的探究衣康酸二甲酯(DMI)对树突状细胞(DCs)分泌促炎因子的作用,并初步研究其对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠光感受器间维生素A类结合蛋白1-20(IRBP_(1-20))特异性辅助性T细胞17(Th17)的影响。方法分离C57BL/6J小鼠双侧股骨和胫骨得到骨髓细胞,利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4将其定向诱导分化为骨髓来源的DCs。诱导分化6 d,将细胞分为DMI组和PBS组,分别用250μmol·L^(-1)DMI及等量的磷酸盐缓冲液(PBS)预处理3 h后,每组加入100μg·L^(-1)脂多糖(LPS)刺激24 h。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测两组DCs中促炎因子IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA相对表达量。采用IRBP_(1-20)、弗氏不完全佐剂及结核分枝杆菌H37RA主动免疫小鼠构建EAU模型,免疫后13 d,将分离的EAU小鼠脾脏及淋巴结T细胞与PBS或DMI处理的DCs在含有IRBP_(1-20)的培养基中共培养,并向Th17方向极化。流式细胞仪检测共培养细胞中Th17细胞比例。ELISA检测共培养上清液中IL-17水平。qRT-PCR检测共培养细胞中维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、IL-17、IL-23R和GM-CSF mRNA相对表达量。结果qRT-PCR检测结果显示,DMI组DCs中IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA相对表达量均明显低于PBS组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,DMI组共培养细胞中Th17细胞比例明显低于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测结果显示,DMI组共培养上清液中IL-17水平明显低于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。DMI组共培养细胞中IL-17、RORγt、IL-23R和GM-CSF mRNA相对表达量均明显低于PBS组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论DMI能够抑制DCs中促炎因子IL-6、IL-1β和IL-23的表达,进而负向调控IRBP_(1-20)特异性Th17细胞反应。

hUMSCs外分泌蛋白治疗实验性自身免疫性葡萄膜炎模型大鼠的机制初探

目的:探讨腹腔注射人脐带间充质干细胞外分泌蛋白(hUMSCs-S)治疗实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型大鼠的可能性及其相关作用机制。方法:6~8周龄Lewis大鼠72只,用随机数字表分方法均分为3组,分别为正常对照(CTRL)组、EAU模型组及hUMSCs-S治疗组,每组24只。EAU组与hUMSCs-S组大鼠采用光感受器间维生素A结合蛋白(IRBP)联合弗氏完全佐剂建立EAU模型,hUMSCs-S组大鼠在建模的同时予以腹腔注射hUMSCs-S,EAU组及CTRL组大鼠均腹腔注射等量PBS。裂隙灯显微镜拍摄记录各组大鼠眼前段情况,根据Caspi评分标准评价眼前段炎症程度;于免疫后第7天(初发期)、14天(高峰期)、21天(恢复期)取眼球组织制成石蜡切片进行HE染色、免疫组化及免疫荧光染色,分别用于眼球组织病理学评分、前房浸润细胞情况评估,观察眼球组织中CD3^(+)T细胞及紧密连接蛋白ZO-1的表达。无菌操作下采腹主动脉血,制备血清,行ELISA法检测各组大鼠血清中白细胞介素10(IL-10)和IL-17的浓度。结果:(1)通过裂隙灯显微镜观察和比较,EAU组大鼠出现明显眼前段炎症反应,在建模后第11~17天,hUMSCs-S治疗有降低眼前段Caspi评分的作用(P<0.05);(2)眼球组织切片HE染色结果显示,建模后第14天,hUMSCs-S组大鼠虹膜睫状体和视网膜结构破坏及前房炎细胞浸润数量均低于EAU组(P<0.05);(3)眼球组织切片免疫组化及免疫荧光染色结果显示,hUMSCs-S组大鼠虹膜睫状体、前房和视网膜中CD3^(+)T细胞浸润较EAU组减少,视网膜及视网膜色素上皮(RPE)层ZO-1表达量较EAU组增加;(4)ELISA法检测大鼠外周血血清IL-17及IL-10浓度结果显示,与EAU组相比,hUMSCs-S组大鼠外周血IL-17表达下降、IL-10表达增加(P<0.05)。结论:hUMSCs外分泌蛋白对EAU模型大鼠治疗有效;腹腔注射hUMSCs外分泌蛋白可影响EAU大鼠外周血中炎症因子表达,减少眼内炎症细胞浸润,减轻RPE层紧密连接蛋白的破坏程度。

