黄芪甲苷对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠T细胞免疫调节的影响

背景:多发性硬化初始阶段,中枢免疫细胞激活并释放大量炎症因子,引起白质脱髓鞘甚至累及灰质神经元。CD4^(+)T细胞不同亚群之间的分化平衡在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的病程进展中发挥着重要作用。课题组前期研究结果表明黄芪内有效成分黄芪甲苷能够调节EAE小鼠体内免疫反应,其是否对T细胞亚群分化具有调节作用尚未明确。目的:探究黄芪甲苷对EAE小鼠治疗效果及其对T细胞的免疫调控机制。方法:将C57BL/6雌性小鼠分为正常对照组、EAE疾病模型组和黄芪甲苷治疗组,每组8只,后2组使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)制备EAE模型,免疫后第10-28天,黄芪甲苷治疗组以40 mg/(kg·d)灌胃给药。免疫当天至第28天,记录各组小鼠的体质量及临床评分;免疫后第28天取小鼠脊髓制成冰冻切片行苏木精-伊红染色、固蓝染色观察脊髓病理改变,流式细胞术检测脾脏T细胞亚群百分比,Western blot法检测脊髓组织中γ干扰素、白细胞介素17、白细胞介素6的蛋白表达,ELISA检测脾细胞上清液中γ干扰素、白细胞介素17、白细胞介素6、白细胞介素4水平。结果与结论:(1)与EAE疾病模型组相比,黄芪甲苷治疗能够减少EAE小鼠体质量丢失(P<0.05),缓解临床症状(P<0.05),减轻脊髓炎症细胞浸润及髓鞘脱失病理改变(分别为P<0.01和P<0.05);(2)与EAE疾病模型组相比,黄芪甲苷治疗可抑制表达γ干扰素和白细胞介素17的CD4^(+)T细胞亚群比例(分别为P<0.001和P<0.001),上调表达白细胞介素10和转化生长因子β的CD4^(+)T细胞亚群百分比(分别为P<0.001和P<0.01);(3)黄芪甲苷可下调脊髓和脾脏中γ干扰素(分别为P<0.05和P<0.01)、白细胞介素17(分别为P<0.05和P<0.05)、白细胞介素6(分别为P<0.05和P<0.05)的表达,上调脾脏中抑炎因子白细胞介素4的表达(P<0.01);(4)结果说明,黄芪甲苷可以减轻EAE小鼠的临床症状,其机制与调节脾脏免疫细胞亚群进而抑制炎症细胞向中枢浸润、减少髓鞘脱失有关。

IgG受体FcγRⅡB调节实验性自身免疫性脑脊髓炎致神经元损伤及Th17/Treg免疫平衡的作用研究

目的:探究IgG受体FcγRⅡB对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型小鼠神经元损伤与Th17/Treg失衡的作用。方法:C57BL/6小鼠随机分组为对照组、EAE组、FcγRⅡB组、EAE+FcγRⅡB组,每组15只,皮下注射MOG35-55肽诱导EAE模型,并给予FcγRⅡB慢病毒液处理;造模后每日称量小鼠体质量,进行神经功能评分,持续30 d;30 d后处死小鼠,HE染色观察脑组织病理形态学变化,LFB染色评估脊髓髓鞘结构变化,免疫荧光染色检测脊髓大脑皮质神经元核抗原(NeuN)和Caspase-3表达,TUNEL染色检测神经元细胞凋亡,ELISA检测血清IL-6、IL-17、IL-10及TGF-β水平,流式细胞术分析脾脏Th17、Treg细胞比例分布,Western blot测定脊髓组织维甲酸相关孤儿受体γt(RORγt)与Forkhead家族转录因子3(Foxp3)蛋白表达。结果:与对照组比较,EAE组小鼠体质量下降,神经功能评分升高,脑组织内炎症细胞浸润明显,脊髓中出现脱髓鞘迹象,NeuN荧光表达强度减弱而Caspase-3荧光表达强度增强,TUNEL阳性着色细胞多,细胞凋亡数增加,血清中IL-6和IL-17水平升高,IL-10和TGF-β水平降低,脾脏内Th17细胞比例升高,Treg比例降低,脊髓组织内RORγt蛋白表达上调,Foxp3蛋白表达下调(P<0.05);与EAE组比较,EAE+FcγRⅡB组小鼠体质量增加,神经功能评分降低,脑组织内炎症细胞浸润减轻,脊髓脱髓鞘现象得到改善,NeuN荧光表达强度增强,Caspase-3荧光表达强度减弱,TUNEL阳性着色细胞较少,细胞凋亡数减少,血清中IL-6和IL-17水平降低,而IL-10和TGF-β水平升高,同时脾脏内Th17细胞比例降低,Treg比例升高,脊髓组织内RORγt蛋白表达下调而Foxp3蛋白表达上调(P<0.05)。结论:FcγRⅡB对EAE小鼠具有神经保护作用,可减轻其脑组织炎症细胞浸润及脱髓鞘现象,作用机制可能与调节细胞因子水平及Th17/Treg细胞免疫平衡有关。

