室温常压等离子体法合成氨研究(英文)

在室温常压条件下，氮氢混合气体（混合比为1：3，流量为氮气40毫升／分钟、氢气120毫升／分钟）流经自制石英玻璃气套，石英玻璃气套上安装有一对柱面电极，此电极对与交流电源相连接，电源的输出电压为15KV，频率是20KHz（或50Hz）。流过石英玻璃气套的氮氢气体被高电场强度所激活，具有了化学活泼性。有一定平动动能的氮氢气体分子频繁地相互碰撞，可引发化学反应，能合成（生成）氨。室温常压等离子体法合成氨转化率影响较大因素有：1）放电频率；2）当放电频率固定在20KHz时电源输出电压值；3）氮氢混合比；4）反应气体的温度。

利用常压室温等离子体诱变选育工厂化金针菇新菌株

为确定金针菇常压室温等离子体处理的诱变致死率,创制工厂化金针菇新种质,本研究以上研1号菌株作为亲本,收集其孢子进行常压室温等离子体诱变后,采用多孢自交技术获得新菌株,再经工厂化小试初筛和中试复筛,最终获得新种质。结果表明,从108个突变自交菌株中获得出芽快且整齐、产量高、商品性状优良(菌盖厚实、菌柄较粗)的金针菇新品种上研A130,该品种为白色,菌盖呈球形、内扣,菌柄基部绒毛少,子实体干品中必需氨基酸总含量为2.57×10^(4)mg·kg^(-1)。工厂化栽培条件下,菌丝培养温度为20℃,子实体生长发育温度为4~18℃,瓶栽菌丝培养周期为22 d,子实体生育时间为26 d,平均单瓶产量为每瓶456.41 g。本研究结合新型诱变技术和传统选育方法,提高了亲本的突变率,为筛选具有目标性状的工厂化金针菇新菌株提供了数据支撑,对金针菇产业持续发展具有实践价值。

常压室温等离子体技术在微生物诱变育种中的研究进展

主要阐述常压室温等离子体诱变(ARTP)技术的概念、诱变机理和影响诱变效果的因素,以微生物和食用菌诱变育种为主要内容,重点介绍ARTP诱变技术在细菌、放线菌和酵母等微生物菌种改良和提升生物合成能力方面的应用,以及在食用菌新品种选育等研究中的应用,分析ARTP诱变技术在微生物和食用菌育种研究中具有的优势以及面临的挑战,并说明今后研究重点是通过提高快速筛选目标菌株的技术水平,结合高通量测序、转录组和蛋白质组等多组学技术,深入探究经ARTP诱变后微生物和食用菌的遗传规律和调控生物活性物质合成的机制,以期通过新技术的建立和应用,为食用菌和微生物育种研究提供新思路,进而推动微生物和食用菌的种质创新及产业可持续发展。

采用常压室温等离子体诱变技术选育高产多糖黑木耳菌株

为选育高产多糖的黑木耳(Auricularia auricula)菌株,以黑威单片作为出发菌株,采用常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变原生质体,经过3轮迭代诱变,从菌丝生长速度较快的诱变菌株中筛选多糖产量较高的菌株,通过5代继代培养测定菌株的菌丝生长速度稳定性,采用拮抗实验观察菌株间的拮抗情况,通过简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat,ISSR)分子标记分析菌株间的遗传差异。结果表明:与黑威单片相比,诱变菌株D3-56的菌丝生物量和多糖含量分别提高15.02%和48.40%,诱变菌株D3-60的菌丝生物量和多糖含量分别提高13.15%和60.83%,诱变菌株D3-56和D3-60的多糖产量分别提高70.69%和81.97%;诱变菌株D3-56和D3-60菌丝生长速度稳定,且与黑威单片存在遗传差异。

常压室温等离子体诱变与微生物微液滴培养选育谷胱甘肽高产菌株

为提升野生毕赤酵母菌株BY-1产谷胱甘肽的能力,通过常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)诱变技术得到诱变菌株BY-1-26。进一步在摇瓶培养过程中添加1,2,4-三氮唑,提高诱变菌株产量。最后将1,2,4-三氮唑作为筛选因子,利用微生物微液滴培养(microbial microdroplet culture system,MMC)仪对诱变菌株进行适应性进化,获得了1株高产谷胱甘肽的突变株BY-2-24,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明:出发菌株BY-1经过ARTP诱变处理、抗性梯度平板初筛、MMC适应性进化、摇瓶复筛等,可以选育高产谷胱甘肽突变株。突变株BY-2-24摇瓶产量达(312.13±2.62)mg/L,较出发菌株提高134.26%,且经过7次传代培养,仍然具有较好的遗传稳定性。同时,生物量提高118.33%,表明诱变菌株的生长能力得到提高。研究表明,ARTP与MMC联合应用作为一种简便高效的微生物诱变方式,可用于定向诱变筛选高性能微生物菌株,为高通量选育目标菌株提供了参考。

