雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响

目的探讨雷公藤红素在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠眼组织中的抗炎作用及其对小胶质细胞极化的影响。方法取健康6~8周龄B10.RIII小鼠36只,随机分为正常对照组、EAU溶剂对照组、雷公藤红素干预组,每组12只。将光感受器间维生素A类结合蛋白161-180和完全弗氏佐剂充分乳化混合后,注射于EAU溶剂对照组和雷公藤红素干预组小鼠双侧大腿和尾部皮下,总体积200μL,每只小鼠注射光感受器间维生素A类结合蛋白161-180的量为50μg。免疫后第7-14天,雷公藤红素干预组小鼠每天接受0.5 mg·kg^(-1)雷公藤红素腹腔注射治疗,EAU溶剂对照组小鼠注射同等剂量的无菌PBS缓冲溶液。免疫后第14天,通过裂隙灯显微镜观察各组小鼠眼前节表现及行组织切片HE染色,并参照Caspi分级标准对各组小鼠进行临床评分及组织病理学评分;免疫荧光染色观察小鼠眼内小胶质细胞活化情况;Western blot检测小鼠视网膜中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶-1(Arg1)蛋白表达水平;qRT-PCR检测小鼠视网膜中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6 mRNA相对表达量。采用Graphpad Prism 9.0统计软件进行数据分析。结果免疫后第14天,通过裂隙灯显微镜观察发现,EAU溶剂对照组小鼠眼前节可见虹膜血管扩张充血明显、角膜水肿、前房渗出;而雷公藤红素干预组小鼠眼前节炎症明显减轻,可见虹膜血管轻度充血。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠临床评分均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。雷公藤红素干预组小鼠临床评分低于EAU溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色结果显示,免疫后第14天,EAU溶剂对照组小鼠出现严重的视网膜皱褶和脱离,炎症细胞弥漫浸润;而雷公藤红素干预组小鼠视网膜结构破坏轻微,可见少量炎症细胞浸润。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组与雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。雷公藤红素干预组小鼠组织病理学评分低于EAU溶剂对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、EAU溶剂对照组、雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞密度分别为(1.00±0.12)%、(36.07±4.57)%、(1.83±0.36)%,与正常对照组相比,EAU溶剂对照组及雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞数增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠眼内Iba1+细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组小鼠视网膜中iNOS、Arg1蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.01);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠视网膜中iNOS蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与正常对照组相比,EAU溶剂对照组小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与EAU溶剂对照组相比,雷公藤红素干预组小鼠视网膜中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA相对表达量均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论雷公藤红素可抑制M1型小胶质细胞活化,减少EAU小鼠视网膜炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的产生,减轻炎症反应。

衣康酸二甲酯对树突状细胞分泌促炎因子以及实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠辅助性T细胞17的影响

目的探究衣康酸二甲酯(DMI)对树突状细胞(DCs)分泌促炎因子的作用,并初步研究其对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠光感受器间维生素A类结合蛋白1-20(IRBP_(1-20))特异性辅助性T细胞17(Th17)的影响。方法分离C57BL/6J小鼠双侧股骨和胫骨得到骨髓细胞,利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素(IL)-4将其定向诱导分化为骨髓来源的DCs。诱导分化6 d,将细胞分为DMI组和PBS组,分别用250μmol·L^(-1)DMI及等量的磷酸盐缓冲液(PBS)预处理3 h后,每组加入100μg·L^(-1)脂多糖(LPS)刺激24 h。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测两组DCs中促炎因子IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA相对表达量。采用IRBP_(1-20)、弗氏不完全佐剂及结核分枝杆菌H37RA主动免疫小鼠构建EAU模型,免疫后13 d,将分离的EAU小鼠脾脏及淋巴结T细胞与PBS或DMI处理的DCs在含有IRBP_(1-20)的培养基中共培养,并向Th17方向极化。流式细胞仪检测共培养细胞中Th17细胞比例。ELISA检测共培养上清液中IL-17水平。qRT-PCR检测共培养细胞中维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、IL-17、IL-23R和GM-CSF mRNA相对表达量。结果qRT-PCR检测结果显示,DMI组DCs中IL-6、IL-1β和IL-23 mRNA相对表达量均明显低于PBS组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,DMI组共培养细胞中Th17细胞比例明显低于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA检测结果显示,DMI组共培养上清液中IL-17水平明显低于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。DMI组共培养细胞中IL-17、RORγt、IL-23R和GM-CSF mRNA相对表达量均明显低于PBS组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论DMI能够抑制DCs中促炎因子IL-6、IL-1β和IL-23的表达,进而负向调控IRBP_(1-20)特异性Th17细胞反应。

芍药苷调节RhoA/ROCK信号通路对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠Th17/Treg免疫平衡的影响