祛风明目丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠NLRP3、ASC、IL-1β表达的影响

目的探讨祛风明目丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠房水及视网膜组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis related spot like protein,ASC)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表达的影响。方法将70只SPF级雄性Lewis大鼠按随机数字表法取19只为空白组,其余为造模组,进行主动免疫,建立EAU大鼠模型,连续造模7 d后分别从造模组及空白组随机抽取3只大鼠取眼球行HE染色,进行组织病理学检查;将造模成功的EAU大鼠随机分为模型组、祛风明目丸低剂量组(简称低剂量组)和祛风明目丸正常剂量组(简称正常剂量组),每组16只。空白组、模型组予以蒸馏水灌胃,低剂量组和正常剂量组予以不同剂量的祛风明目丸药液灌胃,均干预14 d。自造模开始,每天于裂隙灯下观察眼前节变化,并采用Caspi临床分级标准评分;自灌胃起14 d后,ELISA检测房水中NLRP3、IL-1β水平,Western blot检测视网膜组织中ASC、NLRP3蛋白水平。结果Caspi临床分级评分结果示,自造模第3天起造模组评分均明显高于空白组(P<0.01),说明EAU模型制备成功。ELISA结果显示,与空白组相比,模型组房水中NLRP3、IL-1β水平升高(P<0.05);与模型组相比,正常剂量组及低剂量组两者含量均降低(P<0.05);正常剂量组与低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示,与空白组相比,模型组视网膜组织中ASC、NLRP3蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组相比,正常剂量组及低剂量组视网膜组织中ASC、NLRP3蛋白表达含量均下降(P<0.05);与正常剂量组相比,低剂量组视网膜组织ASC、NLRP3蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论祛风明目丸可能通过降低NLRP3炎症小体及下游炎症因子的表达对EAU大鼠发挥一定的治疗作用。

利妥昔单抗对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠的抗炎作用及其机制

目的探讨利妥昔单抗(RTX)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠的抗炎作用及其机制。方法取SPF级6~8周龄健康雌性C57BL/6J小鼠27只,使用光感受器间维生素A类结合蛋白1\|20(IRBP 1-20)建立EAU小鼠模型,将EAU小鼠随机分为PBS对照组、50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组,每组各9只小鼠,PBS对照组小鼠腹腔注射PBS,50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组小鼠每千克体重分别腹腔注射50 mg RTX和100 mg RTX。造模后第21天,对各组小鼠进行眼底图像的采集与视网膜组织HE切片的制作,通过小动物视网膜成像仪采集各组小鼠眼底图像并参照Caspi临床评分标准进行炎症评分,将HE染色切片置于显微镜下观察并进行拍照,参照Caspi组织病理学评分标准进行评分。采用实时荧光定量PCR检测各组小鼠视网膜组织白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-4和IL-10的mRNA相对表达量。采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。结果眼底图像显示:PBS对照组EAU小鼠眼底出现多发性血管炎,血管扩张,视网膜脉络膜出现多发病灶及少量线样病变;50 mg·kg^(-1) RTX实验组EAU小鼠眼底发生轻度血管炎,视网膜出现个别局部病灶,无线样病变;100 mg·kg^(-1) RTX实验组EAU小鼠视网膜局部出现个别病灶,无线样病变。PBS对照组、50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组EAU小鼠眼底图像Caspi临床评分分别为(1.944±0.808)分、(1.667±0.791)分、(1.667±0.829)分,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。PBS对照组、50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组EAU小鼠视网膜组织病理学评分分别为(1.563±1.116)分、(1.063±0.623)分、(1.250±0.655)分,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。实时荧光定量PCR检测结果显示,50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组小鼠视网膜组织IL-6、IL-10 mRNA相对表达量以及IL-10/IL-6比值均高于PBS对照组(均为P<0.05);100 mg·kg^(-1) RTX实验组小鼠视网膜组织IL-6、IL-10 mRNA相对表达量以及IL-10/IL-6比值均高于50 mg·kg^(-1) RTX实验组(均为P<0.05)。结论腹腔注射RTX可一定程度缓解EAU小鼠视网膜组织的炎性病变,其机制可能与RTX提高小鼠视网膜组织IL-10/IL-6比值有关。

