敲减ARHGAP30基因对宫颈癌Siha细胞增殖及凋亡的影响

目的探究敲减Rho鸟苷三磷酸酶激活蛋白30(Rho GTPase-activating protein 30,ARHGAP30)后,宫颈癌Siha细胞增殖及凋亡的变化。方法设计特异性shARHGAP30引物并连接pLKO.1载体,转化到大肠杆菌感受态细胞中,再与慢病毒辅助质粒转入HEK-293T细胞,收集细胞上清获得的病毒过滤后感染Siha细胞,RT-qPCR和Western blot检测敲减效率,以及转染后Bax及Bcl-2的表达变化;CCK-8法检测敲减后细胞的增殖水平。结果成功构建敲减ARHGAP30基因的慢病毒质粒,并建立Siha稳转细胞,ARHGAP30在Siha细胞中的转录和翻译减少(P<0.01),Bax/Bcl-2明显降低(P<0.01),凋亡减少,细胞增殖水平升高(P<0.01)。结论ARHGAP30参与Siha细胞的增殖与凋亡,调控ARHGAP30基因或将干扰宫颈癌的发生和发展。

蛇葡萄素通过PI3K/AKT/mTOR通路诱导人宫颈癌细胞SiHa自噬

目的研究蛇葡萄素(ampelopsin,AMP)诱导人宫颈癌细胞SiHa发生自噬及其可能的作用机制。方法单丹磺酰胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法观察AMP对SiHa和C-33A细胞自噬的影响;透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)观察经AMP干预的SiHa和C-33A细胞超微结构的变化;自噬双标腺病毒转染(mRFP-GFP-LC3)法检测SiHa细胞自噬流强度;Western blot法对SiHa细胞中自噬相关蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg13及PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白的表达情况进行检测。结果MDC染色结果显示,随着AMP浓度的升高,代表自噬小体的亮绿色逐渐增多;TEM实验结果表明,与空白对照组相比,AMP组细胞线粒体嵴溶解消失,同时可见自噬小体和自噬溶酶体;mRFP-GFP-LC3实验结果提示,随着AMP浓度的升高,细胞内自噬小体和自噬溶酶体增多,提示自噬流增强;同时发现LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg13蛋白表达上调,P62、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达下调,表明AMP可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导SiHa细胞发生自噬;加入3-MA后,与AMP组相比,3-MA和AMP联合组的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表达水平上升,提示自噬被抑制后,PI3K/AKT/mTOR信号通路被逆转。结论AMP可诱导SiHa细胞发生自噬,其机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活有关。

LINC00958通过上调VEGF-C表达促进宫颈癌细胞的恶性生物学行为及小鼠模型的淋巴结转移

目的:探讨LINC00958/血管内皮生长因子C(VEGF-C)信号通路在宫颈癌的淋巴管生成和淋巴转移中的作用。方法:从2020年9月至2022年9月期间在河南省人民医院接受手术的患者中收集了42例宫颈癌组织标本,通过qPCR检测宫颈癌组织和宫颈癌细胞(Hela、C33A、SiHa、Caski)中LINC00958的表达情况。将LINC00958过表达载体(LINC00958组)或对照载体(CMV组)转染Caski细胞,敲减LINC00958(shLINC00958组)、VEGF-C(shVEGF-C组)的shRNA序列或阴性对照shRNA(shNC组)转染SiHa细胞。分别通过CCK-8法、Transwell实验检测过表达或敲减LINC00958对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。观察转染后细胞的培养上清液对人淋巴管内皮细胞(HLEC)淋巴管形成能力的影响。建立小鼠腘淋巴结转移模型,观察过表达LINC00958或同时敲减VEGF-C对宫颈癌淋巴结转移的影响。结果:LINC00958在宫颈癌组织中呈高表达(P<0.001),高水平的LINC00958与大肿瘤、晚期肿瘤分级、浸润深度和淋巴转移有关联(P<0.05或P<0.01)。与正常人宫颈上皮细胞ende1617相比,宫颈癌细胞中LINC00958水平均显著升高(P<0.01或P<0.001)。shLINC00958组SiHa细胞的增殖、迁移、侵袭能力及其培养上清液的促HLEC淋巴管形成能力均显著低于shNC组(P<0.05、P<0.01或P<0.001),LINC00958组Caski细胞的增殖、迁移、侵袭能力及其培养上清液的促HLEC淋巴管形成能力显著高于CMV组(P<0.05、P<0.01或P<0.001)。通过RNA下拉、RNA免疫沉淀实验发现宫颈癌细胞中LINC00958能够特异性结合VEGF-C。LINC00958+shVEGF-C组Caski细胞的增殖、迁移、侵袭能力及其培养上清液的促淋巴管形成能力显著低于LINC00958组(P<0.01或P<0.001);在小鼠腘淋巴结转移模型中,LINC00958+shVEGF-C组中小鼠腘窝淋巴结的体积和VEGF-C蛋白、N-cadherin蛋白以及LYVE-1的阳性细胞比例均显著低于LINC00958组(均P<0.001)。结论:LINC00958通过直接与VEGF-C蛋白相互作用增强宫颈癌细胞的增殖、侵袭、淋巴管生成能力,促进小鼠腘淋巴结转移模型的淋巴结转移。