莱鲍迪甙B通过线粒体凋亡途径对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的保护作用

目的探讨莱鲍迪甙B在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)模型中的保护作用及相关机制。方法培养BV2细胞,将细胞按完全随机法分为正常对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)炎症细胞模型组、莱鲍迪甙B干预组。给予BV2细胞1μg/mL LPS培养24 h制备LPS炎症细胞模型。莱鲍迪甙B干预组于造模前给予10μmol/L莱鲍迪甙B干预4 h。利用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,采用免疫荧光法观察细胞形态学变化,采用Western blot检测细胞抗活化半胱氨酸蛋白酶蛋白-3抗体(Caspase-3)、抗Bcl-2相关X蛋白抗体(Bax)和抗B细胞淋巴瘤因子-2抗体(Bcl-2)表达情况。选取6~8周龄雌性C57BL/6小鼠30只,随机分为正常对照组、EAE模型组、莱鲍迪甙B干预组,每组各10只。利用MOG_(35-55)多肽皮下注射法构建EAE动物模型。莱鲍迪甙B干预组小鼠于造模后第8天给予腹腔注射莱鲍迪甙B(按体重1 mg/kg),持续15 d。采用HE染色观察小鼠脊髓组织病理学变化,采用Western blot检测脊髓组织Caspase-3、Bax和Bcl-2表达情况,采用透射电镜观察小鼠脑组组织内凋亡小体。结果(1)细胞实验结果:与正常对照组相比,LPS炎症细胞模型组的细胞S期比例下降,细胞核染色质固缩明显,细胞凋亡率上升,Caspase-3表达水平增加,Bax/Bcl-2比值升高(均P<0.01)。与LPS炎症细胞模型组相比,莱鲍迪甙B干预组细胞S期比例上调,细胞核染色质固缩现象改善,细胞凋亡率下降,Caspase-3表达水平降低及Bax/Bcl-2比值降低(均P<0.01)。(2)动物实验结果:与正常对照组相比,EAE模型组小鼠脊髓组织炎症细胞浸润增多,Caspase-3表达水平增加及Bax/Bcl-2比值升高(均P<0.01),小鼠脑组织的细胞形态异常,出现凋亡小体。与EAE模型组小鼠相比,莱鲍迪甙B干预组小鼠脊髓组织Caspase-3表达水平下降及Bax/Bcl-2比值下降(均P<0.01),小鼠脑组织细胞形态基本正常。结论莱鲍迪甙B对EAE模型小鼠具有神经保护作用,其作用机制与莱鲍迪甙B抑制细胞凋亡途径有关。

L-3-正丁苯酞对实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用及其机制

目的 基于RhoA/ROCK信号通路探讨L-3-正丁苯酞(L-3-n-butylphthalide, NBP)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠的疗效及潜在机制。方法 32只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组:对照组、EAE组、NBP低剂量组(L-NBP)和NBP高剂量组(H-NBP),每组8只。使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55, MOG35-55)作为抗原乳剂免疫诱导C57BL/6小鼠建立EAE模型。EAE模型制作成功后,L-NBP组和H-NBP组分别以3.25,6.5 mg/(kg·d)NBP腹腔注射,连续28 d。免疫当日起,每7 d记录各组小鼠的体质量,每天进行神经功能障碍评分;对脊髓组织进行HE染色和劳克坚牢蓝(Luxol fast blue, LFB)染色,观察病理改变;使用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测外周血白细胞介素-10(IL-10)、IL-1β、IL-6和IL-18含量;real time-PCR检测脊髓组织炎症相关因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF受体1(TNFR1)、IL-1β的表达;Western blot检测RhoA、ROCKⅠ及ROCKⅡ蛋白表达情况。结果 与对照组相比,EAE组小鼠体质量下降,神经功能障碍评分、组织病理学评分升高,IL-10含量降低,IL-18、IL-6和IL-1β含量增加,TNF-α、TNFR1及IL-1β mRNA表达升高,RhoA、ROCKⅠ及ROCKⅡ蛋白表达增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与EAE组相比,L-NBP和H-NBP组小鼠体质量增加,发病潜伏期延长,高峰期延迟,神经功能障碍评分、组织病理学评分降低,IL-10含量增高,IL-1β、IL-6和IL-18含量降低,TNF-α、TNFR1及IL-1β mRNA表达降低,RhoA、ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与L-NBP组相比,H-NBP组小鼠体质量增加,发病潜伏期延长,高峰期延迟,神经功能障碍评分、组织病理学评分降低,IL-10含量增高,IL-1β、IL-6和IL-18含量降低,TNF-α、TNFR1和IL-1β mRNA表达降低,RhoA和ROCKⅡ蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 NBP能够减轻EAE小鼠外周及中枢炎症反应,进而改善EAE的神经障碍症状,其作用机制可能是通过抑制RhoA/ROCK信号通路来实现的。