目的探讨芍药苷调节Ras同源基因家族蛋白A(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)信号通路对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)小鼠辅助性T淋巴细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)免疫平衡的影响。方法随机选出10只小鼠作为正常对照组,其余小鼠构建EAU模型,将造模成功小鼠随机平分为模型组、芍药苷组(10 mg·kg^(-1)芍药苷)、RhoA/ROCK信号通路激活剂溶血磷脂酸(LPA)组(25μmol·L^(-1)LPA)、芍药苷+LPA组(10 mg·kg^(-1)芍药苷+25μmol·L^(-1)LPA),每组10只。模型组和正常对照组给予等量生理盐水,给药每天1次,持续14 d。眼前节临床表现评分评估炎症严重程度;HE染色观察眼球组织病理形态;ELISA法检测血清中炎性因子转化生长因子-β(trarsforming growth factor beta,TGF-β)、白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素17(IL-17)、白细胞介素23(IL-23)水平;流式细胞术检测脾脏Th17/Treg细胞水平;Western Blot法检测维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、叉头状转录因子3(Foxp3)以及RhoA/ROCK信号通路蛋白表达。结果正常对照组小鼠无虹膜、结膜血管舒张充血,与正常对照组比,模型组小鼠出现虹膜血管舒张充血,前房、虹膜、睫状体和视网膜内均有大量炎性细胞膨胀,眼前节临床表现评分、IL-17和IL-23含量、Th17细胞水平、Th17/Treg、RORγt、RhoA、ROCK1蛋白水平明显升高(P<0.05),IL-10和TGF-β含量、Treg细胞水平、Foxp3水平明显下降(P<0.05)。与模型组比,芍药苷组小鼠虹膜血管充血症状明显缓解,眼前节临床表现评分、IL-17和IL-23含量、Th17细胞水平、Th17/Treg、RORγt、RhoA、ROCK1蛋白水平明显降低(P<0.05),IL-10和TGF-β含量、Treg细胞水平、Foxp3水平明显升高(P<0.05);而LPA加重了眼部损伤(P<0.05),逆转了芍药苷对EAU小鼠的改善效果(P<0.05)。结论芍药苷可通过下调RhoA/ROCK信号通路调节EAU小鼠Th17/Treg免疫平衡减轻EAU小鼠葡萄膜炎。

hUMSCs外分泌蛋白治疗实验性自身免疫性葡萄膜炎模型大鼠的机制初探

目的:探讨腹腔注射人脐带间充质干细胞外分泌蛋白(hUMSCs-S)治疗实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)模型大鼠的可能性及其相关作用机制。方法:6~8周龄Lewis大鼠72只,用随机数字表分方法均分为3组,分别为正常对照(CTRL)组、EAU模型组及hUMSCs-S治疗组,每组24只。EAU组与hUMSCs-S组大鼠采用光感受器间维生素A结合蛋白(IRBP)联合弗氏完全佐剂建立EAU模型,hUMSCs-S组大鼠在建模的同时予以腹腔注射hUMSCs-S,EAU组及CTRL组大鼠均腹腔注射等量PBS。裂隙灯显微镜拍摄记录各组大鼠眼前段情况,根据Caspi评分标准评价眼前段炎症程度;于免疫后第7天(初发期)、14天(高峰期)、21天(恢复期)取眼球组织制成石蜡切片进行HE染色、免疫组化及免疫荧光染色,分别用于眼球组织病理学评分、前房浸润细胞情况评估,观察眼球组织中CD3^(+)T细胞及紧密连接蛋白ZO-1的表达。无菌操作下采腹主动脉血,制备血清,行ELISA法检测各组大鼠血清中白细胞介素10(IL-10)和IL-17的浓度。结果:(1)通过裂隙灯显微镜观察和比较,EAU组大鼠出现明显眼前段炎症反应,在建模后第11~17天,hUMSCs-S治疗有降低眼前段Caspi评分的作用(P<0.05);(2)眼球组织切片HE染色结果显示,建模后第14天,hUMSCs-S组大鼠虹膜睫状体和视网膜结构破坏及前房炎细胞浸润数量均低于EAU组(P<0.05);(3)眼球组织切片免疫组化及免疫荧光染色结果显示,hUMSCs-S组大鼠虹膜睫状体、前房和视网膜中CD3^(+)T细胞浸润较EAU组减少,视网膜及视网膜色素上皮(RPE)层ZO-1表达量较EAU组增加;(4)ELISA法检测大鼠外周血血清IL-17及IL-10浓度结果显示,与EAU组相比,hUMSCs-S组大鼠外周血IL-17表达下降、IL-10表达增加(P<0.05)。结论:hUMSCs外分泌蛋白对EAU模型大鼠治疗有效;腹腔注射hUMSCs外分泌蛋白可影响EAU大鼠外周血中炎症因子表达,减少眼内炎症细胞浸润,减轻RPE层紧密连接蛋白的破坏程度。