CRISPR/Cas9敲除内源TCR增强TCR-T细胞对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的杀伤

目的:基于CRISPR/Cas9基因编辑技术制备无内源TCR的TCR-T细胞并鉴定其在体外杀伤HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的功能。方法:培养健康志愿者外周血CD8^(+)T细胞和Jurkat细胞,CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除CD8+T、Jurkat细胞的TCR基因,制备过表达转基因TCR的重组慢病毒,在敲除内源性TCR的CD8^(+)T和Jurkat细胞中用慢病毒过表达转基因TCR制备TCR-T细胞,多色FCM检测TCR-T细胞中TCR和CD3的表达水平,荧光素酶活性实验检测TCR-T细胞对HPV16阳性SiHa细胞的杀伤效率。结果:CRIPSR/Cas9基因编辑技术高效地敲除了外周血CD8^(+)T细胞和Jurkat细胞中的TRAC和TRBC基因,敲除效率分别为(81.4±4.5)%、(98.5±0.07)%,制备的无内源TCR的TCR-T细胞高效表达转基因TCR,在外周血CD8^(+)T和Jurkat细胞中表达率为(66.0±17.8)%、(97.3±2.6)%,敲除内源TRAC和TRBC基因有效增强CD8^(+)T和Jurkat细胞膜表达转基因TCR(均P<0.01),敲除内源TCR增强TCR-T细胞特异性杀伤HPV16阳性的SiHa细胞[(71.4±1.0)%vs(35.1±2.0)%,P<0.01)]。结论:无内源TCR的TCR-T细胞显著增强转基因TCR的表达和对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的靶向杀伤能力,为提高TCR-T细胞的临床疗效提供了实验依据。

粉防己碱联合顺铂抑制宫颈癌细胞生长的作用和机制研究

目的:研究电压门控钾离子通道Kv10.1在宫颈癌中的表达,探讨Kv10.1特异性抑制剂粉防己碱(tetrandrine,TET)单独或与顺铂(cisplatin,DDP)联合使用对宫颈癌细胞生长抑制的作用及可能的分子机制。方法:免疫组化检测宫颈癌及正常宫颈组织中Kv10.1蛋白的表达情况。不同浓度的TET、DDP单药或联合处理宫颈癌SiHa细胞24 h后,采用MTT法检测各组细胞的增殖能力,采用流式细胞技术检测细胞周期,采用Western Blot法检测各组细胞中Eag1及PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达水平。向TET组与对照组加入PI3K激动剂740Y-P,采用细胞克隆技术检测细胞生长情况,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力,采用划痕实验检测细胞迁移能力,采用实时荧光定量PCR检测细胞Kv10.1表达水平,并进行统计学分析。结果:Kv10.1在宫颈癌组织中的表达明显高于正常宫颈组织,两者差异具有统计学意义(P<0.05),TET、DDP单药及双药联合组均能抑制SiHa细胞的增殖,促进细胞凋亡,其效应呈浓度依赖性,以联合用药组效果最为显著(P<0.05)。Western Blot显示TET单药可降低Kv10.1、p-PI3K和p-Akt蛋白表达,与DDP联合作用后效果更显著(P<0.05);与TET组相比,TET+740Y-P组克隆、侵袭、迁移细胞数量及Kv10.1表达水平均明显增高(P<0.05);与740Y-P组相比,TET+740Y-P组克隆、侵袭、迁移细胞数量及Kv10.1表达水平明显下降(P<0.05)。结论:Kv10.1在宫颈癌组织中的表达显著上调,提示其可能与宫颈癌的发生发展相关。Kv10.1特异性抑制剂TET可抑制PI3K/Akt信号通路,下调Kv10.1,从而提高宫颈癌细胞对顺铂治疗的敏感性,为宫颈癌治疗中DDP的减毒增效提供策略。