常压室温等离子体诱变选育黄原胶生产菌

以野油菜黄单胞菌为出发菌株,进行常压室温等离子体(ARTP)诱变,筛选产黄原胶的优良菌株。研究结果表明:以菌落直径为初筛指标,共获得5株诱变菌株;进一步以黄原胶产量和黏度为复筛指标,获得1株优良菌株X20。其黄原胶产量与黏度分别为3.52 g/L和77.30 mPa·s,比出发菌株分别提高77.78%和40.03%。经过10次传代培养,诱变菌X20具有较好的遗传稳定性。不同环境因子都会影响X20的发酵性能。以谷氨酸为氮源时,黄原胶产量及黏度均最高,分别为7.30 g/L和495.50 mPa·s,比出发菌分别提高43.27%和22.29%。高质量浓度谷氨酸(大于1 g/L)会显著抑制出发菌株和X20的发酵液黏度,4 g/L谷氨酸使其黏度分别降低至21.8 mPa·s和25.93 mPa·s。不同初始pH条件下X20的黄原胶黏度均高于出发菌株,且X20更适应pH 6.5的发酵环境,黏度可达546.5 mPa·s。随着盐度增加,诱变菌株的黄原胶产量增加、黏度下降,且都高于出发菌株。当盐度为8 g/L时,X20的黄原胶产量和黏度分别为12.19 g/L和331.23 mPa·s,比出发菌株分别高23.05%和109%。X20的发酵液黏度在不同温度(20℃~80℃)及高矿化度(28.90 g/L)条件下均保持稳定,且始终优于出发菌株,具有一定的工业应用潜力。

常压室温等离子体生物诱变育种及其应用研究进展

大气压射频辉光放电(RF APGD)等离子体具有大气压下操作不需要真空系统、气体温度低、活性粒子浓度高、放电均匀性好、可控性强等特点,能够与各类生物分子发生作用,在生物技术中的应用受到广泛的关注。本研究团队将RF APGD等离子体射流引入生物诱变育种领域,对其物理特性及其与生物大分子和整细胞的作用机制进行了系统研究,并将其开发成新一代高效诱变育种仪,命名为常压室温等离子体(ARTP)诱变育种仪。实践证明,ARTP诱变育种仪具有对操作者安全、环境友好、操作简便、突变快速、突变率高、获得的突变体性状稳定等特点,目前已成功应用于包括细菌、放线菌、真菌、酵母、微藻等在内的四十余种微生物的诱变育种。本文将对ARTP生物育种技术的最新研究进展进行综述,以期ARTP快速生物突变技术在生物进化研究及工业生物菌种改造上发挥重要作用。

常压室温等离子体对NaCl胁迫下胡麻种子萌发及幼苗生理特性的影响

为探究常压室温等离子体(ARTP)照射处理对胡麻耐盐性的影响,以2个胡麻品种天亚10号和陇亚13号为材料,利用ARTP对胡麻种子进行不同时长(0、10、20、30 min)照射,测定不同Na Cl浓度(0、85、170 mmol·L-1)胁迫下胡麻的发芽指标、幼苗生长指标、叶绿素(Chl)和类胡萝卜素含量、叶片质膜相对透性、叶片丙二醛(MDA)含量、可溶性蛋白含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,分析ARTP处理对Na Cl胁迫下胡麻种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明,ARTP处理对2个胡麻品种的影响存在差异,ARTP处理可以促进天亚10号在Na Cl胁迫下种子萌发和幼苗生长,降低质膜相对透性、叶绿素含量、类胡萝卜素含量、MDA含量,提高POD活性及可溶性蛋白含量;在170 mmol·L-1Na Cl胁迫下ARTP处理10 min,天亚10号发芽率可以提高90.27%;但抑制了陇亚13号在Na Cl胁迫下种子萌发和幼苗生长,增加了质膜相对透性、叶绿素含量、类胡萝卜素含量、MDA含量,降低了POD活性及可溶性蛋白含量,在170 mmol·L-1Na Cl胁迫下ARTP处理30 min,陇亚13号的发芽率下降了17.60%。本研究结果为胡麻育种及盐碱地人工栽培提供了一定的理论参考。