祛风明目丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠NLRP3、ASC、IL-1β表达的影响

目的探讨祛风明目丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)大鼠房水及视网膜组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)、接头蛋白凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis related spot like protein,ASC)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)表达的影响。方法将70只SPF级雄性Lewis大鼠按随机数字表法取19只为空白组,其余为造模组,进行主动免疫,建立EAU大鼠模型,连续造模7 d后分别从造模组及空白组随机抽取3只大鼠取眼球行HE染色,进行组织病理学检查;将造模成功的EAU大鼠随机分为模型组、祛风明目丸低剂量组(简称低剂量组)和祛风明目丸正常剂量组(简称正常剂量组),每组16只。空白组、模型组予以蒸馏水灌胃,低剂量组和正常剂量组予以不同剂量的祛风明目丸药液灌胃,均干预14 d。自造模开始,每天于裂隙灯下观察眼前节变化,并采用Caspi临床分级标准评分;自灌胃起14 d后,ELISA检测房水中NLRP3、IL-1β水平,Western blot检测视网膜组织中ASC、NLRP3蛋白水平。结果Caspi临床分级评分结果示,自造模第3天起造模组评分均明显高于空白组(P<0.01),说明EAU模型制备成功。ELISA结果显示,与空白组相比,模型组房水中NLRP3、IL-1β水平升高(P<0.05);与模型组相比,正常剂量组及低剂量组两者含量均降低(P<0.05);正常剂量组与低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示,与空白组相比,模型组视网膜组织中ASC、NLRP3蛋白表达水平升高(P<0.05);与模型组相比,正常剂量组及低剂量组视网膜组织中ASC、NLRP3蛋白表达含量均下降(P<0.05);与正常剂量组相比,低剂量组视网膜组织ASC、NLRP3蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论祛风明目丸可能通过降低NLRP3炎症小体及下游炎症因子的表达对EAU大鼠发挥一定的治疗作用。

利妥昔单抗对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠的抗炎作用及其机制

目的探讨利妥昔单抗(RTX)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠的抗炎作用及其机制。方法取SPF级6~8周龄健康雌性C57BL/6J小鼠27只,使用光感受器间维生素A类结合蛋白1\|20(IRBP 1-20)建立EAU小鼠模型,将EAU小鼠随机分为PBS对照组、50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组,每组各9只小鼠,PBS对照组小鼠腹腔注射PBS,50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组小鼠每千克体重分别腹腔注射50 mg RTX和100 mg RTX。造模后第21天,对各组小鼠进行眼底图像的采集与视网膜组织HE切片的制作,通过小动物视网膜成像仪采集各组小鼠眼底图像并参照Caspi临床评分标准进行炎症评分,将HE染色切片置于显微镜下观察并进行拍照,参照Caspi组织病理学评分标准进行评分。采用实时荧光定量PCR检测各组小鼠视网膜组织白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-4和IL-10的mRNA相对表达量。采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。结果眼底图像显示:PBS对照组EAU小鼠眼底出现多发性血管炎,血管扩张,视网膜脉络膜出现多发病灶及少量线样病变;50 mg·kg^(-1) RTX实验组EAU小鼠眼底发生轻度血管炎,视网膜出现个别局部病灶,无线样病变;100 mg·kg^(-1) RTX实验组EAU小鼠视网膜局部出现个别病灶,无线样病变。PBS对照组、50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组EAU小鼠眼底图像Caspi临床评分分别为(1.944±0.808)分、(1.667±0.791)分、(1.667±0.829)分,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。PBS对照组、50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组EAU小鼠视网膜组织病理学评分分别为(1.563±1.116)分、(1.063±0.623)分、(1.250±0.655)分,三组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。实时荧光定量PCR检测结果显示,50 mg·kg^(-1) RTX实验组和100 mg·kg^(-1) RTX实验组小鼠视网膜组织IL-6、IL-10 mRNA相对表达量以及IL-10/IL-6比值均高于PBS对照组(均为P<0.05);100 mg·kg^(-1) RTX实验组小鼠视网膜组织IL-6、IL-10 mRNA相对表达量以及IL-10/IL-6比值均高于50 mg·kg^(-1) RTX实验组(均为P<0.05)。结论腹腔注射RTX可一定程度缓解EAU小鼠视网膜组织的炎性病变,其机制可能与RTX提高小鼠视网膜组织IL-10/IL-6比值有关。