中药药用成分β-谷甾醇的预测及其对辐照宫颈癌细胞增殖与迁移的影响

目的预测宫颈癌差异基因的靶向中药关键药用成分,并分析其对辐照宫颈癌细胞增殖与迁移的影响。方法通过Coremine Medical、TCMSP、Uniprot以及Cytoscape数据库查找宫颈癌差异基因靶向中药及其药用成分和对应靶点,并筛选出核心靶点和关键药用成分。通过STRING数据库分析关键药用成分对应靶点基因与宫颈癌差异基因的蛋白互作。采用MTT、细胞划痕实验和Western blotting实验检测关键药用成分对辐照前后宫颈癌HeLa、Siha细胞增殖、迁移和DNA断裂水平的影响。结果共预测出宫颈癌差异基因的有效靶向中药9种。共得到96种药用成分和252个靶点基因,其中关键药用成分为β-谷甾醇,并筛选出其对应的核心靶点基因10个。β-谷甾醇的相关核心靶点基因与宫颈癌差异基因表达蛋白存在互作。β-谷甾醇抑制辐照前后宫颈癌细胞的增殖与迁移,促进宫颈癌HeLa细胞以及Siha细胞的DNA断裂水平。结论预测宫颈癌差异基因的靶向中药关键药用成分为β-谷甾醇,其可抑制辐照宫颈癌细胞的增殖与迁移。

丹参酮ⅡA抗宫颈癌鳞癌细胞增殖效应及其雌激素受体亚型介导机制的研究

目的观察丹参酮ⅡA对宫颈癌鳞癌Siha细胞增殖的影响,探讨其作用机制。方法不同浓度丹参酮ⅡA作用人宫颈癌鳞癌Siha细胞,MTT法和流式细胞术测定Siha细胞增殖速率和增殖周期分布,Western blot测定Siha细胞磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、细胞周期蛋白(Cyclin)D表达。结果 1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA显著抑制宫颈癌鳞癌Siha细胞增殖,该抑制作用可被雌激素受体(ER)α拮抗剂MPP增强、可被ERβ拮抗剂PHTPP减弱;1×10-5、5×10-6、1×10-6 mol/L丹参酮ⅡA干预后Siha细胞增殖指数显著下降;1×10-5、5×10-6、1×10-6、5×10-7 mol/L丹参酮ⅡA干预后Siha细胞p-ERK、Cyclin D蛋白表达水平显著降低。结论丹参酮ⅡA抑制宫颈癌鳞癌Siha细胞增殖是通过靶细胞ER途径实现的,并通过降低p-ERK、Cyclin D表达量发挥抗增殖作用。

miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响及其靶基因的初步研究

目的探讨miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。方法将SiHa细胞分成3组,分别转染miR-1246mimics(模拟物)、miR-1246inhibitor(抑制物)、空白质粒,并测定转染效率。采用MTT法对比转染后SiHa细胞增殖能力的区别;Transwell小室、划痕实验对比转染后SiHa细胞侵袭、迁移能力的区别;Western blot对比转染后SiHa细胞表达THBS2(血小板反应蛋白2)的区别。构建THBS2的3UTR双荧光素酶质粒,与miR-1246共转染入SiHa细胞,检测荧光素酶的相对活性。结果转染miR-1246mimics的SiHa细胞,MTT试验显示其增殖能力较另外两组强;划痕实验显示细胞的迁移能力较另两组强;迁移、侵袭实验显示该组细胞穿膜数量较另外两组多(P<0.01);WB实验显示其THBS2蛋白低表达(灰度值6.28±10.22,与空白对照组相比P=0.013)。转染miR-1246inhibitor的SiHa细胞,MTT试验显示其生长速度较另外两组慢;划痕实验显示细胞的迁移能力较另两组弱;迁移、侵袭实验显示该组细胞穿膜数量较另外两组少(P<0.01);WB实验显示其THBS2蛋白表达稍高(灰度值12.90±19.81,与空白对照组相比P=0.037)。共转染miR-1246mimics和包含THBS2的3UTR端双萤光素酶质粒后,SiHa细胞荧光素酶表达降低。结论 miR-1246对人宫颈癌SiHa细胞的增殖、侵袭、迁移能力有促进作用,THBS2是其靶基因,降调靶蛋白THBS2的表达,可能是miR-1246促进宫颈癌发生发展的其中一个机制。