常压室温等离子体(ARTP)诱变快速选育高产DHA的裂殖壶菌突变株

旨在建立一种能够快速便捷的诱变选育高产DHA菌株的方法。出发菌株Schizochytrium sp.ATCC 20888悬浮液经过常压室温等离子体(ARTP)处理后,涂布到2,2’-联吡啶平上板培养。将所得的突变菌株摇瓶发酵培养,通过磷酸香草醛油脂快速检测法和气相色谱分析从突变菌株中筛选得到DHA高产菌株。结果表明,裂殖壶菌诱变选育条件为ARTP为处理时间15 s,气量10 L/min,电功率100 W;2,2’-联吡啶浓度为100μmol/L。通过该方法可以获得高产DHA的菌株。其中D32菌株DHA生产能力提升显著,比初始菌株提升了29.8%,DHA产量达到7.31g/L。D32菌株与出发菌株相比,主要的饱和脂肪酸含量显著下降(P<0.005),而不饱和脂肪酸含量显著增加(P<0.005)。经5次传代后性状稳定,本方法快捷高效,同时也为其他多不饱和脂肪的诱变选育方法提供参考。

常压室温等离子体(ARTP)诱变及高通量筛选那西肽高产菌株

采用新型常压室温等离子体(ARTP)诱变活跃链霉菌(Streptomyces actuosu),并应用抑菌圈和48孔板培养方法高通量筛选高产那西肽菌株。研究表明抑菌圈径的大小与48孔板效价之间以及48孔板效价与摇瓶效价之间均有较好的相关性,系数R分别达到0.534和0.896。通过多轮ARTP诱变及高通量筛选最终获得了3株相对效价提高50%以上的遗传性能稳定的突变株。ARTP诱变技术作为获得那西肽高产菌株的有效途径,与传统摇瓶发酵筛选相比,48孔板及抑菌圈法能显著提高那西肽高产菌株的筛选效率。

常压室温等离子体诱变粘红酵母筛选高产油脂菌株及发酵条件优化

以粘红酵母(Rhodotorula glutinis)为出发菌株,采用常压室温等离子体对其进行诱变。得到最佳诱变条件为120 W功率下处理60 s,致死率达90%。诱变后,采用苏丹黑B染色法筛选出1株高产油脂突变株LA1,与出发菌株相比较,其油脂产量、油脂含量分别较出发菌株提高了17.59%和46.08%。对LA1发酵培养条件进行优化,得到最佳条件为初始葡萄糖质量浓度70 g/L,氮源为(NH4)2SO4,C/N值53。在最佳发酵条件下,LA1的油脂产量、生物量、油脂含量及油脂得率较优化前分别提高了123.9%、56.6%、43.0%和43.5%,其油脂脂肪酸组成与植物油相近。

常压室温等离子诱变选育高产橙、黄色素红曲菌研究

为了提高红曲菌(Monascus sp.)产橙、黄色素的性能,采用新型的常压室温等离子体(ARTP)诱变技术处理红曲菌WM951孢子悬液。结果表明,最佳照射时间为90 s,此时红曲菌突变效果最好,其孢子致死率为78%,形态突变率为14.2%。试验最终从15株突变菌株筛选得到1株高产橙、黄色素的突变菌株WM951M1,对该菌株的发酵产物进行色价检测分析,发现该突变菌株产橙、黄色素能力比出发菌株分别提高136%、43%,30℃培养10d后其固态发酵红曲米中橙、黄色素色价最大值分别为3 620、3300 U·g-1。出发菌和突变菌所产色素的全波长扫面图谱显示,突变菌所产色素最大吸收峰出现在465nm处,并在410 nm处也有吸收峰,说明该菌主要合成橙、黄色素。在传代培养的过程中,该突变菌株表现出良好的遗传稳定性及形态稳定性,不仅可应用于生产橙、黄色素,也可用于生产色调偏橙型红曲米,还能丰富红曲菌菌株库资源。

常压室温等离子体诱变(ARTP)及高通量筛选高产蛋白酶米曲霉的初探

为提高酱油发酵菌种米曲霉的蛋白酶活力,采用实验室保藏菌种H0米曲霉为诱变出发菌株,对H0菌株进行常压室温等离子体诱变(ARTP),诱变条件:功率120 W;气流量10L/min;10个时间梯度处理。结果表明:当诱变时间为140s时,致死率接近90%,此时为最佳诱变时间。利用大豆球蛋白作为选择培养基关键因子进行初筛和96孔板高通量复筛,选出3株高蛋白酶活力菌株H5,H12,H15,并且经过福林酚法验证。最终筛选出米曲霉菌株H15具有高蛋白酶活力:酸性、中性、碱性蛋白酶活力分别为192.35,1816.31,3774.82U/g,比出发菌株H0分别提高17.49%,19.08%,10.66%。

常压室温等离子体诱变选育替考拉宁高产菌株

目的为选育替考拉宁的高产菌株。方法采用常压室温等离子体(ARTP)技术对替考拉宁产生菌Actinoplanes teichomyceticus FIM-68的孢子进行诱变,诱变处理的孢子悬液涂布在含替考拉宁致死浓度的培养基平板上培养,获得替考拉宁抗性突变株,通过摇瓶发酵对替考拉宁抗性基因突变株进行筛选。结果获得一株遗传性状稳定的替考拉宁高产菌Actinoplanes teichomyceticus FIM-68-66菌株,其产替考拉宁能力提高了2倍。结论这是首次报道采用常压室温等离子体诱变技术有效提高替考游动放线菌产替考拉宁能力,所获得的替考拉宁高产菌株可望用于替考拉宁的工业化生产。

