室间隔缺损胎儿心室肌组织微小RNAs时序性表达差异研究

目的采用微小RNAs(miRNAs)表达谱芯片分析不同孕龄(孕早期与孕中期)室间隔缺损(VSD)胎儿心室肌组织中时序性表达差异的miRNAs。方法连续性纳入2009年7～12月南京医科大学附属南京妇幼保健院因病理因素流产经解剖证实为VSD且不合并其他畸形的胎儿为VSD组。以同期因生理性难免流产,并经解剖证实无心脏畸形和其他器官畸形的胎儿为对照组,依据孕龄与VSD组1:1匹配。根据孕龄,将VSD组和对照组分别分为孕早期亚组和孕中期亚组。采用Agilent Human2.0 miRNAs表达谱芯片观察胎儿心室肌组织miRNAs表达变化,芯片数据采用生物信息学方法进行分析,包括差异miRNAs筛选,预测miRNAs靶基因Gene Ontology分析,靶基因信号通路分析,并采用实时PCR法验证芯片结果。结果 VSD组和对照组各纳入6例,两组孕早期亚组和孕中期亚组均各3例。①通过差异miRNAs筛选,发现孕早期VSD亚组与孕中期VSD亚组间有33个时序性表达差异的miRNAs。19个miRNAs在孕早期VSD亚组表达上调,在孕中期VSD亚组表达下调;14个miRNAs在孕早期VSD亚组表达下调,在孕中期VSD亚组表达上调。②生物信息学预测到2761个靶基因,大部分miRNAs的靶基因中含有与心脏发育直接相关的关键基因(TBX5、GATA4、TBX1和NKX2-5等)。③靶基因GeneOntology分析表明其中与细胞进程、代谢过程和生物调控相关的靶基因分别占整个靶基因数量的23.5%、18.3%和17.7%。④靶基因信号通路分析发现,WNT信号通路中的靶基因在孕早期VSD亚组与孕中期VSD亚组中存在时序性差异。⑤随机挑选孕早期VSD亚组与孕中期VSD亚组时序性表达差异的4个miRNAs(hsa-miR-19a、hsa-let-7e、hsa-miR-134和hsa-miR-206)进行验证,定量PCR结果显示,孕早期VSD亚组分别上调3.2(hsa-miR-19a)和4.1倍(hsa-let-7e),下调5.3(hsa-miR-134)和4.4倍(hsa-miR-206);孕中期VSD亚组分别下调4.8(hsa-miR-19a)和3.4倍(hsa-let-7e),上调4.5(hsa-miR-134)和3.9倍(hsa-miR-206)。结论时序性表达差异的miRNAs在胎儿VSD畸形的发生中可能起着重要作用,但本研究样本量较小,需要进一步扩大样本量进行验证。这些差异表达miRNAs的预测靶基因与细胞发育、分化和代谢密切相关,含有与心脏发育直接相关的关键基因,部分靶基因为WNT信号通路中的关键因子,提示VSD的发生发展是机体在miRNAs的参与下,在多个层面上使基因表达失控的共同结果。

室间隔缺损患者循环miRNA表达差异研究

目的先天性心脏病(CHD)是环境因素和遗传因素共同作用的结果。室间隔缺损(VSD)是CHD中最常见的一种。研究表明,microRNAs(miRNAs)与CHD的发生发展关系密切,但目前缺乏有关miRNAs与VSD的研究报道。本研究旨在通过血清差异miRNA的表达研究阐明miRNA与VSD发生发展的关系。方法采用miRNA表达谱芯片技术进行VSD患者血清miRNA表达差异分析,并对结果进行实时定量PCR(Real-time PCR)验证,进而对miRNA调控的靶基因进行生物信息学分析。结果通过miRNA芯片在VSD患者和对照血清样本中检测miRNA差异表达,筛选出36个表达差异的miRNA(P<0.05),其中21个miRNA在VSD患者表达显著下调,15个表达显著上调。经过Real-time PCR验证,证实8个miRNAs差异表达有意义。通过生物信息学预测出447个靶基因,经GO分析富集度分值(enrichment score value)最大的生物过程(biological process)为心脏右心室形态发生(cardiac right ventricle morphogenesis),对应的差异表达基因为NOTCH1、HAND1、ZFPM2和GATA3,调控这些基因的miRNA可能包括hsa-let-7e-5p、hsa-miR-222-3p和hsa-miR-433。结论通过微阵列技术分析和RT-PCR验证,筛选出8个差异表达miRNA,为后续实验提供了可供分析的miRNA。利用3个数据库及GO分析,发现hsa-let-7e-5p、hsa-miR-222-3p和hsa-miR-433的靶基因分别为NOTCH1、HAND1、ZFPM2和GATA3,为进一步在基因水平研究VSD的发病机制提供了新的突破口,为将来可能实现的基因诊断、基因干预治疗以及疾病的预防奠定了一定的实验基础。

