fat-1基因密码子优化及在家兔胎儿成纤维细胞中的初步表达

根据家兔基因密码子使用偏好性,对引自GenBank的秀丽隐杆线虫fat-1基因编码序列进行密码子优化,通过全基因合成的方法获得优化后的fat-1基因（命名为opfat-1）;从秀丽隐杆线虫中RT-PCR扩增获得fat-1。将扩增的fat-1和合成的opfat-1基因分别构建到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-C1中。采用脂质体Lipo-fectamineTM转染法将fat-1和opfat-1基因转入家兔胎儿成纤维细胞（Rabbit fetal fibroblast cells,rFFCs）中。对比不同DNA和转染试剂用量以及细胞暴露于DNA、转染试剂中作用时间探讨影响rFFCs转染效率的参数,经过优化,最优的rFFCs转染条件为：LipofectamineTM用量2~3μl,DNA量0.8~1.0μg,LipofectamineTM与DNA、细胞共培养时间为8 h。通过绿色荧光标记和RT-PCR检测转染细胞中融合蛋白和目的基因的表达。密码子优化的opfat-1与fat-1相比,体外瞬时表达效率有极为显著的提高;G418抗性筛选获得转基因单克隆细胞,RT-PCR初步验证fat-1和opfat-1基因均在家兔胎儿成纤维细胞中稳定转录表达。