家蚕传染性软化病病毒荧光定量PCR检测技术及浙江省流行病学调查

荧光定量PCR检测技术可实现对病原微生物的早期或快速检测,根据家蚕传染性软化病病毒(BmIFV)的RNA序列,设计了具有物种特异性的引物和探针,建立了荧光PCR检测BmIFV的方法。将设计的引物和探针同时对BmIFV、家蚕微孢子虫(Nb)、家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、家蚕浓核病病毒(BmDNV)和桑叶进行特异性验证,结果显示只有BmIFV得到阳性结果。该方法对含BmIFV目标片段质粒的检测灵敏度达10^(-3)ng/μL,对目标病毒的检测灵敏度为3.4ng/μL。同时,对浙江省嘉兴市秀洲区、湖州市南浔区、嘉兴市桐乡市、嘉兴市海宁市、杭州市淳安县5个蚕区家蚕感染BmIFV情况进行了流行病学调查,结果显示这5个蚕区BmIFV感染率约为3.6%,为浙江省家蚕传染性软化病防治提供参考。

家蚕传染性软化病病毒(桐乡株)VP1基因片段的克隆及序列分析

以首株在中国分离到的家蚕传染性软化病病毒(Bombyx moriinfectious flacherie virus,BmIFV)BmIFV-CHN001基因组为模板,扩增了编码主要结构蛋白的VP1基因。克隆测序后得到VP1基因片段906bp。该序列与已发表的日本毒株相比,核苷酸序列的相似性为99.3%,编码氨基酸的相似性为100%,证明该毒株与家蚕传染性软化病病毒日本株的同源性较高。把BmIFV-CHN001的VP1序列与同属的另外6个昆虫小RNA病毒的结构蛋白进行序列比对,构建系统发育树,对其进化关系进行了初步分析,结果显示这7种病毒具有相近的亲缘关系,而BmIFV-CHN001与蜜蜂囊雏病毒的亲缘关系最近。

关于家蚕传染性软化病病毒增殖和发病控制的研究

1960年发现家蚕传染性软化病病原是一种病毒以后,人们把家蚕传染性软化病研究的重点放在发生生态,防治方法及抗病蚕品种选拔等实用技术上,而病毒侵染、增殖等病理学研究则几乎无人问津。本研究从探讨病毒的早期诊断技术着手。

家蚕传染性软化病病毒的冷冻电子显微镜三维重构

应用冷冻电子显微镜三维重构技术获得了家蚕传染性软化病病毒(Infectious flacherie virus,IFV)衣壳的三维立体结构.重构最终结果使用了5047个病毒粒子的数据.FSC曲线显示该重构结果的分辨率为18?.IFV的衣壳直径为302.4?,遵循拟T=3(P=3)二十面体对称.衣壳为单层,厚度15?,表面光滑致密,无明显突起或凹陷,无孔洞贯穿.将IFV衣壳结构与昆虫的类小RNA病毒-蟋蟀麻痹病毒(Cricket paralysis virus,CrPV)以及人小RNA病毒-人鼻病毒14(human rhinovirus14,HRV14)的衣壳进行比较,发现IFV衣壳结构与CrPV更为接近.与CrPV一样,IFV衣壳表面也缺少"Rossmann峡谷".同时预测了IFV结构蛋白VP2和VP3的肽链折叠拓扑结构,并对亚基在衣壳表面的分布位置进行了推测.

传染性软化病病毒感染家蚕中肠上皮细胞的免疫电镜观察

家蚕传染性软化病病毒(Bombyxmoriinfectious flacherie virus,BmIFV)专一地侵染家蚕中肠上皮组织,造成中肠上皮细胞的超微结构发生病变,在染毒家蚕的中肠杯形细胞内形成特异性小泡体和电子稠密体等特异性结构。电镜观察显示,在感染早期,微绒毛膜、线粒体附近及相邻两个细胞的细胞膜和内质网中较易发现胶体金颗粒(10 nm)的吸附;其后在微绒毛中间和细胞质中,以及内质网和特异性小泡体的界限膜附近出现或较多存在,但线粒体和特异性小泡体的内部未见金颗粒的吸附。因此可以认为:家蚕传染性软化病病毒主要在染毒细胞的各细胞器膜附近出现。

一株传染性软化病病毒的分离和鉴定

病毒性软化病是一种严重影响蚕业生产的流行病，其病原为家蚕传染性软化病病毒（Bombyx mori infectiousflacherie virus，BmIFV）。本实验室在浙江省收集到具有软化病症状的家蚕幼虫，并分离纯化获得一株病毒。电镜观察到病毒粒子为直径26nm左右、无包涵体的球状颗粒。病毒添食四龄起蚕和五龄起蚕，分别在3～4d和5～7d出现明显症状和病变。纯化病毒SDS-PAGE条带与BmIFV蛋白相仿。病毒核酸鉴定为RNA，并可用套式RT-PCR扩增出特异性片段，测序发现片段序列和BmIFV日本坂城株的同源性为99．5％。由此可确定该病毒为BmIFV，这是我国首次分离到该病毒，暂命名为BmIFV-CHN001。

传染性法氏囊病病毒多聚蛋白基因在家蚕中的表达

将传染性法氏囊病病毒 (IBDV)细胞致弱株 (JD1株 )的基因组A节段基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pAcHLT C中 ,获得的重组转移载体pAcHLT C A与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,获得重组病毒BacPAK A。DIG标记的DNA点杂交证实重组病毒基因组中含有A节段基因 ,重组病毒感染家蚕 5龄幼虫进行表达 ,ELISA和Westernblotting等结果表明多聚蛋白基因在蚕体内得到了表达 ,表达产物具有免疫反应性 ,表达量在感染后 5～ 6d达到最高。家蚕生物反应器表达IBDV多聚蛋白具有我国的资源优势 ,为今后研制低成本、实用化的IBDV基因工程疫苗打下基础。

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDVVP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.

