家福捕鸟蛛毒腺cDNA文库构建及其毒素-16序列和活性分析

家福捕鸟蛛(Selenocosmia jiafu)是一种生活在广西、云南等地的蜘蛛新种。为了阐明其毒素的分子多样性和筛选河豚毒素不敏感型(Tetrodotoxin-resistant,TTX-R)钠通道抑制剂,利用SMART法构建了毒腺全长cDNA文库,并进行DNA测序和表达序列标签(Expressed sequence tags,ESTs)聚类分析。结果表明家福捕鸟蛛毒腺双链cDNA条带分布在300~3 000 bp。经测序得到752个高质量的EST序列,去冗余后得到257个唯一序列,其中毒素序列438条。家福捕鸟蛛毒素-16(Jiafu toxin-16,JF-16)是从家福捕鸟蛛粗毒中分离得到的1种分子量为3 954.616的哺乳类神经毒素,其全序列为H_2N-ECTKLLGGCTKSSECCPHLGCRRKWPYHCGWDGTF-COOH。研究结果揭示JF-16的全长cDNA为518 bp,编码87个氨基酸。全细胞膜片钳试验结果表明JF-16对大鼠背根神经节(Rat dorsal root ganglion,DRG)细胞TTX-R钠通道具有抑制作用。说明JF-16是一种潜在的具有镇痛活性的蜘蛛毒素。本研究有利于开展家福捕鸟蛛毒腺转录组研究和JF-16潜在镇痛活性分析。

采用高效液相色谱-质谱考察家福捕鸟蛛粗毒中多肽和蛋白质的多样性

家福捕鸟蛛（Selenocosmia jiafu）是一种生活在中国广西、云南等边远山区、中等个体、产毒量较大和毒性较强的蜘蛛新种。为了对家福捕鸟蛛粗毒成分进行初步探索,采用反相高效液相色谱、基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对粗毒多肽和蛋白质的多样性进行了分析。结果表明：家福捕鸟蛛粗毒经色谱分离后得到40多个色谱峰,经质谱鉴定得到238个多肽,且多肽的相对分子质量呈现出双峰分布,其中62.5%的多肽的相对分子质量分布在3 000-4 500之间,33.2%的多肽的相对分子质量分布在1 000-3 000之间。这种相对分子质量的分布模式不同于其他已经报道的蜘蛛粗毒中多肽的分布模式。电泳分析结果表明：除了相对分子质量在10 000以下的多肽分子,粗毒在50、72和90 kD附近有3条明显的条带,粗毒电泳条带经液相色谱-电喷雾四极杆飞行时间质谱鉴定,主要是一些血蓝蛋白、钾离子通道蛋白、钙蛋白酶等。说明家福捕鸟蛛粗毒中多肽和蛋白质种类丰富。

家福捕鸟蛛毒素-22钠通道活性与基本性质分析

家福捕鸟蛛(Selenocosmia jiafu,S.jiafu)是一种生活在中国广西、云南等地的蜘蛛新种.研究发现其粗毒对大鼠背根神经节(Rat dorsal root ganglion,DRG)细胞河豚毒素不敏感型钠通道(tetrodotoxin-resistant,TTX-R)具有抑制作用.为了筛选得到抑制TTX-R活性的毒素分子,经反相高效液相色谱,从家福捕鸟蛛粗毒中分离得到1种新的毒素分子,命名为家福捕鸟蛛毒素-22(Jiafu toxin-22,JFTX-22).MALDI-TOF质谱分析和氨基酸序列分析表明该多肽毒素分子量为2807.227 Da,全序列为RCLPSGKACAGVTQK IPCCGSCVRGKCS.全细胞膜片钳分析表明JFTX-22对DRG细胞TTX-R通道具有抑制作用.此外,采用生物信息学方法初步分析了JFTX-22的基本理化性质、空间结构预测和同源序列比对等.结果表明JFTX-22的全长cDNA为471bp,编码一个65个氨基酸残基多肽.JFTX-22的二级结构主要以无规卷曲为主,其空间结构主要包含无规卷曲和三段反平行beta-折叠.同源序列比对发现JFTX-22跟Covalitoxin-I序列完全一致,与另外三种蜘蛛毒素JZTX-51、U1-theraphotoxin-Pf3和HWTX-X同源性较高.结果表明JFTX-22是一种潜在的具有镇痛活性的新型毒素分子.

家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞上电压门控离子通道的影响

采用全细胞膜片钳分析,测定了家福捕鸟蛛粗毒对DRG细胞上电压门控钠、钾和钙离子通道的影响.结果表明:粗毒对大鼠背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)细胞上河豚毒素敏感型钠通道、河豚毒素不敏感型钠通道、电压门控钾通道、高电压激活钙通道和低电压激活钙通道都具有抑制作用.100μg/m L的粗毒分别能够抑制64.0%河豚毒素敏感型钠电流、46.5%河豚毒素不敏感型钠电流、44.2%电压门控钾电流和77.7%低电压激活的钙电流.50μg/m L的粗毒能够抑制大约74.9%高电压激活的钙电流.结果表明家福捕鸟蛛粗毒中可能存在开发为新型药物和离子通道工具试剂的毒素分子.