实验性自身免疫性葡萄膜炎青紫蓝兔模型的建立及其特点比较

目的评价2种方法诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)青紫蓝兔模型的发生过程及特点。方法42只青紫蓝兔随机分为对照组(CG)6只、模型1组(MG1)18只、模型2组(MG2)18只。CG组不做任何处理;MG1组使用结核分枝杆菌H37Ra与弗氏完全佐剂的混悬液皮下注射进行预先免疫,19 d后右眼玻璃体腔注射结核分枝杆菌H37Ra建立EAU模型;MG2组采用牛血清白蛋白(BSA)耳缘静脉及玻璃体腔二次注射法建立EAU模型。所有动物分别于完成免疫后第1、4、7、14、21、28天行裂隙灯显微镜、前置镜、眼前节照相、眼B超、眼底照相观察眼部情况,根据自拟的EAU青紫蓝兔模型症状评分标准进行症状评分。结果(1)发病时间与周期:MG1组所有青紫蓝兔在完成诱导后第1天均初发炎症,第4天炎症达到高峰,第7天开始逐渐消退,症状持续4周以上。MG2组13只(72.22%)青紫蓝兔在完成诱导后第1天初发炎症,第4天炎症达到高峰,之后炎症开始逐渐消退,以眼前段炎症为主,症状持续4周以上;其余5只(27.78%)初发症状时间及症状高峰时间不一。(2)症状表现:2组青紫蓝兔眼部表现均为混合充血、角膜水肿、前房炎症及渗出、瞳孔受损、玻璃体混浊、视网膜出血。(3)症状评分:与CG组比较,MG1、MG2组青紫蓝兔各时间眼部症状评分均升高(MG1:t_(1d)=12.550,t_(4d)=12.620,t_(7d)=14.090,t_(14d)=11.610,t_(21d)=12.530,t_(28d)=41.470,均P=0.000。MG2:t_(1d)=2.600,P=0.016;t_(4d)=7.293,t_(7d)=8.354,t_(14d)=7.410,t_(21d)=6.843,t_(28d)=7.397,均P=0.000);与MG1组比较,MG2组青紫蓝兔诱导后第1、4天眼部症状评分降低(t_(1d)=4.062,P=0.000;t_(4d)=2.359,P=0.024),差异均有统计学意义。其余时间2组间眼部症状评分比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论2种EAU青紫蓝兔模型其眼部表现与人类葡萄膜炎相似,MG1的初发炎症时间、炎症高峰时间、炎症严重程度及炎症变化趋势均一致。MG1较MG2的稳定性更好,可重复性更强,可作为理想的全葡萄膜炎研究的动物模型。

c-Myc抑制剂10058-F4对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠模型Th17细胞比例及细胞因子表达的影响