功能化外泌体对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠治疗的研究

目的:探究负载髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)的293F细胞来源的外泌体(EXO)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的治疗效果。方法:利用Western印迹、透射电子显微镜以及Nanosight对超速离心分离的293F细胞上清EXO进行表征;利用流式细胞术和共聚焦显微镜检测细胞摄取EXO的生物学功能;利用EXO特异性锚定肽EXP将MOG抗原肽修饰于EXO表面,流式细胞术检测EXO与MOG抗原肽的结合效率(EXO_(MOG));活体成像检测EXO_(MOG)的体内分布;利用小鼠的临床评分、体重变化以及收样时小鼠脾细胞中调节性T细胞变化和脊髓染色,评估EXO_(MOG)对EAE小鼠的治疗效果;利用组织形态学染色检测EXO_(MOG)治疗对各组小鼠不良反应。结果:超速离心可成功分离EXO,且分离的EXO具有被细胞摄取的生物学功能;EXP外泌体锚定肽介导MOG抗原肽高效负载于EXO表面,且不影响EXO的体内分布;在EAE小鼠上测试结果显示:与未治疗组和MOG组相比,EXO_(MOG)组小鼠治疗后第24天的体重显著增加(P<0.05),行为学评分显著降低(P<0.05),且治疗后小鼠脾脏中CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞显著增高(P<0.05);病理染色结果表明:EXO_(MOG)组小鼠的各组织器官未见明显病理学改变。结论:EXO_(MOG)能够有效缓解小鼠EAE疾病进展且未检测到相关不良反应。

口服烟酰胺核糖抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎的初步研究

目的:探讨口服烟酰胺核糖(nicotinamide riboside,NR)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)的治疗效果和作用机制。方法:采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55,MOG_(35-55))免疫C57BL/6雌性小鼠制备EAE模型,随机分为EAE组和NR组。从免疫后第3天开始,EAE组小鼠灌胃给予生理盐水,NR组小鼠灌胃给予NR,每天1次至免疫后第27天。免疫当天至免疫后第28天,观察并记录各组小鼠临床评分和体重。免疫后第28天处死小鼠,制备脾细胞悬液和脊髓组织冰冻切片。HE染色和髓鞘染色分别检测脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失,Western blot和免疫荧光染色分别检测脊髓组织中ROCK-II、TLR4、p-NF-κB、iNOS表达及相应的阳性细胞数量,ELISA检测脾细胞培养液中TNF-α、IL1β和IL-6的含量。结果:口服NR可推迟EAE发病时间,减轻EAE临床症状,缓解小鼠体重丢失,减少外周炎性细胞浸润脊髓,减轻髓鞘脱失,降低脊髓组织中ROCK-II、TLR4、p-NF-κB及iNOS炎性相关蛋白表达,抑制脾脏炎性因子分泌。结论:口服NR对EAE具有显著的治疗效果,其治疗机制可能与NR抑制EAE的炎症反应有关。

烟酰胺核糖对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠T细胞的免疫调节作用

目的探讨烟酰胺核糖(NR)治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的效果以及对T细胞的免疫调节作用。方法C57BL/6雌性小鼠通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG_(35-55))诱导,制备EAE小鼠模型,随机分为EAE组和NR组。从免疫后第3天到免疫后第27天,EAE组灌胃给予生理盐水,NR组灌胃给予NR,连续给药25 d。从免疫当天到免疫后第28天,记录各组小鼠临床评分和体质量。免疫后第28天处死小鼠,制备脾细胞悬液和脊髓组织冰冻切片。HE染色、髓鞘染色分别检测脊髓炎性细胞浸润和髓鞘脱失,免疫荧光染色检测脊髓CD4^(+)T细胞数量,流式细胞术检测脾脏CD4^(+)T细胞亚群比例,ELISA检测脾细胞培养液中IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17含量。结果与EAE组相比,NR能有效推迟EAE发病时间,缓解EAE临床症状(P<0.05),减少小鼠体质量丢失,抑制外周炎性细胞浸润脊髓(P<0.01),减轻髓鞘脱失(P<0.05),减少脊髓CD4^(+)T细胞数量(P<0.05),下调脾脏CD4^(+)IFN-γ^(+)T细胞、CD4^(+)IL-17^(+)T细胞比例,上调CD4^(+)IL-10^(+)T细胞、CD4^(+)FOXP3^(+)T细胞比例(P<0.05),减少EAE小鼠脾细胞培养液中炎性因子IFN-γ、IL-17分泌,增加抗炎因子IL-4、IL-10分泌(P<0.05)。结论NR可能通过上调EAE小鼠脾脏抗炎型T细胞亚群比例,下调促炎型T细胞亚群比例;促进EAE小鼠脾脏抗炎因子分泌,抑制促炎因子分泌;调节机体免疫平衡,减轻机体炎症反应,改善EAE小鼠临床症状。