实验性自身免疫性葡萄膜炎青紫蓝兔模型的建立及其特点比较

目的评价2种方法诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)青紫蓝兔模型的发生过程及特点。方法42只青紫蓝兔随机分为对照组(CG)6只、模型1组(MG1)18只、模型2组(MG2)18只。CG组不做任何处理;MG1组使用结核分枝杆菌H37Ra与弗氏完全佐剂的混悬液皮下注射进行预先免疫,19 d后右眼玻璃体腔注射结核分枝杆菌H37Ra建立EAU模型;MG2组采用牛血清白蛋白(BSA)耳缘静脉及玻璃体腔二次注射法建立EAU模型。所有动物分别于完成免疫后第1、4、7、14、21、28天行裂隙灯显微镜、前置镜、眼前节照相、眼B超、眼底照相观察眼部情况,根据自拟的EAU青紫蓝兔模型症状评分标准进行症状评分。结果(1)发病时间与周期:MG1组所有青紫蓝兔在完成诱导后第1天均初发炎症,第4天炎症达到高峰,第7天开始逐渐消退,症状持续4周以上。MG2组13只(72.22%)青紫蓝兔在完成诱导后第1天初发炎症,第4天炎症达到高峰,之后炎症开始逐渐消退,以眼前段炎症为主,症状持续4周以上;其余5只(27.78%)初发症状时间及症状高峰时间不一。(2)症状表现:2组青紫蓝兔眼部表现均为混合充血、角膜水肿、前房炎症及渗出、瞳孔受损、玻璃体混浊、视网膜出血。(3)症状评分:与CG组比较,MG1、MG2组青紫蓝兔各时间眼部症状评分均升高(MG1:t_(1d)=12.550,t_(4d)=12.620,t_(7d)=14.090,t_(14d)=11.610,t_(21d)=12.530,t_(28d)=41.470,均P=0.000。MG2:t_(1d)=2.600,P=0.016;t_(4d)=7.293,t_(7d)=8.354,t_(14d)=7.410,t_(21d)=6.843,t_(28d)=7.397,均P=0.000);与MG1组比较,MG2组青紫蓝兔诱导后第1、4天眼部症状评分降低(t_(1d)=4.062,P=0.000;t_(4d)=2.359,P=0.024),差异均有统计学意义。其余时间2组间眼部症状评分比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论2种EAU青紫蓝兔模型其眼部表现与人类葡萄膜炎相似,MG1的初发炎症时间、炎症高峰时间、炎症严重程度及炎症变化趋势均一致。MG1较MG2的稳定性更好,可重复性更强,可作为理想的全葡萄膜炎研究的动物模型。

c-Myc抑制剂10058-F4对实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠模型Th17细胞比例及细胞因子表达的影响

目的探讨c-Myc抑制剂10058-F4对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠模型光感受器间维生素A类结合蛋白1-20(IRBP 1-20)特异性辅助性T细胞17(Th17)细胞比例及细胞因子表达的影响。方法取健康C57BL/6J小鼠(8~10周龄)6只,采用随机数字表法将小鼠分为正常对照组、EAU组,每组3只。EAU组小鼠腹腔内注射350 ng百日咳毒素,单后足和脊柱两侧皮下注射含150μg IRBP 1-20、0.8 mg结核分枝杆菌H37RA和弗氏不完全佐剂的乳化剂以诱导EAU模型;正常对照组小鼠不给予特殊干预。免疫后13 d,行间接检眼镜检查并通过小动物视网膜成像系统可视化检测小鼠眼底炎性病灶,HE染色观察视网膜组织病理学改变,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测T细胞和眼球组织中c-Myc mRNA的表达。将EAU模型小鼠T细胞分为对照组和10058-F4组,10058-F4组T细胞加入50μmol·L^(-1)10058-F4,对照组T细胞不给予药物干预。培养6 h后,洗去药物,将两组T细胞与IRBP 1-20(10 mg·L^(-1))及骨髓来源树突细胞共培养,同时加入20μg·L^(-1)白细胞介素(IL)-23(Th17细胞诱导条件)。采用qRT-PCR检测c-Myc、维甲酸相关核孤儿受体γt(RORγt)、IL-17A、IL-17F和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)mRNA相对表达量,ELISA检测共培养细胞上清液中IL-17含量,流式细胞仪检测共培养细胞中Th17细胞比例。结果本研究EAU组小鼠模型建立成功。qRT-PCR检测结果显示,EAU组小鼠T细胞、眼球组织中c-Myc mRNA相对表达量分别为1.85±0.37、2.31±0.47,较正常对照组(1.01±0.02、0.99±0.05)均明显升高,差异均有统计学意义(P=0.017、0.008);10058-F4组T细胞c-Myc mRNA相对表达量为0.57±0.03,明显低于对照组(1.04±0.02),差异有统计学意义(P<0.001)。ELISA检测结果显示,10058-F4组共培养细胞上清液中IL-17含量明显低于对照组,差异有统计学意义(P=0.025)。流式细胞仪检测结果显示,10058-F4组共培养细胞中Th17细胞比例为(17.97±0.91)%,明显低于对照组[(22.50±0.90)%],差异有统计学意义(P=0.004)。qRT-PCR检测结果显示,10058-F4组T细胞RORγt、IL-17A、IL-17F、GM-CSF mRNA相对表达量分别为0.52±0.11、0.51±0.06、0.58±0.15、0.75±0.03,明显低于对照组(1.01±0.01、1.00±0.01、1.02±0.02、1.01±0.02),差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论c-Myc抑制剂10058-F4可显著降低T细胞中c-Myc表达水平,抑制Th17细胞特异性转录因子RORγt表达及效应细胞因子IL-17A、IL-17F、GM-CSF的产生,负向调控IRBP 1-20特异性Th17细胞免疫反应。