传染性法氏囊病病毒VP2基因在家蚕中的表达

传染性法氏囊病病毒 (IBDV)能引起以淋巴细胞衰竭为特征的免疫抑制性疾病。IBDV的主要结构蛋白 VP2蛋白是主要的宿主保护性抗原 ,在 VP2上的点突变是造成 IBDV抗原漂变的主要原因。为研究 VP2作为 IBDV亚单位疫苗的潜力 ,本实验将 IBDV JD1株的 VP2基因重组于家蚕杆状病毒转移载体 p Bac PAK8中 ,将重组载体 p Bac PAK-VP2与病毒 Bm-Bac PAK6的线性化 DNA共转染家蚕培养细胞 ,获得重组病毒 Bac PAK-VP2。DIG点杂交表明重组病毒基因组中含有 VP2基因。重组病毒感染家蚕 5龄幼虫后 ,用 EL ISA、SDS-PAGE和 Western blotting检测蚕血淋巴中重组 VP2蛋白的相对表达量及免疫反应性。结果表明重组 VP2蛋白具有免疫反应性 ,感染后 5～ 6

家蚕病毒性软化病病毒抗血清的研制及应用

从蚕区农户分离了一株家蚕病毒性软化病病毒,暂命名为BmIFV-CHN001。利用蔗糖密度梯度及差速离心法提纯该病毒,将提纯病毒免疫家兔3次,得到BmIFV抗血清。所制备的抗血清采用琼脂双扩散法检测养蚕农户家蚕样本,调查该病毒病在浙江蚕区的感染现状,调查显示农村饲养家蚕具有较高的感染率。

家蚕病毒性软化病的研究进展

就家蚕病毒性软化病的病原发现、病毒的蛋白构成、病毒基因组的基本结构、结构蛋白的编码域、多元蛋白序列、翻译起始中相关的RNA元件和细胞因子、蛋白质的加工处理、复制机制,以及流行病学等的研究进行了综述。通过BmFV与其它小RNA病毒(或类似小RNA病毒)的比较,认为开展病毒侵染相关的细胞因子研究、病毒基因的功能和病害流行机制等的研究将是十分有意义的工作。

家蚕病毒病抗性研究进展

家蚕病毒病的发病率高、防治难度大、危害程度高。本文综述了近十年来在家蚕核型多角体病毒、质型多角体病毒、浓核病病毒和软化病病毒方面的抗性品种选育、抗性功能基因、抗性功能蛋白、表观遗传等方面的研究进展,对今后运用多手段进行家蚕病毒病防治和抗性理论研究提供参考,为抗病毒药物、抗病毒疫苗的研发提供新的思路。

诱发蚕病毒性软化病的原因及防治方法

病毒性软化病（FV）俗称空头病，是病毒病中传染性较强、蔓延较快的一种病毒病。目前在养蚕过程中时有发生，特别是对种茧育的质量和产量造成很大影响。所谓“诱发”，是由于蚕体经受不良条件刺激后，生理上极度虚弱，从而极大地降低了蚕儿对病毒的抵抗力，所以，在微量病毒存在的情况下，也能被感染而引起发病。

柞蚕传染性软腐病病毒(Iflavirus)功能蛋白的基因克隆和结构分析

从患柞蚕吐白水软化病的病蚕体内分离到一株传染性软腐病病毒属(Iflavirus)病毒。研究柞蚕传染性软腐病病毒基因组结构及主要功能蛋白的结构域,为确定该病毒株的分类学地位和阐释其侵染机制提供基础信息。克隆了编码柞蚕传染性软腐病病毒功能蛋白的RNA解旋酶基因(423 bp)、3C半胱氨酸蛋白酶基因(405 bp)以及RNA依赖性的RNA聚合酶基因(882 bp)。通过同源模建方法,构建了柞蚕传染性软腐病病毒3个功能蛋白的三维结构模型,并采用拉氏图和Profile 3D等方法验证了模型的可靠性。将柞蚕传染性软腐病病毒中RNA依赖性的RNA聚合酶序列与另外16个小RNA病毒同源序列进行比对并构建系统发育树,显示柞蚕传染性软腐病病毒与蜜蜂残翅病病毒和蜜蜂瓦螨虫病毒的亲缘关系十分相近。

家蚕病毒病的传染源与防治对策

家蚕病毒病是传染性蚕病中发生最广,危害最大和防范最难的一类蚕病。据四川省蚕病普查统计,我省每年因蚕病损失蚕茧20.16％(即每年损失茧款 2亿多元),其中病毒病的危害占蚕病损失中的 65-70％,是农家养蚕和蚕种场生产中的常见病和多发病,其潜在威胁是不容忽视的,为了控制该病的流行和蔓延,专业人员已从事很多方面的研究。

"病毒治"对家蚕病毒病的防治效果研究

家蚕病毒病是养蚕生产上最为常见危害又最严重的一类疾病,在我国往往造成大面积暴发,直接影响了蚕桑生产的发展及蚕农的经济利益.目前生产上常见的病毒病有核型多角体病、质型多角体病、病毒性软化病、浓核病.养蚕生产上防治病毒病的技术措施主要是蚕室蚕具及环境的消毒、蚕体蚕座消毒、淘汰病蚕、饲养抗病品种、加强饲养管理等,用添食抗病毒药物进行治疗的研究也很多,但迄今为止尚未研制出十分有效的防病毒病药物.鉴此,山东农业大学、苏州大学和山东宁阳蚕用化工厂共同合作,经过多年的研究研制出一种新型蚕药"病毒治".笔者对其防治及治疗效果做了实验室试验及生产上的试验调查.