RNAi抑制Ku80表达后促进宫颈癌SiHa细胞的放射敏感性

背景与目的:Ku80为细胞受辐射致DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)后的主要修复蛋白之一,Ku80的高表达预示着宫颈癌组织对放射线的抵抗,本研究运用RNAi技术抑制Ku80表达,观察宫颈癌Si-Ha细胞对X线敏感性的变化。方法:构建1个靶向抑制Ku80的siRNA表达载体和1个阴性对照质粒,稳定转染入SiHa细胞后Western blot和RT-PCR检测Ku80表达变化;6 MV X线照射10 Gy后20 h、28 h和48 h收集细胞,流式细胞术检测细胞凋亡率;克隆形成实验检测细胞D0、SF2和α等值。结果:构建表达质粒转染SiHa细胞经筛选后获得2个稳定转染细胞株,Western blot和RT-PCR分析表明转染pKu80-siRNA的阳性克隆Ku80在mRNA和蛋白质水平均受到明显抑制;X线照射28 h及48 h后,Ku80表达受抑细胞其凋亡率均显著高于转染阴性质粒组和空白对照组(P<0.05);Ku80受抑细胞的D0和SF2值分别为1.330和0.425,低于转染阴性质粒细胞(1.748和0.580)和空白对照细胞(1.835和0.597),α值为0.295,高于转染阴性质粒细胞(0.176)和空白对照细胞(0.188)。结论:运用RNAi技术可以有效抑制Ku80的表达从而促进SiHa细胞对X线的敏感性,Ku80可能是一个较理想的肿瘤分子治疗靶点。

表观遗传修饰介导抑制SOSTDC1表达促进宫颈癌细胞的恶性生物学行为

目的:探究含硬化蛋白域蛋白1(SOSTDC1)对宫颈癌细胞恶性生物学行为的调控及其分子机制。方法:收集2020年8月至2022年5月间在福建省肿瘤医院活检或手术切除的53例宫颈癌组织和相应的癌旁组织标本,免疫组化法检测SOSTDC1蛋白在宫颈癌组织及相应癌旁组织中的表达,qPCR法检测正常宫颈细胞、宫颈癌细胞中SOSTDC1 mRNA表达;将SOSTDC1过表达慢病毒(OE-sostdc1)和对照空病毒(NC)感染宫颈癌细胞SiHa及CaSki,将其分为SiHa-OE-sostdc1、SiHa-NC、CaSki-OE-sostdc1、CaSki-NC组,采用WST-1法、细胞集落形成实验、Transwell实验和WB法检测转染各组SiHa及CaSki细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力和BMP、Wnt/β-catenin信号途径相关蛋白及上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白的表达。用DNA甲基化酶抑制剂5-氮杂2'-脱氧胞苷(5'-Aza-CdR)处理宫颈癌细胞后采用qPCR和WB法检测SOSTDC1 m RNA及蛋白的表达变化,用甲基化特异性PCR(MSP)检测5例配对宫颈癌组织与癌旁组织中SOSTDC1基因启动子区甲基化水平,同时qPCR检测其SOSTDC1 mRNA水平。结果:与癌旁组织比较,SOSTDC1蛋白在宫颈癌组织中呈低表达(P<0.01),且与淋巴结转移与FIGO分期有关联(均P<0.05);与正常宫颈HUCEC细胞比较,SOSTDC1 mRNA在宫颈癌C33A、HeLa、SiHa、CaSki细胞中均呈低表达(均P<0.01)。过表达SOSTDC1显著抑制SiHa及CaSki细胞的增殖、迁移和侵袭能力(均P<0.05)。WB法结果检测显示,过表达SOSTDC1显著抑制SiHa及CaSki细胞中磷酸化Smad、Dvl2/3、β-catenin、VIM、N-cadherin、Snail蛋白的表达(均P<0.05),5'-Aza-CdR处理后的SiHa及CaSki细胞中SOSTDC1 mRNA和蛋白水平均显著增加(均P<0.05),MSP检测结果显示,相较于癌旁组织,宫颈癌组织中SOSTDC1基因启动子区呈高度甲基化,且SOSTDC1 mRNA水平降低(P<0.01)。结论:SOSTDC1在宫颈癌组织中呈低表达且与肿瘤的恶性进展关联,其表达下调与其基因启动子区高度甲基化有关,过表达SOSTDC1可能通过阻断BMP及Wnt/β-catenin信号通路从而抑制SiHa、CaSki细胞的增殖、侵袭和迁移能力。