龙胆泻肝汤对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

目的探讨龙胆泻肝汤对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)的治疗作用。方法 Lewis大鼠随机分为对照组6只、EAU组18只和LXT组18只,光感受器间维生素A结合蛋白免疫EAU组和LXT组大鼠。观察大鼠生理特征及眼部炎症变化,出现葡萄膜炎症时给予LXT组大鼠龙胆泻肝汤灌胃;免疫后12 d比较各组大鼠眼组织病理学差异;免疫后每隔4 d检测房水蛋白及血清中白蛋白、球蛋白变化。结果成功制备了EAU大鼠模型;免疫后5 d大鼠开始出现葡萄膜炎症状,12 d炎症最重。EAU大鼠肛温在1 d、7 d、10 d和12 d高于对照组(P=0.020、0.000、0.015、0.001);免疫后12 d,EAU组房水蛋白浓度为(36.03±3.23)g·L-1,LXT组为(24.67±2.60)g·L-1,差异有显著统计学意义(P=0.000);组织病理学显示EAU组视网膜结构破坏程度明显高于LXT组(P.000)。EAU组免疫后4 d、8 d及12 d白蛋白均低=0于对照组(P=0.045、0.000、0.033),LXT组4 d和8 d白蛋白低于正常(P=0.045、0.005),但12 d时恢复至正常;12 d时EAU组球蛋白明显高于正常(P=0.047),LXT组未见明显异常。结论龙胆泻肝汤能有效减轻EAU大鼠前房炎症,减少炎症细胞浸润,保护眼部组织结构,增强机体抗氧化能力,调节免疫状态,对EAU发挥治疗作用。

Th1、Th17细胞相关因子在实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠中的表达及作用

目的探讨辅助性T细胞(T helper cells,Th)1、Th17细胞相关因子在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)中的表达及作用。方法取清洁级纯系健康雌性Lewis大鼠40只随机分为EAU组(32只)和对照组(8只),EAU组用光感受器间维生素A类结合蛋白诱导大鼠EAU模型,进行临床症状评分,免疫组织化学方法检测造模后视网膜内干扰素(inferferon,IFN)-γ、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、白细胞介素(interleukine,IL)-17、IL-6的表达。ELISA法对比分析房水中各细胞因子的变化情况。结果 EAU模型建立成功;造模后第14天,视网膜损害以外层为主,视网膜内有大量炎细胞浸润,从而导致视网膜内结构紊乱,同时在视网膜的视锥、视杆细胞层和神经节细胞层i NOS、IL-17、IL-6、IFN-γ表达,细胞阳性率分别为29%、48%、52%、73%。在EAU发病过程中,IL-6于造模后第7天迅速升高,第10天达到高峰;IL-17于造模后第14天达到最高值,变化趋势与炎症进程一致;IFN-γ在炎症后期仍有升高,于造模后第16天达到最高值;IL-6、IL-17、IFN-γ与对照组相比,各时间点表达差异均有统计学意义(均为P<0.05)。i NOS在炎症进程中表达有所增加,但与对照组相比,各时间点的表达差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论Th1、Th17细胞相关因子调节网络共同参与实验性自身免疫性葡萄膜炎的发生发展。

实验性自身免疫性葡萄膜炎T淋巴细胞亚群与Treg细胞的表达研究

目的探讨实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)新西兰兔模型外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)T淋巴细胞亚群的变化及其与疾病特征的相关性。方法选取健康成年雄性新西兰大白兔40只作为动物模型,用20 g·L^(-1)牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)静脉注射和玻璃体内注射法建立EAU模型,并观察模型眼炎症反应及PBMC T淋巴细胞亚群特征。结果 CD4+T细胞在EAU兔的外周血中比例明显增加,且随时间的进展呈进行性增加,并与炎症反应呈正相关,相同的趋势可见于CD4+/CD8+T细胞比例。此外,Treg细胞趋势与CD4+T细胞及CD4+T/CD8+T细胞比例相反,与炎症反应呈负相关。结论 CD4+T细胞的优势性选择性克隆增殖及Treg细胞的降低有可能引发免疫功能紊乱并导致针对自身组织的免疫应答失去有效的负性调控,导致EAU的发生及进行性加重。