目的探讨c-Myc抑制剂10058-F4对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠模型光感受器间维生素A类结合蛋白1-20(IRBP 1-20)特异性辅助性T细胞17(Th17)细胞比例及细胞因子表达的影响。方法取健康C57BL/6J小鼠(8~10周龄)6只,采用随机数字表法将小鼠分为正常对照组、EAU组,每组3只。EAU组小鼠腹腔内注射350 ng百日咳毒素,单后足和脊柱两侧皮下注射含150μg IRBP 1-20、0.8 mg结核分枝杆菌H37RA和弗氏不完全佐剂的乳化剂以诱导EAU模型;正常对照组小鼠不给予特殊干预。免疫后13 d,行间接检眼镜检查并通过小动物视网膜成像系统可视化检测小鼠眼底炎性病灶,HE染色观察视网膜组织病理学改变,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测T细胞和眼球组织中c-Myc mRNA的表达。将EAU模型小鼠T细胞分为对照组和10058-F4组,10058-F4组T细胞加入50μmol·L^(-1)10058-F4,对照组T细胞不给予药物干预。培养6 h后,洗去药物,将两组T细胞与IRBP 1-20(10 mg·L^(-1))及骨髓来源树突细胞共培养,同时加入20μg·L^(-1)白细胞介素(IL)-23(Th17细胞诱导条件)。采用qRT-PCR检测c-Myc、维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、IL-17A、IL-17F和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)mRNA相对表达量,ELISA检测共培养细胞上清液中IL-17含量,流式细胞仪检测共培养细胞中Th17细胞比例。结果本研究EAU组小鼠模型建立成功。qRT-PCR检测结果显示,EAU组小鼠T细胞、眼球组织中c-Myc mRNA相对表达量分别为1.85±0.37、2.31±0.47,较正常对照组(1.01±0.02、0.99±0.05)均明显升高,差异均有统计学意义(P=0.017、0.008);10058-F4组T细胞c-Myc mRNA相对表达量为0.57±0.03,明显低于对照组(1.04±0.02),差异有统计学意义(P<0.001)。ELISA检测结果显示,10058-F4组共培养细胞上清液中IL-17含量明显低于对照组,差异有统计学意义(P=0.025)。流式细胞仪检测结果显示,10058-F4组共培养细胞中Th17细胞比例为(17.97±0.91)%,明显低于对照组[(22.50±0.90)%],差异有统计学意义(P=0.004)。qRT-PCR检测结果显示,10058-F4组T细胞RORγt、IL-17A、IL-17F、GM-CSF mRNA相对表达量分别为0.52±0.11、0.51±0.06、0.58±0.15、0.75±0.03,明显低于对照组(1.01±0.01、1.00±0.01、1.02±0.02、1.01±0.02),差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论c-Myc抑制剂10058-F4可显著降低T细胞中c-Myc表达水平,抑制Th17细胞特异性转录因子RORγt表达及效应细胞因子IL-17A、IL-17F、GM-CSF的产生,负向调控IRBP 1-20特异性Th17细胞免疫反应。

BATF对实验性自身免疫性脑脊髓膜炎小鼠的炎症反应的研究

目的探讨B细胞转录激活因子(B cell activating transcription factor,BATF)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠神经功能的影响。方法将40只C57BL/6小鼠分为对照组、EAE组、EAE+shRNA scramble(干扰对照)组和EAE+shRNA BATF组,每组10只。每天行神经功能评分评价小鼠神经功能,免疫后第7、14、21和28天时进行转棒实验和旷场实验。免疫后第28天,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)水平,流式细胞术检测脾脏淋巴细胞中辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)表达,苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)和勒克斯固蓝(Luxol fast blue,LFB)染色评估脊髓炎性细胞浸润和脱髓鞘程度。结果与EAE组小鼠相比,EAE+shRNA BATF组小鼠的EAE发作时间平均推迟7天;从免疫后第8天开始与EAE组小鼠相比,EAE+shRNA BATF组小鼠临床症状评分显著偏低;EAE+shRNA BATF组小鼠在免疫后第7、14和28天时出现运动功能的受损,但运动功能的受损与EAE组相比较轻(P均<0.05)。在免疫后第7、14、21和28天时,与对照组相比,EAE组和EAE+shRNA scramble组小鼠的总行进距离和垂直计数明显缩短(P均<0.05);而EAE组和EAE+shRNA scramble组小鼠较EAE+shRNA BATF组小鼠的总行进距离和垂直计数明显增加(P均<0.05);EAE+shRNA BATF组小鼠较EAE组血清IL-17水平和Th17/CD4^(+)百分比值显著降低(P均<0.05);EAE+shRNA BATF组较EAE组小鼠的脊髓中观察到较少的细胞浸润和神经髓鞘脱失(P均<0.05)。结论抑制EAE小鼠BATF可显著缓解其神经功能损伤,抑制IL-17和Th17细胞表达水平,改善脊髓炎性细胞浸润和脱髓鞘程度。

TLR4、MyD88、NF-κBmRNA在实验性自身免疫性肌炎小鼠淋巴结中的表达及意义

目的:研究TLR4、MyD88、NF-κB mRNA在实验性自身免疫性肌炎小鼠淋巴结中的表达情况,探讨TLR4在肌炎发病中的作用。方法:将30只雌性BALB/c小鼠随机分为5组(每组6只):第1组为正常对照组,其它4组分别为肌炎模型1周处理组、2周处理组、3周处理组和4周处理组,后4组均应用肌球蛋白诱导实验性自身免疫性肌炎模型(EAM)。采用实时荧光定量PCR方法检测各组小鼠淋巴结TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达水平。结果:(1)与正常小鼠相比,肌炎各组小鼠淋巴结中TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达均有统计学差异,表现为不同程度升高(P<0.01),第3组升高最为显著(P<0.01),第4组较第5组升高(P<0.01);(2)各组淋巴结中TLR4 mRNA表达水平与MyD88 mRNA、NF-κBmRNA表达水平均呈正相关(r=0.906,r=0.967,P<0.01),MyD88 mRNA表达水平与NF-κB mRNA表达水平呈正相关(r=0.919,P<0.01)。结论:TLR4在自身免疫性肌炎发生发展过程中发挥重要作用,且以MyD88依赖型信号途径为主,并通过激活NF-κB促进炎性因子释放。