GBX2过表达促进人宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移及侵袭

目的:探讨GBX2基因在人宫颈癌SiHa细胞增殖和侵袭转移中的作用及其机制。方法:应用质粒转染技术,分别将过表达GBX2基因重组质粒pCMV6-entry-GBX2(实验组)及空载体质粒pCMV6-entry(阴性对照组)转染到宫颈癌SiHa细胞中,用WST-1法、集落形成实验、流式细胞术分别检测转染细胞的增殖、集落形成和细胞周期,用划痕愈合实验、Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭能力,用ELISA法检测细胞培养上清中IL-6的表达水平,用WB检测EMT相关蛋白的表达变化并探讨其可能的作用机制。结果:与SiHa/pCMV6组相比,上调GBX2表达后:(1)SiHa/GBX2组细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力明显增强(均P<0.01),G0/G1期的细胞比例减少、S期与G2/M期的细胞比例增加(均P<0.01)(;2)SiHa/GBX2组细胞EMT相关蛋白上皮钙黏蛋白表达水平下降,神经钙黏蛋白、波形蛋白和snail表达水平上调(均P<0.01)(;3)SiHa/GBX2组细胞培养上清中IL-6的表达水平明显增高(P<0.01);(4)SiHa/GBX2组细胞STAT3磷酸化水平增强,并能被STAT3抑制剂S31-201抑制(P<0.01)。结论:GBX2可能通过IL-6/STAT3通路诱导宫颈癌SiHa细胞EMT,从而促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

利用斑马鱼模型研究芦荟大黄素对宫颈癌细胞SiHa的抑制作用

通过细胞增殖实验(MTT)研究不同浓度芦荟大黄素(Aloe emodin,AE)对人宫颈癌细胞Si Ha生长的抑制作用,并将Si Ha细胞注入48 hpf的斑马鱼胚胎卵黄囊,建立斑马鱼移植瘤模型,然后用不同浓度AE进行处理,考察肿瘤细胞在斑马鱼体内的增殖和迁移情况。结果显示,AE对Si Ha细胞的生长抑制率随浓度和作用时间的增加而呈明显上升趋势,表现出一定的浓度-时间-效应依赖关系;体内实验表明AE对斑马鱼移植瘤的增殖和转移具有抑制作用。本研究表明,AE具有开发成抗宫颈癌药物的潜能,同时斑马鱼移植瘤模型也可以成为宫颈癌研究和药物评价的重要模型。

清毒栓含药血清对宫颈癌SiHa细胞MDM2基因的影响

目的研究中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用,从细胞生物学及分子生物学水平探讨清毒栓对抑制宫颈癌SiHa细胞生长的作用机制。方法以不同浓度清毒栓含药血清培养液作用于SiHa细胞,并设立空白血清及含中、西药阳性对照药血清为对照,通过MTT法检测清毒栓对细胞生长增殖的影响;用流式细胞分析技术进行细胞周期及细胞凋亡检测,并用RT-PCR法半定量检测原癌基因MDM2表达。结果经清毒栓含药8%的血清培养液作用后细胞数量减少,其中以血清作用72h时对细胞抑制作用最强,与空白组比较,差异有显著性(P<0.01);细胞周期各时相中,清毒栓含药血清S期细胞所占的比例明显减少,对细胞凋亡有影响,但未见明显规律性,RT-PCR结果示清毒栓含药血清细胞中MDM2表达明显减少。结论清毒栓含药血清不仅可直接抑制宫颈癌细胞的生长,并可能通过下调MDM2基因表达的分子机制,达到抑制肿瘤的目的。