Treg细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎发病过程中的动态变化

背景 研究表明,调节性T细胞（Treg）是一类负向调控免疫应答的T细胞亚群,在维持免疫稳态和免疫耐受方面发挥重要作用.自身免疫性葡萄膜炎是一种免疫性眼病,Treg细胞在自身免疫性葡萄膜炎发生和发展过程中的调控作用尚不完全清楚. 目的 观察Treg细胞在实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠发病过程中的动态变化.方法 选取84只6～8周龄SPF级Lewis大鼠,采用随机数字表法随机分为模型组和对照组.模型组于大鼠双后足垫、腹部双侧及背部皮下注射光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）1177-1191、结核菌素（TB）、完全弗氏佐剂（CFA）和PBS混合乳化剂共300μl,对照组大鼠以同样方法皮下注射等容量不含IRBP的TB与CFA乳化剂.分别于造模后第9、13、18、23、28、35、48天观察模型组和对照组大鼠的眼部炎症症状并根据严重程度进行炎症评分.于造模后上述时间点分别处死模型组及对照组大鼠各6只,采用常规组织病理学方法观察各组大鼠眼部虹膜、睫状体和视网膜组织形态变化;分离大鼠脾脏淋巴细胞,采用流式细胞术检测大鼠脾脏悬液中Treg细胞特异性标志物Foxp3标记细胞比例;采用实时荧光定量PCR法检测大鼠脾脏淋巴细胞中Foxp3 mRNA相对表达量变化. 结果 免疫后第8天模型组大鼠虹膜血管扩张充血,开始出现眼部炎症表现,免疫后第13天虹膜血管明显扩张,前房可见渗出和积脓,瞳孔区有膜样渗出,炎症评分最高,为（3.75±0.42）分,之后眼部炎症反应逐渐减轻,至免疫后第23天炎症反应接近消失,造模后第7、11、13、15、17、19、21天间模型鼠眼炎症反应评分总体比较差异有统计学意义（F=81.709,P＜0.001）.对照组大鼠眼部检查正常.组织病理学观察发现,模型组大鼠虹膜、睫状体、视网膜等组织有中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞浸润,组织结构排列疏松,以免疫后第13天最为明显,此后逐渐减轻,至免疫后第23天虹膜、睫状体和视网膜组织结构接近正常,炎性细胞浸润消失.流式细胞技术检测发现,免疫后第13、18、23、28、35、48天模型组大鼠脾脏Foxp3标记细胞比例分别为（5.50±0.64）％、（13.36±0.98）％、（10.34±0.79）％、（9.58±1.02）、（6.73±0.81）％和（5.58±0.47）％,明显高于对照组的（2.80±0.38）％、（3.36±0.53）％、（3.65±0.57）％、（3.37±0.43）％、（3.33±0.50）％和（3.13±0.61）％,差异均有统计学意义（t=-6.272、-15.556、-11.910、-9.753、-6.154、-5.491,均P＜0.01）.模型组和对照组造模后各时间点大鼠脾脏淋巴细胞中Foxp3 mRNA的相对表达量变化与Foxp3标记细胞比例变化趋势基本一致. 结论 EAU大鼠葡萄膜炎的发病及转归与Treg细胞数量和功能变化密切相关.

复发性实验性自身免疫性葡萄膜炎小鼠模型的诱导及其特点

目的诱导复发性实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)小鼠模型,评价其发生过程及特点。方法完全弗氏佐剂(CFA)乳化的光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)161-180肽段免疫B10.RⅢ小鼠作为诱导组(35只),用CFA-PBS免疫小鼠作为对照组(6只)。小鼠免疫后7、14、21、28、35 d裂隙灯显微镜和光学显微镜观察及评价眼部炎症发生、眼部表现和病理学变化;待炎症完全消失时,再次免疫小鼠,评价小鼠眼部炎症复发。结果诱导组首次免疫后7 d出现初发炎症,14 d炎症达高峰,随后炎症消退,至35 d完全消失。第35天进行再次免疫,36 d出现复发炎症,42 d达炎症高峰,随后炎症消退,但至观察期第96天部分鼠(1/5)仍维持炎症。眼部表现为睫状充血、前房渗出、瞳孔受损。病理学表现为视网膜和脉络膜炎性细胞浸润,血管炎、肉芽肿性炎,光感受器细胞层破坏,视网膜下渗出。对照组未见明显炎症。结论建立的EAU呈现慢性复发性病程,其眼部表现和病理学特征与人类葡萄膜炎相似,可作为葡萄膜炎研究的新型动物模型。