小胶质细胞介导的T细胞应答在大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中的致病作用

目的探讨大鼠维持中枢神经系统(CNS)炎症的小胶质细胞、T细胞亚群之间的相互效应关系,以期部分解释实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)中中枢神经系统(CNS)持续存在病理损伤的原因。方法用鼠源性髓鞘碱性蛋白MBP68-86抗原肽制备Lewis大鼠EAE模型,透射电子显微镜观察脑组织超微结构,免疫荧光染色、Western blot、流式细胞术和RT-qPCR检测外周血、脾脏、脑组织中相关分子的表达。结果MBP68-86抗原肽成功制备出EAE模型。流式细胞及免疫荧光分析发现EAE模型组外周血CD4^(+)T(28.01%)、CD8^(+)T(12.81%)细胞的数量及脾脏中MHCⅡ的表达明显上调(P<0.05)。同时,在中枢神经系统中小胶质细胞的CD86^(+)CD206^(-)M1样巨噬细胞的数量明显多于CD86^(-)CD206^(+)M2样巨噬细胞。Western blot和RT-qPCR结果显示EAE模型组小胶质细胞及脑组织中MHCI、IL-10、TGF-β、CD32b,Granzyme B、Perforin、FASL分子表达明显上调(P<0.05)。结论大鼠EAE免疫应答过程中,CNS存在一个由CTL和Th2细胞共同参与的免疫应答环路,这可能是维持MS/EAE时间-空间多发性的主要机制。

苦参素对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的改善作用及机制

目的探讨苦参素能否通过调控铁死亡途径发挥对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的改善作用。方法将30只雌性C57BL/6小鼠随机分为正常组、模型组、苦参素组,每组10只。模型组和苦参素组小鼠以含灭活结核分枝杆菌和MOG35-55的抗原乳剂诱导复制EAE模型。苦参素组小鼠自免疫后第7天开始腹腔注射苦参素注射液(50 mg/kg),正常组和模型组小鼠腹腔注射等体积生理盐水,每天1次至免疫后第18天。记录各组小鼠的神经功能学评分,以苏木精-伊红染色法和勒克斯光蓝染色法分别观察脊髓组织炎症细胞浸润和髓鞘脱失情况,以定量逆转录聚合酶链反应法和Western blot法分别检测其转铁蛋白受体1(TFR1)、核受体共激活因子4(NCOA4)、膜铁转运辅助蛋白(Heph)m RNA和胱氨酸-谷氨酸反向转运体(xCT)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)蛋白的表达情况。结果与正常组比较,模型组小鼠的累计神经功能学评分显著升高(P<0.01),脊髓组织内炎症细胞浸润和髓鞘脱失现象明显,相关评分均显著升高(P<0.01),髓鞘组织中TFR1、NCOA4 mRNA的表达均显著上调,Heph mRNA和xCT、GPx4蛋白的表达均显著下调(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,苦参素组小鼠上述指标均显著改善(P<0.05或P<0.01)。结论苦参素对EAE小鼠有一定的改善作用,且这种作用可能与调节铁死亡中的铁代谢途径和xCT/GPx4通路有关。

红细胞膜相关蛋白通过IL-6/STAT3/ROR-γt信号通路抑制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中Th17细胞分化

目的探讨小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型中,外源性和内源性红细胞膜相关蛋白(ERMAP)通过白细胞介素6/信号转录及转录激活因子3(IL-6/STAT3)/维甲酸相关孤核受体γt/(ROR-γt)信号通路对辅助性T细胞17(Th17)细胞分化的影响。方法流式细胞术验证不同浓度ERMAP-Ig融合蛋白功能;琼脂糖凝胶电泳鉴定ERMAP基因敲除小鼠。流式细胞术检测ERMAP-Ig融合蛋白在体外对Th17细胞分化影响。40只6周龄普通C57BL/6小鼠随机分为2组建立EAE模型:对照(control)-Ig和ERMAP-Ig组,每组20只;记录临床评分;流式细胞术检测EAE小鼠体内Th17细胞分化情况。40只6周龄已鉴定的野生型和ERMAP基因敲除小鼠分为2组建立EAE模型:ERMAP^(+/+)和ERMAP^(-/-)组,每组20只。记录临床评分;脊髓HE和固蓝(LFB)染色并进行组织学半定量评分。流式细胞术检测IL-17A+CD4+T细胞百分比;Western blotting检测IL-6、白细胞介素17(IL-17)、STAT3、磷酸化STAT3(p-STAT3)、ROR-γt蛋白水平表达;Real-time PCR检测IL-17、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6、STAT3和ROR-γt的mRNA表达;ELISA检测细胞水平IL-17和TNF-α的表达。结果1.外源性ERMAP-Ig融合蛋白抑制体内外Th17细胞分化且减轻小鼠EAE症状。2.与对照组相比,ERMAP^(-/-)组EAE小鼠炎性浸润和脱髓鞘症状加重,Th17分泌IL-17A增加。3.内源性ERMAP基因敲除后,IL-17、TNF-α、IL-6、STAT3及ROR-γt表达均增加。差异均有统计学意义(P<0.05)。结论ERMAP可能通过IL-6/STAT3/ROR-γt信号通路调控Th17细胞分化,参与小鼠EAE发生发展。