常压室温等离子体快速诱变酒精酵母及其突变株的特性研究

常压室温等离子诱变技术可以快速有效的诱变微生物。利用ARTP技术对酵母菌进行诱变,得出其致死时间为90s;通过筛分实验对不同突变标准下的正负突变率进行了统计,得到5株较优良突变株;对其进行多次筛分实验,发酵结果比较一致;遗传稳定性试验结果表明,突变株具有较好的遗传稳定性;通过发酵期间的突变株的失重多于出发菌株的情况验证筛分结果:突变株优于出发菌株。

常压室温等离子体诱变对螺旋藻中氨基酸成分的影响

旨在了解常压室温等离子体诱变处理对螺旋藻氨基酸含量及营养价值的影响。以TJF1为出发藻株,多功能等离子体诱变仪对藻株进行诱变处理,日立L-8900氨基酸自动分析仪测定其氨基酸组成和含量,利用模糊识别法和氨基酸比值系数法对突变体与出发藻株的氨基酸营养价值进行评价。结果表明:与出发藻株相比,15个突变株中的17种氨基酸含量均高于出发藻株,总氨基酸含量差异显著;突变株的氨基酸含量分布与出发藻株保持一致;总必需氨基酸与总氨基酸含量比值(E/T)维持在0.43~0.45,没有明显变化;2种营养价值评价结果表明,等离子体诱变没有降低氨基酸营养价值;突变株10的总氨基酸含量最高,比出发藻株高出53.52%,可以作为高产蛋白优势藻株。

常压室温等离子体快速诱变选育高产单宁酶菌株

采用常压室温等离子体诱变技术处理黑曲霉B0201,选育高产单宁酶突变株,为单宁酶的发酵生产提供优良菌株。确定等离子体处理条件,采用稀释平板培养法挑选突变株,利用变色圈法和分光光度法测定产酶量,获得最佳诱变时间为180 s,正突变率高达19%。通过2%的高浓度单宁酸显色平板初筛850株菌,液态摇瓶发酵复筛90株菌,得到高产单宁酶的菌株B1401。诱变后单宁酶酶活为17.61 U/g,是原始菌株酶活8.94 U/g的2倍左右,且传代菌种产单宁酶稳定性良好。

常压室温等离子体快速诱变选育丙酮酸高产菌株

本研究以产丙酮酸的光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)Tp19为出发菌株,采用常压室温等离子诱变系统(ARTP)进行诱变,根据CaCO3筛选平板透明圈与菌落直径比以及100孔板产酸量快速筛选丙酮酸高产突变株。最后通过摇瓶发酵复筛,选育出一株遗传稳定的突变株A214,丙酮酸产量达到37.43g/L,比出发菌株提高了13.69%。

常压室温等离子体诱变选育耐酸酿酒酵母菌株

利用常压室温等离子体(ARTP)诱变方法对实验室保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)SC-62进行诱变,通过试验确定最佳诱变条件为处理时长80 s,此条件下菌株SC-62致死率84%。将诱变获得的菌株进行初筛、复筛和发酵性能测定。结果显示,筛选出一株耐酸性强、发酵性能优良的正突变菌株A-107,其在pH为2.5的发酵培养基上培养6 d后测得的发酵力[6.21 g CO2/(100 mL·24 h)]和酒精产量(11.52%vol)较出发菌株SC-62分别提高了37%和30%,突变菌株A-107可耐受16%乙醇、100 g/L NaCl、500 g/L葡萄糖,耐受性和遗传稳定性良好。

产脂肪酶菌株的常压室温等离子体诱变及高通量筛选方法的建立

脂肪酶由于可催化的反应种类和底物类别多,且具有位置选择性和异构体选择性等特点而常用于结构酯的合成和油脂改性等领域。丝孢酵母(Trichosporon sp.)是一种产脂肪酶菌种,但生产能力偏低是限制该菌实现工业化生产的重要因素。本研究利用常压室温等离子体(ARTP)对丝孢酵母野生菌进行诱变处理,并建立了96孔板培养结合对硝基苯酚棕榈酸酯(P-NPP)法测定酶活力的高通量筛选方法,实现了60个突变菌株的初筛。以酶活力为筛选指标时,突变率和正突变率分别为51.7%和28.3%。8株初筛菌株的摇瓶发酵结果显示,A13和A5的产酶提高最显著,培养96 h后分别比野生菌增加2.64倍和1.54倍,且2个突变菌株的遗传稳定性良好。对比研究发现,突变菌株A13相较野生菌的最大优势在于提前24 h便能达到最高产酶量。