调节性T细胞与Th17细胞相关因子在实验性自身免疫性肌炎小鼠淋巴结中的表达及意义

目的研究调节性T细胞(Treg)、Th17细胞的相关细胞因子在实验性自身免疫性肌炎小鼠淋巴结中表达的作用及意义。方法雌性BALB/c小鼠12只,随机分为正常对照组和模型组,模型组采用肌球蛋白诱导实验性自身免疫性肌炎(EAM)。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组小鼠淋巴结中与Treg和Th17细胞分化及功能相关的细胞因子Foxp3、IL-10、TGF-β、RORγt、IL-6、IL-17、IL-23的mRNA表达。结果与正常小鼠相比,肌炎组小鼠淋巴结中Treg的转录因子Foxp3表达降低,相关的细胞因子IL-10、TGF-βmRNA表达水平增高;Th17的转录因子RORγt及相关的细胞因子IL-6、IL-17、IL-23 mRNA表达有不同程度的升高(P<0.05)。结论实验性自身免疫性肌炎中Treg表达降低,而Th17及其相关因子表达升高,提示Treg和Th17之间的失衡在肌炎发病机制中起一定作用。

龙胆泻肝汤对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

目的探讨龙胆泻肝汤对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)的治疗作用。方法 Lewis大鼠随机分为对照组6只、EAU组18只和LXT组18只,光感受器间维生素A结合蛋白免疫EAU组和LXT组大鼠。观察大鼠生理特征及眼部炎症变化,出现葡萄膜炎症时给予LXT组大鼠龙胆泻肝汤灌胃;免疫后12 d比较各组大鼠眼组织病理学差异;免疫后每隔4 d检测房水蛋白及血清中白蛋白、球蛋白变化。结果成功制备了EAU大鼠模型;免疫后5 d大鼠开始出现葡萄膜炎症状,12 d炎症最重。EAU大鼠肛温在1 d、7 d、10 d和12 d高于对照组(P=0.020、0.000、0.015、0.001);免疫后12 d,EAU组房水蛋白浓度为(36.03±3.23)g·L-1,LXT组为(24.67±2.60)g·L-1,差异有显著统计学意义(P=0.000);组织病理学显示EAU组视网膜结构破坏程度明显高于LXT组(P.000)。EAU组免疫后4 d、8 d及12 d白蛋白均低=0于对照组(P=0.045、0.000、0.033),LXT组4 d和8 d白蛋白低于正常(P=0.045、0.005),但12 d时恢复至正常;12 d时EAU组球蛋白明显高于正常(P=0.047),LXT组未见明显异常。结论龙胆泻肝汤能有效减轻EAU大鼠前房炎症,减少炎症细胞浸润,保护眼部组织结构,增强机体抗氧化能力,调节免疫状态,对EAU发挥治疗作用。

Th1、Th17细胞相关因子在实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠中的表达及作用

目的探讨辅助性T细胞(T helper cells,Th)1、Th17细胞相关因子在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)中的表达及作用。方法取清洁级纯系健康雌性Lewis大鼠40只随机分为EAU组(32只)和对照组(8只),EAU组用光感受器间维生素A类结合蛋白诱导大鼠EAU模型,进行临床症状评分,免疫组织化学方法检测造模后视网膜内干扰素(inferferon,IFN)-γ、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、白细胞介素(interleukine,IL)-17、IL-6的表达。ELISA法对比分析房水中各细胞因子的变化情况。结果 EAU模型建立成功;造模后第14天,视网膜损害以外层为主,视网膜内有大量炎细胞浸润,从而导致视网膜内结构紊乱,同时在视网膜的视锥、视杆细胞层和神经节细胞层i NOS、IL-17、IL-6、IFN-γ表达,细胞阳性率分别为29%、48%、52%、73%。在EAU发病过程中,IL-6于造模后第7天迅速升高,第10天达到高峰;IL-17于造模后第14天达到最高值,变化趋势与炎症进程一致;IFN-γ在炎症后期仍有升高,于造模后第16天达到最高值;IL-6、IL-17、IFN-γ与对照组相比,各时间点表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)。i NOS在炎症进程中表达有所增加,但与对照组相比,各时间点的表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论Th1、Th17细胞相关因子调节网络共同参与实验性自身免疫性葡萄膜炎的发生发展。

