家兔ANXA1蛋白与猪瘟病毒E2蛋白相互作用并影响其复制的研究

本研究团队前期研究发现,猪瘟病毒(CSFV) HCLV株E2蛋白结构域Ⅰ (E2^(Domain Ⅰ))是HCLV株适应家兔的关键结构域,Domain Ⅰ中108位脯氨酸(P)和109位苏氨酸(T)是HCLV株适应家兔必需氨基酸。为进一步探究HCLV适应家兔的分子机制,本研究提取家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白分别与CSFV Shimen (SM)株E2蛋白(SM E2)、HCLV株E2蛋白突变体(HCLV E2^(P108L-T109I))及HCLV株E2蛋白(HCLV E2)共孵育,经SDS-PAGE后通过蛋白质质谱鉴定,结果却意外发现,CSFV SM E2与家兔脾脏淋巴细胞膜蛋白作用后在37 ku左右处多出一条带;质谱分析结果显示其可能为细胞膜蛋白膜联蛋白1 (ANXA1),且与CSFV SM E2蛋白之间可能存在相互作用。为了分析ANXA1在HCLV适应家兔中的作用,将CSFV SM株和HCLV株分别接种家兔,48 h和72 h后分离各组兔外周血单个核淋巴细胞(PBMC),采用RT-q PCR方法检测ANXA1基因m RNA的转录水平。结果显示,与对照组相比,家兔在接种SM株和HCLV株后,ANXA1基因m RNA转录水平均显著(P<0.05)或者极显著(P<0.01)下调,且与接种HCLV株的家兔相比,接种SM株家兔中ANXA1基因m RNA的转录水平极显著(P<0.001,72 h)或者显著(P<0.05,48 h)下调,表明接种SM株后的家兔可能通过调控ANXA1的转录水平抑制SM株的复制。将pCAGGS-Flag-ANXA1和pCAGGS-Flag分别转染HKE293T细胞,48 h后收集细胞样品,通过GST pulldown验证ANXA1与CSFV SM E2蛋白的相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为强毒实验组,将pCAGGS-Myc-HCLV E2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为弱毒实验组,48 h后采用Co-IP试验验证ANXA1与不同CSFV E2的相互作用。上述结果进一步表明,ANXA1与CSFV SM E2存在相互作用,但其与HCLV E2无相互作用;将pCAGGS-Strep-SME2+pCAGGS-Flag-ANXA1共转染HEK293T细胞作为实验组,采用激光共聚焦显微镜观察发现SM E2蛋白和ANXA1蛋白共定位于细胞浆中。将表达ANXA1的重组质粒转染ST细胞,48 h后分别接种CSFV SM株和HCLV株,采用RT-q PCR检测CSFV基因的拷贝数。结果显示,与转染pCAGGS-Flag的ST细胞相比,接种CSFV SM株的细胞中病毒基因拷贝数极显著上升(P<0.01),而接种HCLV株细胞中病毒基因拷贝数无明显变化。表明过表达ANXA1后可以促进CSFV强毒株的复制,但不影响弱毒株的复制。本研究首次证实,家兔脾脏淋巴细胞ANXA1通过与CSFV SM E2蛋白的相互作用促进CSFV的复制,为进一步研究CSFV E2蛋白的功能奠定了基础。

基于高通量测序技术分析家兔感染猪瘟兔化弱毒株后脾脏的转录组学变化

本研究基于高通量测序技术对感染猪瘟兔化弱毒株(C株)后0h,12h,24h,30h,36h,48h的家兔脾脏组织进行测序,以家兔基因组作为参考,筛选感染后各时间点和对照组(0h)之间的差异基因。利用Uniprot和NCBI数据库查找各组中变化水平显著的前10个差异基因的生物学功能。结果发现,感染后12h,24h,30h的前10个差异基因只有少数与炎症、免疫、凋亡等相关;感染后36h,48h的前10个差异基因完全相同,其中B2M、RLA-DR-ALPHA、CD74和IGJ参与抗病毒过程。GO功能注释结果显示:感染后各时间点的差异基因都和免疫、代谢、调控途径紧密相关。KEGG通路富集分析发现,感染后24h的差异基因富集到RIG-I样受体信号通路,感染后30h的差异基因富集到黏着斑和细胞外基质-受体相互作用通路,感染后36h和48h的差异基因共同富集到的通路有20个,其中蛋白酶体,溶酶体,核糖体,趋化因子信号通路,B细胞受体信号通路,抗原加工提呈通路和FcγR介导的吞噬通路与抗病毒相关。本研究建立的家兔感染C株后脾脏组织的差异表达基因数据库,将为进一步阐述家兔适应C株的分子机制奠定基础。