室间隔缺损相关的长链非编码RNA TUC40-的生物信息学及表达谱分析

目的探讨TUC40-在人和小鼠心脏胚胎发育过程中是否发挥作用。方法应用生物信息学网站NCBI、UCSC、Uniprot及软件Clustal、DNAMAN、MEGA 6等,对TUC40-及其编码片段uc.40-进行分析;采用链特异性逆转录实时定量聚合酶链反应检测TUC40-与其正义链产物Pbx1 mRNA在小鼠胚胎心脏发育关键时间点的表达谱。结果 Uc.40-于核苷酸序列、基因组位置及转录因子结合位点3个水平在人和小鼠具有保守性。TUC40-与Pbx1 mRNA在小鼠心脏胚胎发育过程中呈现负性趋势。结论 Uc.40-的多水平保守性提示了TUC40-功能的保守性。TUC40-可能是通过调控Pbx1,在人和小鼠的心脏胚胎发育中发挥作用。

MicroRNA标志物在早期诊断室间隔缺损中的价值

目的 评价血浆microRNA(miRNA)在室间隔缺损(VSD)早期诊断中的临床应用价值以及作为VSD分子诊断标志物的可行性,并建立临床早期诊断模型。方法 采用以济南市儿童医院、泰安市妇幼保健院为基础的病例-对照研究方法开展本次研究。研究分为VSD组85例和对照组80例,分3个阶段进行检测:首先选取VSD组及其匹配对照组各3例,应用miRNA全基因组表达谱芯片进行初筛;然后扩大样本量(20例VSD组vs 15例对照组),对选定的8个有差异的miRNA采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)进行芯片结果的验证;最后进一步扩大样本(62例VSD组vs 62例对照组)进行qRT-PCR检测,筛选先天性心血管病早期诊断的生物标志物,建立多指标的Logistic回归模型,并应用MedCalc软件进行受试者工作特征(ROC)曲线分析评价诊断模型的价值。结果 芯片杂交初筛结果显示,与对照组比较,有36个表达有差异的miRNA(P<0.05),两阶段大样本qRT-PCR验证,检测到5种血浆miRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p、miR-433-3p和miR-487b-5p)在VSD中的表达差异有统计学意义(P<0.05),可以选择作为具有VSD早期诊断意义的生物标志物。5种血浆miRNA的ROC曲线下面积(AUC)分别在0.678~0.832,其中miR-222-3p的ROC曲线下面积最大为0.832。建立多指标Logistic回归分析模型,5种血浆miRNAs联合模型可提高VSD的诊断效率,ROC曲线下面积达到0.955,敏感性和特异性分别为83.87%和95.16%;3种血浆miRNA(let-7e-5p、miR-155-5p、miR-222-3p)联合诊断模型,ROC曲线下面积达到0.910,敏感性和特异性分别为82.30%和90.30%,接近5个miRNA的诊断效率。结论 5种血浆miRNA作为VSD早期诊断标志物,具有一定的可信性。将其整合后可建立起多指标的联合诊断模型。联合3种血浆miRNA构建诊断模型可提高VSD的诊断效率,临床应用价值更大。

microRNA-23b表达异常与心脏发育缺陷相关性分析

目的:探讨microRNA-23b(miR-23b)表达异常与心脏发育缺陷的关系。方法 :收集人胚胎心肌组织和发育中的小鼠胚胎心肌组织,0.9%二甲亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)诱导P19细胞定向分化为心肌细胞,定量PCR检测人胚胎心肌组织、小鼠胚胎心肌组织和P19细胞分化过程中miR-23b的表达特点,运用在线数据库对miR-23b进行生物信息学分析,分析其可能的靶基因以及涉及的信号通路,综合分析miR-23b表达异常与心脏发育缺陷的关系。结果:miR-23b在孕早期人室间隔缺损(ventricular septal defect,VSD)胚胎心肌组织中上调4.4倍,在孕中期VSD组下调3.5倍;小鼠胚胎发育d12.5、d14.5、d16.5、d18.5的4个时间点miR-23b的表达量逐渐增高,d14.5后各组间差异具有显著性(P<0.05);P19细胞定向分化过程中miR-23b的表达量逐渐下降,d4后各组间有显著差异(P<0.05);生物信息学分析提示miR-23b可能涉及转化生长因子β(TGF-β)、Notch、Wnt信号通路。结论 :miR-23b表达异常可能通过影响心肌细胞的增殖、凋亡、迁移、分化等细胞功能,导致心脏发育缺陷。