实验性自身免疫性葡萄膜炎T淋巴细胞亚群与Treg细胞的表达研究

目的探讨实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)新西兰兔模型外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)T淋巴细胞亚群的变化及其与疾病特征的相关性。方法选取健康成年雄性新西兰大白兔40只作为动物模型,用20 g·L^(-1)牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)静脉注射和玻璃体内注射法建立EAU模型,并观察模型眼炎症反应及PBMC T淋巴细胞亚群特征。结果 CD4+T细胞在EAU兔的外周血中比例明显增加,且随时间的进展呈进行性增加,并与炎症反应呈正相关,相同的趋势可见于CD4+/CD8+T细胞比例。此外,Treg细胞趋势与CD4+T细胞及CD4+T/CD8+T细胞比例相反,与炎症反应呈负相关。结论 CD4+T细胞的优势性选择性克隆增殖及Treg细胞的降低有可能引发免疫功能紊乱并导致针对自身组织的免疫应答失去有效的负性调控,导致EAU的发生及进行性加重。

雷公藤多甙对CD28在实验性自身免疫性肌炎发病中作用的影响

目的 :观察 CD2 8在实验性自身免疫性肌炎 (EAM)发病中的作用 ;从 CD2 8核因子 κB(NFκB)信号传导通路探讨雷公藤多甙 (TWP)治疗多发性肌炎 (PM)的分子免疫学机制。方法 :用兔肌匀浆加等量完全福氏佐剂在大鼠背部肌肉和皮下组织多点注射制作 EAM动物模型。应用双色免疫荧光法流式细胞仪检测大鼠外周血 CD+ 4 和 CD+ 8T细胞上 CD2 8分子的表达 ;蛋白质免疫印迹 (Western blot)法检测 NFκB蛋白表达。结果 :EAM组外周血淋巴细胞以 CD+ 8T细胞为主 ,CD2 8及 NFκB表达明显增加。TWP组 CD+ 4 和 CD+ 8T细胞减少 ,CD2 8和 NFκB表达受抑制 (P<0 .0 5 )。结论 :EAM表现为 CD+ 8T细胞介导的细胞免疫反应异常 ,CD2 8在 EAM的发病中起重要作用 ,通过激活核转录因子使免疫反应进一步加强。 TWP可能通过抑制CD2 8NFκB这一信号传导通路从而抑制免疫反应。

复发性实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠模型的诱导及其特点

目的诱导复发性实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)小鼠模型,评价其发生过程及特点。方法完全弗氏佐剂(CFA)乳化的光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)161-180肽段免疫B10.RⅢ小鼠作为诱导组(35只),用CFA-PBS免疫小鼠作为对照组(6只)。小鼠免疫后7、14、21、28、35 d裂隙灯显微镜和光学显微镜观察及评价眼部炎症发生、眼部表现和病理学变化;待炎症完全消失时,再次免疫小鼠,评价小鼠眼部炎症复发。结果诱导组首次免疫后7 d出现初发炎症,14 d炎症达高峰,随后炎症消退,至35 d完全消失。第35天进行再次免疫,36 d出现复发炎症,42 d达炎症高峰,随后炎症消退,但至观察期第96天部分鼠(1/5)仍维持炎症。眼部表现为睫状充血、前房渗出、瞳孔受损。病理学表现为视网膜和脉络膜炎性细胞浸润,血管炎、肉芽肿性炎,光感受器细胞层破坏,视网膜下渗出。对照组未见明显炎症。结论建立的EAU呈现慢性复发性病程,其眼部表现和病理学特征与人类葡萄膜炎相似,可作为葡萄膜炎研究的新型动物模型。