3,3’-二吲哚甲烷对宫颈癌SiHa细胞增殖抑制的实验研究

目的研究吲哚-3-甲醇(I3C)的重要衍生物3,3’-二吲哚甲烷(DIM)对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的影响。方法采用CCK-8法检测不同浓度DIM对SiHa细胞体外生长的抑制作用,流式细胞术检测DIM对SiHa细胞凋亡的影响,荧光显微镜观察细胞形态的变化;Western blotting检测不同浓度DIM对SiHa细胞凋亡相关蛋白表达的影响。结果 DIM对SiHa细胞的抑制作用呈时间-剂量依赖性,DIM对SiHa细胞干预48h的半数抑制浓度(IC50)为44.44μmol/L。分别以25、50、100μmol/L的DIM处理48h后,SiHa细胞的凋亡率分别为(10.09±1.32)%、(21.11±3.36)%和(55.46±6.33)%,阴性对照组为(4.56±0.52)%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。不同浓度DIM处理48h后,荧光显微镜下SiHa细胞呈现皱缩、变圆,并形成明显的凋亡小体。Western blotting显示随着DIM浓度的增加,SiHa细胞中MAPK家族的ERK、p38和p-p38蛋白的表达水平受抑制,JNK、p-JNK蛋白的表达水平上调,PI3K家族的Akt、p-Akt、PI3K p110α、PI3K p110β、PI3K classⅢ、GSK3-β、p-PDK1和p-c-Raf蛋白的表达也受到抑制。结论 DIM能抑制SiHa细胞的生长并诱导细胞凋亡,其作用机制是通过对MAPK家族和PI3K家族凋亡相关蛋白表达的调控实现的,并将有可能成为一种有效的抗宫颈癌药物。

异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞增殖影响的实验研究

目的:探讨异紫堇定碱(Isocorydione)对人宫颈癌Siha细胞增殖的影响。方法:以100、200、400、800、1 200μmol/L浓度的异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞体外干预,分别作用24、48、72 h后,采用MTT法检测异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞生长增殖的作用;流式细胞仪检测异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞周期的影响;结合Hoechst染色观察处理后Siha细胞核微形态的变化;Western Blot法检测异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞作用后凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达的影响。结果:MTT结果显示不同浓度的异紫堇定碱作用于人宫颈癌Siha细胞后具有明显的抑制其增殖的作用,呈剂量-时间依赖关系(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示400μmol/L的异紫堇定碱作用于人宫颈癌Siha细胞后,细胞周期发生明显改变,其中G1和S期细胞比例变化不明显,但G2期细胞明显减少(P<0.05);Hoechst染色结果显示,与对照组比较,400μmol/L的异紫堇定碱作用于Siha细胞48 h后形态缩小、细胞核固缩,出现核碎裂形成凋亡小体;Western Blot结果显示400μmol/L的异紫堇定碱分别作用于人宫颈癌Siha细胞24、48、72 h后,其Bax蛋白表达增加,而Bcl-2蛋白表达逐渐减少,Bax/Bcl-2比值增加,Caspase-3蛋白表达逐渐增多。结论:异紫堇定碱对人宫颈癌Siha细胞增殖具有明显的抑制作用,其促使细胞发生凋亡行为可能与线粒体凋亡途径的蛋白有关。

转化生长因子β1对宫颈癌Siha细胞microRNA表达谱的影响

目的 探讨转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)对宫颈癌Siha细胞microRNA(miRNA)表达谱的影响及其意义。方法 应用miRNA芯片检测TGF-β1处理宫颈癌Siha细胞前后的miRNA表达谱;实时荧光定量RT-PCR验证差异表达的miRNA;生物信息学技术用于分析由差异表达的miRNA调节的可能靶基因。结果 TGF-β1处理宫颈癌Siha细胞48 h,miRNA的表达谱存在39个差异表达的miRNA,其中27个表达上调,12个表达下调。选择其中差异倍数大的2个miRNA(hsa-miR-494-3p,hsa-miR-378a-5p)进行实时荧光定量RT-PCR验证,结果与芯片结果一致。结论 TGF-β1影响宫颈癌Siha细胞miRNAs的表达,这些差异表达的miRNAs可能参与了宫颈癌的浸润转移。