microRNA-155、microRNA．222与丝裂原活化蛋白激酶信号通路在室间隔缺损中的作用

目的探讨microRNA（miR）-155和miR-222在室间隔缺损（VSD）患者血浆中的表达变化及临床意义，对其可能的分子调控机制进行初步分析。方法选取2012年8月至2013年6月在济南市儿童医院心血管外科就诊和治疗的VSD患者20例（病例组），同期骨外科骨折患者15例（对照组）。反转录实时定量PCR（RT—qPCR）测定各组研究对象血浆miR-155和miR-222的表达水平。利用miRNA靶基因预测数据库Tar-getScan、mirbase及Miranda对miR-155和miR-222的靶基因进行预测，进而通过Pathway分析推测miRNA在VSD中的分子调控通路。结果与对照组相比，VSD患者血浆miR-155表达分别下调0．45倍（P=0．033）和0．51倍（P〈0．001）；miR-155和miR-222的下游调控靶基因分别有74个和50个；Pathway分析得到7个相关信号通路，其中包括与心脏发育密切相关的信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。结论VSD患者血浆miR-155和miR-222表达显著降低，其调控的靶基因与心脏发育密切相关的信号通路（MAPK信号通路）有关，提示miR-155和miR-222可作为预测VSD发病风险的独立评价指标。

长链非编码RNA uc.299在心脏发育中的作用

目的:研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)uc.299在P19细胞分化及斑马鱼心脏发育中的作用,探讨其与心脏发育之间的关系。方法:体外实验中,通过sh RNA沉默uc.299后,检测对P19分化的影响;在体实验中,对斑马鱼受精卵显微注射uc.299反义寡核苷酸,观察对斑马鱼心脏发育的影响。结果:与对照组相比,沉默uc.299对P19细胞分化有明显的抑制作用,心肌细胞跳动频率降低,各心肌标志物表达水平有明显下调。斑马鱼实验表明,沉默uc.299可造成斑马鱼心脏明显水肿。结论:沉默uc.299可影响P19分化和斑马鱼心脏发育,表明uc.299对维持心脏正常发育具有一定作用。

Pax-8基因在大鼠心肌细胞凋亡中的作用

目的用RNA干扰技术选择性下调大鼠心肌细胞中转录因子Pax-8的表达,观察其对心肌细胞凋亡和增殖的影响。方法将H9C2(2-1)大鼠胚胎心肌细胞分为3组:针对Pax-8基因的小干扰RNA(Pax-8 siRNA)组,非特异性siRNA(NCsiRNA)组和空白对照组。前两组分别给予相应siRNA(5μl)和Lipofectamine 2000(5μl)配制成的siRNA-脂质体复合物溶液,空白对照组给予等量的细胞培养基。采用RT-PCR和Western blotting测定Pax-8的mRNA和蛋白质表达,荧光光度法检测半胱天冬酶(Caspase)-3活性以反映细胞凋亡,CCK-8法检验细胞的增殖抑制率。结果与NCsiRNA组和空白对照组比较,Pax-8 siRNA组的Pax-8 mRNA表达分别下调60.30%(P<0.05)和63.09%(P<0.05),蛋白表达分别下调50.38%(P<0.05)和54.17%(P<0.05),而NCsiRNA组与空白对照组间无显著差异(P>0.05)。Pax-8 siRNA组的Caspase-3活性较NCsiRNA组和空白对照组明显升高(P<0.01),而后两者间无显著差异(P>0.05)。Pax-8 siRNA组的细胞增殖抑制率明显高于NCsiRNA组(P<0.01)。结论Pax-8 siRNA能选择性下调心肌细胞中Pax-8的表达,并促进细胞凋亡、抑制细胞增殖。

心脏发育相关的微小RNA差异表达分析

目的探讨微小RNA（miRNA）在心脏发育中的作用。方法建立先天性心脏病-室间隔缺损相关基因Pax-8敲除小鼠模型Pax·8KO-／-（纯合子）及Pax-8KO＋／-（杂合子），提取纯合子和杂合子小鼠心脏总RNA，采用含有567种miRNA的芯片进行检测并分析miRNA表达谱的差异，并通过荧光实时定量PCR技术对结果进行验证。结果纯合子小鼠比杂合子小鼠左心室腔扩大，左心室壁肥厚，室间隔增厚，左室乳头肌肥大，心脏呈球形。超声结果显示杂合子小鼠左室收缩末期内径[（LVIDs）（1．23±0．25）mm比（1．93±0．50）mm]和左室舒张末期内径[（LVIDd）（2．13±0．18）mm比（2．89±0．29）]均明显小于纯合子小鼠，差异均有统计学意义（均P〈0．01）心肌左心室壁以及室间隔组织可见大量的凋亡心肌细胞。在纯合子小鼠发现miRNA表达谱中差异表达的miRNA共10个，其中2个miRNA表达下调，8个miRNA表达上调。荧光实时定量RT-PCR结果与芯片结果基本符合。结论miRNA参与心脏发育过程，在先天性心脏病室间隔缺损的发病机制中可能发挥重要作用。