羟基法舒地尔对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠氧化应激的影响

目的:探究羟基法舒地尔(HF)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠氧化应激的影响及可能机制。方法:将BV2细胞随机分为正常对照组、LPS组和LPS+HF组。HF预处理2 h后给予LPS刺激24 h,收取细胞上清液。将16只C57BL/6小鼠随机平均分为EAE组和HF组。HF组小鼠于免疫后第3天起以HF腹腔注射干预,剂量40 mg/(kg·d)。EAE组小鼠注射等量生理盐水。从免疫当天开始,每隔1 d记录小鼠的临床评分。DPPH法和ABTS法检测不同浓度HF对自由基的清除作用。MTT法检测BV2细胞在不同浓度HF的干预下细胞活力的改变。HE和LFB染色检测脊髓炎症和髓鞘脱失。ELISA检测细胞上清液和小鼠脊髓中RNS、ROS、MDA、SOD、CAT和GSH-Px含量。免疫荧光染色和Western blot检测小鼠脊髓中Nrf2、HO-1表达。结果:HF在3.75~60μg/ml浓度范围内对DPPH和ABTS自由基几乎没有清除作用,在0~15μg/ml浓度范围内对BV2细胞活力没有影响,HF可抑制EAE小鼠的临床症状,改善脊髓炎症和髓鞘脱失,减少氧化产物ROS、RNS和MDA产生,增加抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px表达,同时促进小鼠脊髓Nrf2和HO-1表达。结论:HF抑制EAE小鼠的临床症状,减少中枢神经系统内炎症浸润和髓鞘脱失,其机制可能与HF激活Nrf2/HO-1信号通路,抑制EAE小鼠的氧化应激有关。

五子衍宗方免煎颗粒对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎性反应的影响及机制

目的探讨五子衍宗方免煎颗粒对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠炎性反应的影响及机制。方法将C57BL/6雌性小鼠随机分为正常组、模型组及五子衍宗方组(五子衍宗方免煎颗粒,16 g·kg^(-1)·d^(-1)),每组12只。采用皮下注射抗原乳剂[髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽35-55(MOG35-55)+结核分枝杆菌]结合腹腔注射百日咳毒素制备EAE小鼠模型。从免疫后第3天开始灌胃给药,每天2次,持续干预25 d。每日进行神经功能评分;采用HE染色法检测脊髓炎性细胞浸润情况;LFB染色法检测脊髓髓鞘脱失情况;ELISA法检测小鼠脾细胞上清液中炎性因子干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-17、IL-12、IL-6及IL-1β水平;qRT-PCR法检测小鼠脾细胞TLR4、TNF-αmRNA表达情况;Western Blot法检测小鼠脾脏ROCKII、P-MYPT1及NF-κB蛋白表达情况。结果与正常组比较,模型组小鼠神经功能评分显著升高(P<0.05,P<0.01);脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失显著增加(P<0.01);脾细胞IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-12、IL-6及IL-1β的表达水平显著上升(P<0.001),TLR4、TNF-αmRNA表达显著上调(P<0.01,P<0.001);脾脏组织ROCKII、P-MYPT1、NF-κB蛋白表达量显著升高(P<0.01,P<0.001)。与模型组比较,五子衍宗方组小鼠神经功能评分显著降低(P<0.05,P<0.01);脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失显著减少(P<0.01);脾细胞IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-12、IL-6及IL-1β的表达水平显著降低(P<0.01,P<0.001),TLR4、TNF-αmRNA表达显著下调(P<0.01,P<0.001);脾脏组织ROCKII、P-MYPT1、NF-κB蛋白表达量均显著降低(P<0.01)。结论五子衍宗方免煎颗粒能够改善EAE小鼠的神经功能,减少炎症浸润及脱髓鞘等病理损害,具有神经保护作用,其作用机制可能与抑制Rho及NF-κB信号通路,降低相关炎性因子水平有关。