实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠的发病特点

背景 Lewis大鼠是建立实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）动物模型的常用种系,对其发病特点,尤其是EAU大鼠眼部超微结构改变的研究尚未见报道. 目的 观察EAU大鼠的发病体征及其眼部超微结构的改变. 方法 选取SPF级6～8周龄雌性Lewis大鼠18只,采用随机数字表法随机分为对照组6只和模型组12只.模型组大鼠后肢足底、两侧腹壁和躯干上皮下各注射含有光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP,1177-1191）和结核菌素（TB）的完全弗氏佐剂（CFA）乳化液,对照组大鼠不作处理.注射后观察两组大鼠饮食、体温和活动情况,每天裂隙灯显微镜下观察大鼠眼部炎症表现,于免疫后12d获取大鼠眼组织标本,对虹膜、睫状体和视网膜进行常规组织病理学检查,并分别在扫描电子显微镜和透射电子显微镜下观察虹膜、睫状体和视网膜的超微结构改变.结果 模型组大鼠免疫后采食量为（190.00± 18.03）g,明显少于对照组的（285.33±28.02）g,差异有统计学意义（t=4.955,P=0.012）;模型组和对照组大鼠的饮水量分别为（241.67±18.56）ml和（289.67±18.18）ml,差异有统计学意义（t=3.201,P=0.033）;模型组大鼠体温升高,精神倦怠.裂隙灯显微镜下观察发现,模型组大鼠免疫后6d出现虹膜充血、前房积脓和瞳孔膜闭,免疫后12d眼部炎症最严重,炎症评分为（3.83±0.41）分,而对照组大鼠眼前节未见异常.组织病理学检查发现,模型组大鼠前房、虹膜、睫状体组织和玻璃体腔内均可见大量淋巴细胞、中性粒细胞和单核巨噬细胞浸润.扫描电子显微镜下可见模型组大鼠虹膜肌纤维粗细不均,睫状体上皮表面粗糙及RPE细胞绒毛疏松.透射电子显微镜下观察可见,模型组大鼠虹膜单核巨噬细胞浸润,睫状体上皮细胞膜褶皱蓬松及排列紊乱,视网膜Müller细胞中有髓样小体,RPE细胞中有线粒体空泡出现,而对照组大鼠虹膜、睫状体及视网膜的形态结构均未发现异常.结论 用含IRBP（1177-1191）和TB的CFA乳化液诱导的EAU大鼠机体处于自身免疫炎症状态,其眼部组织形态学和超微结构的改变充分反映了EAU的炎症表现特征.

祛风活血丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠JAK2 mRNA和STAT3 mRNA表达的影响

目的观察祛风活血丸对实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠视网膜JAK2及STAT3 mRNA表达的影响。方法将80只(160眼)雄性Lewis大鼠根据随机数字表法随机抽取16只作为空白组(A),对其余64只大鼠进行实验性自身免疫性葡萄膜炎模型制作。造模成功后,根据随机数字表法将其随机分为模型组(B)、祛风活血丸常规剂量组(C)、祛风活血丸两倍剂量组(D)、熊胆开明片组(E)。干预14 d后用q PCR法检测大鼠视网膜组织中JAK2 mRNA和STAT3 mRNA的相对表达量。结果JAK2 mRNA:与B组比较,C组、E组表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05),D组表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01);STAT3 mRNA:与B组比较,C、D、E组表达均降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论祛风活血丸能降低实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠JAK2、STAT3 mRNA的表达,抑制JAK2/STAT3信号通路,达到抗炎作用。

人脐带间充质干细胞对实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用研究

目的观察体外培养的人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)的治疗作用。方法组织块贴壁法培养HUCMSCs、流式细胞术鉴定。用视网膜光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP)诱导EAU模型。C57BL/6小鼠尾静脉注射HUCMSCs,每日用裂隙灯显微镜对小鼠眼前节的炎症情况进行观察。流式细胞术检测实验小鼠脾脏淋巴细胞CD11c、CD86表型。结果建模后的C57BL/6小鼠于注射IRBP后7~9 d开始发病,12~14 d发病达高峰,16~20 d眼前节炎症自限性减轻,21 d后眼内炎症逐渐消退、自愈。HUCMSCs治疗后,建模小鼠EAU发病时间延长,炎症程度减轻,实验组与模型对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。建模后的小鼠脾脏CD11c+CD86-细胞数量增加非常明显,经HUCMSCs治疗后第9天CD11c^+CD86^-细胞数量接近治疗前水平。建模后小鼠脾脏中CD86+CD11c+/CD11c比值下降,经HUCMSCs治疗后有所回升,但在第15天时仍未恢复至正常水平。结论 HUCMSCs对IRBP诱导的小鼠EAU有治疗作用,HUCMSCs作用于树突状细胞等抗原呈递细胞,抑制了EAU的进展。

MHC-Ig/肽复合体在实验性自身免疫性葡萄膜炎CTLs研究中的应用

目的探讨MHC-Ig/肽复合体用于小鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)研究的应用价值。方法用人类光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)合成多肽IRBP161-180免疫B10RⅢ小鼠制备EAU动物模型。将源于IRBP161-180多肽序列的10种不同短肽片段与MHC-Ig多聚体形成复合体,用于检测B10RⅢ小鼠EAU中特异性CTLs。比较各种MHC-Ig/IRBP短肽复合体与CTLs的结合能力,以及刺激CTLs的增殖和IFN-γ的表达水平,并选用对CTLs作用最强的复合体,检测小鼠在EAU不同发病期外周血CTLs的表达情况。结果各MHC-Ig/IRBP短肽复合体能够检测出抗原特异CTLs,其中MHC-Ig/IRBP168-177短肽复合体检测出CTLs的阳性率达12.3%;并且其刺激CTLs的增殖和IFN-γ的表达水平明显高于其它短肽组(P<0.01),可初步推断短肽序列IRBP168-177为该EAU模型特异CTLs主要的抗原识别表位。用MHC-Ig/IRBP168-177短肽复合体检测EAU疾病过程中外周血CTLs的表达发现,EAU在炎症急性期特异性CTLs的阳性表达最高(4.9%±1.1%)。结论MHC-Ig/肽复合体技术,是一种新的定量分析抗原特异性CTLs的方法,能检测抗原特异性CTLs的表达情况,分析CTLs的抗原识别表位,为动物模型EAU的研究提供了高效、特异、敏感的检测手段。