实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠的发病特点

背景 Lewis大鼠是建立实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）动物模型的常用种系,对其发病特点,尤其是EAU大鼠眼部超微结构改变的研究尚未见报道. 目的 观察EAU大鼠的发病体征及其眼部超微结构的改变. 方法 选取SPF级6～8周龄雌性Lewis大鼠18只,采用随机数字表法随机分为对照组6只和模型组12只.模型组大鼠后肢足底、两侧腹壁和躯干上皮下各注射含有光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP,1177-1191）和结核菌素（TB）的完全弗氏佐剂（CFA）乳化液,对照组大鼠不作处理.注射后观察两组大鼠饮食、体温和活动情况,每天裂隙灯显微镜下观察大鼠眼部炎症表现,于免疫后12d获取大鼠眼组织标本,对虹膜、睫状体和视网膜进行常规组织病理学检查,并分别在扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察虹膜、睫状体和视网膜的超微结构改变.结果 模型组大鼠免疫后采食量为（190.00± 18.03）g,明显少于对照组的（285.33±28.02）g,差异有统计学意义（t=4.955,P=0.012）;模型组和对照组大鼠的饮水量分别为（241.67±18.56）ml和（289.67±18.18）ml,差异有统计学意义（t=3.201,P=0.033）;模型组大鼠体温升高,精神倦怠.裂隙灯显微镜下观察发现,模型组大鼠免疫后6d出现虹膜充血、前房积脓和瞳孔膜闭,免疫后12d眼部炎症最严重,炎症评分为（3.83±0.41）分,而对照组大鼠眼前节未见异常.组织病理学检查发现,模型组大鼠前房、虹膜、睫状体组织和玻璃体腔内均可见大量淋巴细胞、中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润.扫描电子显微镜下可见模型组大鼠虹膜肌纤维粗细不均,睫状体上皮表面粗糙及RPE细胞绒毛疏松.透射电子显微镜下观察可见,模型组大鼠虹膜单核巨噬细胞浸润,睫状体上皮细胞膜褶皱蓬松及排列紊乱,视网膜Müller细胞中有髓样小体,RPE细胞中有线粒体空泡出现,而对照组大鼠虹膜、睫状体及视网膜的形态结构均未发现异常.结论 用含IRBP（1177-1191）和TB的CFA乳化液诱导的EAU大鼠机体处于自身免疫炎症状态,其眼部组织形态学和超微结构的改变充分反映了EAU的炎症表现特征.

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢神经组织中CD_4 mRNA的变化及益肾达络饮对其的影响

目的观察中药复方益肾达络饮干预实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的疗效和作用机制。方法采用荧光定量PCR测定免疫后不同时间点EAE小鼠中枢神经组织中CD4mRNA表达的变化。结果中药复方益肾达络饮可以显著改善EAE模型小鼠神经功能评分。与模型组相比,激素组、中药组在免疫后14、24、40 d CD4mRNA在EAE小鼠大脑中表达水平明显降低,而在脊髓中仅在免疫后第14日显著降低。结论免疫炎性细胞CD4+T细胞是实验性自身免疫性脑脊髓炎的潜在调节细胞;中药复方益肾达络饮能有效改善EAE小鼠神经功能损伤,其干预EAE的作用机制与中枢神经系统免疫炎性细胞的调节密切相关。