实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠模型的构建

目的 通过髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG_(35-55))多肽两次免疫C57BL/6J小鼠,构建实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型。方法 将8周龄C57BL/6J雌性小鼠按随机数字表法分为EAE组和对照组,每组10只。EAE组采用MOG_(35-55)多肽与完全弗式佐剂混合后的抗原乳剂,于小鼠双侧腹股沟和后肢分4点皮下注射,首次免疫后6 d注射相同剂量的抗原乳剂加强免疫,并且于首次免疫后0、48 h腹腔注射百日咳毒素;对照组采用不含MOG_(35-55)多肽的CFA,其余方法同EAE组。观察两组小鼠的行为学表现并进行神经功能评分;免疫后第19天,取两组小鼠的脑和脊髓组织进行Black Gold髓鞘染色和髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫荧光染色,检测其脱髓鞘情况;小胶质细胞特异性标志物(Iba-1)免疫荧光染色检测两组脑和脊髓组织中小胶质细胞的增殖活化情况。结果 EAE组小鼠在首次免疫后第12天左右开始发病,第19天症状达到高峰,随后开始缓解,发病率为100%,而对照组小鼠只在首次免疫后第14天出现短暂的尾巴无力症状。Black Gold髓鞘染色和MBP免疫荧光染色显示,EAE组小鼠脑和脊髓均出现脱髓鞘;Iba-1免疫荧光染色显示,EAE组小鼠脑和脊髓均出现小胶质细胞增殖活化;而对照组小鼠脑和脊髓并未出现脱髓鞘和小胶质细胞的增殖活化。结论 MOG_(35-55)两次免疫C57BL/6J小鼠,成功构建发病率高的EAE模型,为多发性硬化症的致病机制研究和药物开发奠定基础。

PM2.5短期暴露诱导免疫耐受缓解实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用研究

目的:建立PM2.5短期暴露自身免疫性疾病动物模型,探讨PM2.5的“暴露时间窗”对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发生发展的作用机制。方法:完全弗氏佐剂混合MOG35-55免疫6周龄雌性C57BL/6小鼠构建EAE模型。对EAE小鼠进行PM2.5短期暴露,每天观察小鼠临床发病情况。组织学分析结合流式细胞术评估PM2.5短期暴露影响疾病发展的作用机制。结果:EAE小鼠临床评分显示,PM2.5短期暴露可显著延迟疾病发生发展。与对照组相比,PM2.5短期暴露组小鼠中枢神经系统(CNS)中观察到炎症和脱髓鞘显著减少。PM2.5短期暴露小鼠中枢及外周中激活的树突状细胞、巨噬细胞及致病性Th17细胞比例显著降低,有效抑制了CNS及外周炎症。结论:短期暴露于PM2.5环境对EAE小鼠病情具有一定缓解作用,可能通过抑制免疫细胞过度活化、诱导免疫耐受实现,阐明其机制可为自免疫疾病发病机制研究提供依据。

紫杉醇对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠细胞焦亡的影响及其机制的研究

目的探讨紫杉醇(PTX)通过抑制NLRP3/caspase-1通路减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠细胞焦亡的影响机制。方法将50只雌性C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、EAE模型组及PTX低、中、高剂量组,每组10只。除正常对照组外,其余组建立EAE模型。PTX低、中、高剂量组每日分别腹腔注射PTX1、2、4 mg/(kg·d),正常对照组和EAE模型组腹腔注射等量生理盐水,连续14 d。从免疫当日开始,每日定时观察并记录小鼠体质量变化、精神、活动情况及进行神经功能障碍评分;对各组脊髓组织进行尼氏染色和LFB染色观察病理改变;荧光定量PCR(qPCR)检测脊髓组织NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)及胱天蛋白酶(caspase)-1 mRNA表达水平。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测外周血白细胞介素(IL)-18和IL-1β含量。结果正常对照组小鼠无明显症状,EAE模型组和PTX低、中、高剂量组体质量下降、活动减少、反应迟钝。与EAE模型组相比,PTX各剂量组发病潜伏期延长,高峰期延迟,神经功能障碍评分降低(P<0.05),脊髓组织尼氏小体数量增多且相对规则,脱髓鞘、空泡改变减轻,外周血IL-18、IL-1β含量降低,NLRP3、caspase-1 mRNA表达水平降低(P<0.05);PTX剂量越高,发病潜伏期和高峰期延迟越明显;脊髓组织尼氏小体数量增多,排列及形态更规则,脱髓鞘及空泡改变越轻,外周血IL-1β、IL-18含量越低,caspase-1 mRNA表达水平越低(P<0.05)。结论PTX可能通过抑制细胞焦亡,减轻EAE小鼠炎症反应,其机制可能与抑制NLRP3/caspase-1通路有关。

毛蕊异黄酮通过Cyt-C/Apaf-1信号通路抑制实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢神经细胞凋亡