实验性自身免疫性葡萄膜炎大鼠闪光视网膜电图的改变

目的观察实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠闪光视觉诱发电位(F-VEP)和闪光视网膜电图(FERG)的改变。方法选取雌性Lewis大鼠(6~8周)12只,采用随机数字表法分为对照组和实验组,各6只。实验组大鼠后肢足底、两侧腹壁和躯干上皮下各注射含有光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP,1177-1191)和结核菌素(TB)的完全弗氏佐剂(CFA)乳化液,对照组大鼠不做处理。EAU大鼠模型制备8 d后,用眼底光学相干断层成像术(OCT)、眼底荧光素造影(FFA)及F-VEP和F-ERG等手段观察眼底病变情况。结果与对照组大鼠相比,实验组大鼠免疫后第8天眼底彩照、OCT及FFA等检查结果均无明显变化。两组F-VEP结果差异无统计学意义(P>0.05);而与对照组大鼠相比,实验组大鼠F-ERG有显著改变,差异有统计学意义(P<0.05)。结论免疫后第8天,EAU大鼠视网膜电图已经发生改变,表明EAU大鼠视网膜细胞已经受到损害。

β-arrestin1在实验性自身免疫性葡萄膜炎中的表达

目的:初步探讨β-arrestin1在实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)中的表达。方法:成功建立EAU动物模型后,通过免疫组织化学和RT-PCR的方法检测β-arrestin1在EAU小鼠脾脏细胞中的表达。结果:免疫组织化学和RT-PCR均提示β-arrestin1在EAU小鼠脾脏细胞中的表达较正常小鼠增高。结论:β-arrestin1可能在EAU的发生发展中起着重要作用。

雷帕霉素对大鼠实验性自身免疫性葡萄膜炎的治疗作用

背景雷帕霉素不仅具有抗菌作用，而且是一种良好的免疫抑制剂，可用于多种自身免疫性疾病的治疗．对实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的治疗作用是目前研究的热点之一。目的研究雷帕霉素对EAU的治疗作用，并观察雷帕霉素对EAU各免疫细胞群炎性因子表达的影响。方法25只Lewis大鼠采用随机数字表法分为EAU组（20只）和正常对照组（5只）。光感受器间维生素A类结合蛋白（IRBP）R16肽段与完全氟氏佐剂充分乳化后于Lewis大鼠后足皮下注射以建立EAU模型，EAU模型鼠再按分层随机的原则分为模型对照组和雷帕霉素组，每组10只大鼠。雷帕霉素组造模后即应用O．2mg／（kg·d）雷帕霉素（0．4m1）腹腔内连续注射7d，模型对照组及正常对照组大鼠采用等体积的生理盐水进行腹腔内注射。造模后第4天开始每日裂隙灯下观察大鼠EAU的症状，造模后第14天制备大鼠视网膜切片，以苏木精-伊红染色法进行组织病理学观察，参照Caspi的标准对EAU症状及组织病理学分级进行评分。应用免疫组织化学染色法检测各组大鼠视网膜中炎性因子干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-17（IL-17）的表达情况。结果造模后6d模型对照组大鼠EAU炎症评分逐渐升高，12d达到高峰，然后逐渐下降。雷帕霉素组大鼠EAU炎症评分变化呈现相同的趋势，但各时间点EAU炎症评分均明显低于模型对照组，差异均有统计学意义（P〈0．01）。视网膜组织病理学研究表明，模型对照组大鼠视网膜结构紊乱，大量炎性细胞浸润，组织病理学评分为3．30±0．48，而雷帕霉素组视网膜结构接近正常，组织学评分为0．90±0．45，差异有统计学意义（t=16．541，P〈0．01）。雷帕霉素组IFN-γ、IL-17在大鼠视网膜中的表达量（A值）分别为21．16±4．23和49．86±6．59，明显低于模型对照组的62．14±7．32和124．85±6．33，差异均有统计学意义（q=33．334、q=56．923，P〈0．01）。结论雷帕霉素通过抑制EAU视网膜中IFN-γ、IL-17等炎性因子的表达而对EAU发挥治疗作用，其机制可能是通过抑制Th1、Th17细胞群来实现的。