实验性自身免疫性葡萄膜炎炎性因子表达的动态观察

背景C57BL／6（B6）小鼠是实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）动物模型常用的小鼠种系，以往研究证明葡萄膜炎的发病机制与辅助性T（Th）细胞分泌的炎性细胞因子相关，但各种Th细胞在EAU发病中的相互作用并不十分清楚。目的研究光感受器间维生素A类结合蛋白（1RBP）诱导不同天数后EAU小鼠脾脏和血清中炎性因子的动态变化，探讨各种炎性因子在EAU病理过程中的作用。方法用IRBP及完全弗氏佐剂（CFA）的乳化液在小鼠的尾根部及躯干部均匀注射5个点以免疫B6小鼠44只，免疫后每周3次用间接检眼镜观察小鼠的EAU发病情况，并参照Thurau的评分标准进行炎症评分。于注射后第30天摘取20只模型小鼠眼球，于瞳孔视神经平面制备切片行组织病理学检测。分别于注射前，注射后第2、5、10、15、20、25、30天取模型小鼠脾脏，提取RNA，逆转录扩增并行凝胶电泳，检测白细胞介素-17（IL-17）、叮干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF—α）和IL-10等因子的mRNA含量，同时收集相同时间点小鼠的血清，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中上述因子的质量浓度。结果IRBP及CFA乳化液免疫B6小鼠后第12天可见轻度葡萄膜炎症，炎症评分为0．5分，炎症反应在免疫后第13～15天最重，评分为1．0分，至第30天炎症明显减轻，评分为0．5。组织病理学检查显示，注射后第30天模型鼠眼部反应与间接检眼镜检查结果吻合，病理评分为0．5。模型鼠血清炎性因子检测结果显示，注射后第5天，小鼠血清中IL-17的质量浓度达到峰值，为（51．85±2．42）ng／L，随着时间的延长开始降低。到第15天时降到最低，为（4．01±0.06）ng／L，但在第25天时再次升高至（25．00±0．94）ng／L，之后逐渐下降，第30天时，血清中IL-17的质量浓度为（6．01±0．21）ng／L，与免疫前的（0．98±0．05）ng／L相比差异有统计学意义（P=0．000）。小鼠免疫前血清中IFN-γ的质量浓度为（1．02±0．09）ng／L，在注射后第5天达到（50．54±0．48）ng／L，于注射后第10天达到峰值，为（73．21±0．12）ng／L，然后逐渐降低。到第30天时，血清中IFN-γ的质量浓度为（5．15±0．18）ng／L，与免疫前相比差异仍有统计学意义（P=0．000）。注射后模型鼠血清中TNF—α质量浓度升高迅速，免疫后第2天质量浓度较免疫前明显升高，第5天达到峰值，质量浓度为（134．25±0．59）ng／L，但至第15天降到最低。注射后第20天再次升高，达到（60．54±0．62）ng／L，之后又逐渐下降，第30天时和免疫前相比差异无统计学意义（P=0．660）。IL-10在免疫后第5天可以被检测到，并且随着注射后时间的延长逐渐升高。到第15天时达到高峰，随后开始降低，第30天与免疫前相比差异有统计学意义（P=0．000）。脾脏中IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-14种炎性因子mRNA表达变化趋势和血清中的变化一致。结论在B6小鼠的EAU中，Th1、Th2、Th17相关炎性因子IFN-γ、TNF—α、IL-10及IL-17具有特征性变化规律，IFN-γ可能与EAU的急性期病理过程相关；IL-17、TNF—α可能与葡萄膜炎的慢性化、复发性有关；IL-10可缓解EAU的病理过程。

实验性自身免疫性肌炎中MMP-2,MMP-9,TIMP-1的表达及甲基强的松龙的影响

目的 :探讨基质金属蛋白酶 (MMP 2 ,MMP 9)及基质金属蛋白酶抑制剂 (TIMP 1)在实验性自身免疫性肌炎 (EAM)发病中的作用 ,以及甲基强的松龙对MMP 2 ,MMP 9,TIMP 1基因mRNA和蛋白表达的影响。方法 :应用RT PCR及免疫组织化学技术 ,研究MMP 2 ,MMP 9及TIMP 1在EAM组、甲基强的松龙治疗组 (EAMM组 )和对照组 (NS组 )大鼠外周血、脾脏、肌肉组织中的表达水平。结果 :EAMM组大鼠发病程度低于EAM组 ,炎症细胞浸润和肌纤维坏死程度减轻。MMP 2 ,MMP 9mRNA在EAM大鼠外周血、脾脏淋巴细胞中的表达上调 ;MMP 2 ,MMP 9蛋白在EAM组大鼠肌肉组织表达增加 ,与对照组相比差异有显著性。EAMM组MMP 2 ,MMP 9mRNA的表达及蛋白的表达均受到抑制 ,与EAM组比较差异有显著性。EAMM组TIMP 1基因mRNA及蛋白的表达上调 ,与EAM组相比差异有显著性。结论 :MMP 2 ,MMP 9表达增加可能与EAM发病有关 ;TIMP 1可能参与了抑制免疫反应 ;甲基强的松龙能减轻EAM发病程度 ,其作用机制可能与MMP 2及MMP 9的表达下调、TIMP