目的:观察毛蕊异黄酮(CA)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠中枢神经细胞凋亡的影响,并探索其可能的作用机制。方法:取45只C57BL/6小鼠,随机选取10只作为假手术组,剩余小鼠建立EAE模型,建模成功后随机分为EAE组(10只)、CA组(10只)、联合组(11只)。联合组腹腔注射CA(20 mg/kg),尾静脉注射细胞色素C(Cyt-C)激动剂抗霉素A(AA,100μg/kg);CA组腹腔注射CA(20 mg/kg),尾静脉注射等体积PBS;假手术组、EAE组腹腔注射等体积PBS,尾静脉注射等体积PBS,1次/d,持续14 d。进行神经障碍评分;检测脊髓组织三磷酸腺苷(ATP)含量;透射电镜观察线粒体超微结构;Tunel染色观察脊髓神经细胞凋亡;HE染色观察脊髓病理改变;Western blot检测脊髓组织Cyt-C、凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)蛋白表达。结果:与EAE组比较,CA组小鼠神经障碍评分、脊髓神经细胞凋亡率、Cyt-C、Apaf-1蛋白表达降低,脊髓组织ATP水平升高(P<0.05);与CA组比较,联合组小鼠神经障碍评分、脊髓神经细胞凋亡率、Cyt-C、Apaf-1蛋白表达升高,脊髓组织ATP水平降低(P<0.05)。结论:CA可减少EAE小鼠中枢神经细胞凋亡,促进脊髓损伤修复,减轻线粒体损伤,可能通过抑制Cyt-C/Apaf-1信号通路发挥作用。

黄芩素对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠发病的神经保护作用机制

目的探讨黄芩素(BAI)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠的神经保护作用和其对中枢神经系统(CNS)脊髓组织中自噬水平和小胶质细胞(MG)激活、极化的影响。方法将50只SPF级雌性C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为正常对照组、EAE模型组及BAI低、中、高剂量组,每组10只。EAE模型组及BAI各剂量组诱导建立EAE模型,正常对照组不做干预。自建模日起,BAI低、中、高剂量组每日分别给予BAI 75、150、300 mg/kg灌胃,其余两组给予等体积等渗盐水灌胃,连续14 d。观察小鼠的神经功能缺损和脊髓组织炎性浸润情况。采用免疫印迹法检测小鼠脊髓组织中自噬相关蛋白:哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、微管相关蛋白1轻链3(LC3)及核孔糖蛋白62(p62)的表达情况。免疫荧光染色法检测小鼠脊髓组织离子钙接头蛋白1(Iba-1)阳性MG的活化情况和形态变化。结果正常对照组小鼠未见发病,其余各组小鼠均有发病,但未出现死亡。与EAE模型组比较,BAI各剂量组小鼠发病潜伏期延长,进展期缩短,神经功能缺损评分降低(P<0.05),脊髓组织炎症浸润程度减轻,mTOR蛋白表达增加,p-mTOR蛋白表达减少,自噬标志物LC3II/LC3I灰度比值增大,p62蛋白表达减少(P<0.05),随着BAI干预剂量增大,效果越明显。并且,显微镜下观察正常对照组荧光图中可见少许绿染的Iba-1阳性MG细胞散在分布,其胞体较小可见分枝状轴突,与正常对照组Iba-1的IOD值(332.99±64.07)及Iba-1阳性MG计数(4.33±0.58)相比,EAE模型组Iba-1的IOD值(8725.87±817.70)明显升高(P<0.05),Iba-1阳性MG计数(32.33±2.52)明显增多(P<0.05),细胞形态表现为胞体较大,轴突缩短。与EAE模型组相比,BAI低、中、高各剂量组Iba-1的IOD值(5773.02±830.07、2307.99±255.90、1304.43±229.51)逐渐降低,MG计数(25.33±3.51、14.33±1.53、8.67±1.10)逐渐减少(均P<0.05),细胞胞体变小,胞突伸长。结论BAI对EAE小鼠发病具有神经保护作用,且呈剂量依赖性,其可能的机制为BAI可通过抑制mTOR通道蛋白激活,诱导自噬增强,抑制MG过度活化,促进MG向M2型极化,从而抑制炎症反应,对EAE小鼠产生神经保护作用。