shRNA干扰VEGF的表达对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响

目的利用RNA干扰技术抑制S iHa细胞中血管内皮生长因子(VEGF)的基因表达,探讨其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用。方法设计针对VEGF的两种短发夹RNA(shRNA),分别构建PGPU6/GFP/Neo-VEGF重组质粒表达载体,命名为pv1、pv2。利用脂质体将质粒转染入人宫颈癌S iHa细胞,采用RT-PCR方法检测VEGF mRNA的变化情况。筛选出抑制率较高的质粒进行下一步实验;转染后,用流式细胞术检测细胞凋亡。结果 pv1、pv2对VEGF mRNA均有显著的抑制作用,抑制率分别为(82.17±4.45)%和(64.55±3.80)%,显著高于阴性对照组的(7.63±4.13)%(P<0.05)。pv1转染组的细胞凋亡率为(47.85±4.65)%,明显高于阴性对照组的(17.76±2.12)%和空白对照组的(19.66±3.74)%(P<0.01)。结论 RNA干扰技术可以有效沉默人宫颈癌细胞株S iHa中VEGF mRNA的表达,并可诱导宫颈癌细胞凋亡。

中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞抑制作用的影响

目的研究中药清毒栓对体外培养的宫颈癌Si Ha细胞增殖及凋亡是否具有抑制和诱导的作用。方法采用噻唑蓝(MTT)比色实验及吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)双染法检测Si Ha细胞增殖及凋亡的变化及细胞迁移实验法检测Si Ha细胞迁移数量。结果不同剂量清毒栓及保妇康栓药物作用后各组Si Ha细胞增殖数量明显减少、凋亡率明显增加及迁移数量明显减少。中药清毒栓作用于Si Ha细胞48 h其抑制作用最明显。清毒栓高剂量组分别与清毒栓中、低剂量组及正常对照组差异显著(P<0.05);中药清毒栓作用Si Ha细胞在24、72 h时各组差异均不明显(P>0.05)。结论清毒栓的作用可能是通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡导致肿瘤细胞减少对宫颈癌Si Ha细胞产生影响。

清毒栓血清药理对宫颈癌SiHa细胞P53基因调控作用的研究

[目的]研究中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞生长的调节作用,从细胞生物学及分子生物学水平探讨清毒栓抑制宫颈癌SiHa细胞生长的作用机制。[方法]以不同浓度含药血清培养液作用于SiHa细胞,并以空白血清及含中、西药阳性对照药血清为对照,通过噻唑蓝(MTT)法检测该药对细胞生长及增殖的影响;用流式细胞分析技术进行细胞周期及细胞凋亡检测并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法半定量检测对抑癌基因P53表达的影响。[结果]经含药血清培养液作用后细胞数量减少,其中以8%浓度含药血清作用72h时对细胞抑制作用最强;细胞周期各时相中,S期细胞所占的比例明显减少;对细胞凋亡有影响但未见明显规律性,RT-PCR结果示细胞中P53表达明显增加。[结论]清毒栓含药血清不仅可直接抑制宫颈癌细胞的生长,并可能通过调控P53基因表达的分子机制,达到抑制肿瘤的目的。

中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞凋亡的影响

目的探讨中药清毒栓对宫颈癌SiHa细胞增殖抑制及凋亡的作用。方法设立空白血清组及中药清毒栓组、保妇康栓组、西药安达芬组,以4%含药血清培养液作用于SiHa细胞,分为3个时间点,通过MTT法检测各组对细胞增殖抑制的影响;同时运用流式细胞分析技术进行TUNEL法检测晚期细胞凋亡的变化。结果经含药血清培养液作用后各组SiHa细胞数量减少,其中以作用72h时对细胞抑制作用最强,与空白血清组比较,差异有统计学意义(P<0.01),且抑制作用安达芬组>清毒栓组>保妇康组,清毒栓组与安达芬组间差异有统计学意义(P<0.05)。各含药血清组对细胞凋亡均有显著的影响,且明显优于空白血清组(P<0.05),各含药血清组凋亡率依次为清毒栓组>保妇康组>安达芬组,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论清毒栓含药血清通过促进细胞凋亡而达到抑制肿瘤的目的。