竹节香附素A对实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠炎症的影响及其调控机制研究

目的探讨竹节香附素A(RA)对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠炎症的影响及其调控机制。方法将60只C57BL/6小鼠随机分为对照组、EAE模型组、RA低剂量组、RA中剂量组、RA高剂量组,其中EAE模型组、RA低剂量组、RA中剂量组、RA高剂量组使用MOG35-55多肽复制EAE模型,RA低剂量组、RA中剂量组、RA高剂量组进行药物干预,持续至发病高峰期。观察各组小鼠的临床症状、神经功能缺损评分,HE染色检测脊髓组织炎症细胞浸润情况,Western blotting检测脊髓组织p-NF-κB蛋白表达,酶联免疫吸附试验检测脊髓组织白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-17表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应检测脊髓组织IL-1β和IL-17 mRNA表达。结果高剂量组发病潜伏期较RA低剂量组、RA中剂量组、EAE模型组长(P<0.05),RA中剂量组较RA低剂量组、EAE模型组长(P<0.05),RA低剂量组较模型组长(P<0.05)。高剂量组疾病进展期较RA低剂量组、RA中剂量组、EAE模型组短(P<0.05),RA中剂量组较RA低剂量组、EAE模型组短(P<0.05),RA低剂量组较EAE模型组短(P<0.05)。高剂量组神经功能缺损评分较RA低剂量组、RA中剂量组、EAE模型组低(P<0.05),RA中剂量组较RA低剂量组、EAE模型组低(P<0.05),RA低剂量组较EAE模型组低(P<0.05)。RA高剂量组HE染色评分较RA低剂量组、RA中剂量组和EAE模型组低(P<0.05),RA中剂量组较RA低剂量组、EAE模型组低(P<0.05),RA低剂量组较EAE模型组低(P<0.05)。对照组脊髓组织IL-1β和IL-17 mRNA相对表达量低于RA低剂量组、RA中剂量组、RA高剂量、EAE模型组(P<0.05),RA高剂量组低于RA低剂量组、RA中剂量组、EAE模型组(P<0.05),RA中剂量组低于RA低剂量组、EAE模型组(P<0.05),RA低剂量组低于模型组(P<0.05)。对照组脊髓组织IL-1β、IL-17相对表达量低于RA低剂量组、RA中剂量组、RA高剂量、EAE模型组(P<0.05),RA高剂量组低于RA低剂量组、RA中剂量组、EAE模型组(P<0.05),RA中剂量组低于RA低剂量组、EAE模型组(P<0.05),RA低剂量组低于EAE模型组(P<0.05)。对照组脊髓组织NF-κB蛋白磷酸化水平低于RA低剂量组、RA中剂量组、RA高剂量组、EAE模型组(P<0.05),RA高剂量组低于RA低剂量组、RA中剂量组和EAE模型组(P<0.05),RA中剂量组低于RA低剂量组和EAE模型组(P<0.05);RA低剂量组低于EAE模型组(P<0.05)。结论RA能改善EAE小鼠发病情况及脊髓组织炎症,其机制可能与通过调节NF-κB,减少炎症因子分泌有关。

PKA干预淫羊藿苷治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎对中枢神经CREB表达的影响

目的研究淫羊藿苷(ICA)治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)对环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)的影响,并探讨ICA 治疗的作用机制。方法复制C57BL/6 小鼠EAE 模型,并将其分为3 组,每组6 只。模型对照组:予生理盐水3 ml/d 灌胃;ICA 组:予以ICA 300 mg/(kg·d)灌胃;ICA+H89 组:予以ICA 300 mg/(kg·d)灌胃并予以蛋白激酶A(PKA)特异性阻断剂H89 5 mg/(kg·d)腹腔注射;另取6 只未经模型复制的C57BL/6 小鼠同等条件下饲养作为正常对照组,予生理盐水3 ml/d 灌胃。EAE 小鼠在发病达高峰时开始给药,1 次/d,连续给药5 d。每日进行神经损害评分,至给药结束后次日。给药结束后次日进行神经损害评分后处死小鼠,立即采集脊髓颈膨大部分进行Western blotting 检测,检测CREB 的表达。结果 ICA 组小鼠神经损害表现明显改善,与治疗前比较差异有统计学意义(P <0.05),而ICA+H89 组小鼠及模型对照组小鼠神经损害评分均无改善,治疗前后比较差异无统计学意义(P >0.05)。模型对照组脊髓组织中CREB 的表达较正常对照组降低(P <0.05)。ICA 组治疗后CREB 的表达与模型对照组比较,差异有统计学意义(P <0.05),ICA 组CREB 的表达升高。但同时给予ICA 与H89 治疗的小鼠并不能提高脊髓组织中CREB 的表达,与模型组比较差异无统计学意义(P >0.05)。结论 ICA 可能是通过PKA 途径提高中枢神经系统中CREB 的表达,从而发挥对EAE 的治疗作用。

抗CV2/CRMP5抗体阳性副肿瘤性脑脊髓炎合并神经精神狼疮一例

1病例报告,患者女,55岁,小学文化水平。因“反应迟钝5 d,双下肢无力1 d”于2021-3-19入院。5 d前无诱因出现反应迟钝,表现为记忆力下降,偶有答非所问但能正常交流,病程中伴有吞咽困难、头晕、视物旋转、言语笨拙,可疑抽搐发作(全面强直发作)1次。