云南蚕区家蚕微孢子虫遗传多样性分析

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是蚕业生产上一种重要病害——微粒子病的病原体。探讨家蚕微孢子虫种内的遗传多样性,可为云南蚕区家蚕微粒子病的防控提供参考依据。从云南省不同养蚕地区收集了感染微孢子虫的病蚕样品,分离纯化家蚕微孢子虫并提取基因组,克隆SSU rDNA(small subunit ribosomal DNA)和ITS(internal transcribed spacer)序列并进行生物信息学分析。结果发现,云南蚕区Nosema bombycis分离株SSU rDNA序列同源性高达99%以上,遗传距离小于0.006,它们在长度和多个位点存在差异,呈现不同程度的多态性;ITS遗传差异较为显著,序列中存在多碱基的插入或缺失、单碱基的转换和颠换。基于SSU rDNA和rDNA-ITS序列构建系统发生树,结果显示,云南蚕区家蚕微孢子虫分离株系间存在遗传分化,种群间亲缘关系与地理位置无直接联系。研究结果丰富了云南蚕区家蚕微孢子虫的种内遗传多样性。

家蚕响应微孢子虫感染的可变剪接事件分析

【目的】家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)感染引发的微粒子病是影响蚕业发展的重要病害。为了揭示可变剪接(AS)基因在家蚕响应微孢子虫感染中的作用,对其中肠内的AS事件进行分析。【方法】利用Illumina Hiseq TM 4000测序平台,对健康家蚕(对照组)和被微孢子虫感染的家蚕中肠组织进行转录组测序。使用rMATS软件对样品中的AS事件与差异剪接基因(DSGs)进行鉴定,并对DSGs进行GO富集和KEGG信号通路分析。【结果】在对照组和感染组中分别检测到5346个和4992个AS事件,两组的AS事件类型都以外显子跳跃(SE)事件为主,差异分析发现了25个显著的DSGs。GO富集分析表明,DSGs主要富集在21个条目,其中以细胞过程、物质代谢、结合、催化活性的基因数量较多;KEGG信号通路分析显示,DSGs富集数较多的是信号传导、免疫系统、多糖生物合成与降解、能量代谢等通路。【结论】家蚕中肠组织存在大量AS事件,在微孢子虫感染过程中存在25个DSGs,其功能涉及新陈代谢和细胞免疫等。

家蚕微孢子虫Ubc9蛋白的基因克隆与功能研究

SUMO(small ubiquitin-like modifier)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,Ubc9(ubiquitin-conjugating enzyme)是SUMO修饰靶蛋白过程中唯一的E2结合酶,在SUMO修饰过程中发挥关键作用。本研究克隆了家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)NbUbc9基因的完整开放阅读框。序列分析表明,NbUbc9与所有来源于微孢子虫属(Nosema)的Ubc9聚类在同一大分支上,与同为Nosema属的西方蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)和东方蜜蜂微孢子虫(Nosema ceranae)Ubc9同源性最高,说明NbUbc9蛋白在进化上高度保守。qRT-PCR分析表明,家蚕内源性Ubc9的表达量在Nb感染后有所下降,而Nb自身NbUbc9的表达显著增加。对NbUbc9基因RNAi后,Nb基因组DNA的复制水平显著下降,说明NbUbc9在Nb的细胞增殖中起着关键作用。经Pull-down和质谱分析,初步鉴定出有46个家蚕蛋白和8个Nb蛋白可能与NbUbc9相互作用,涉及蛋白质折叠与转运、去泛素化、信号转导等。研究结果为进一步研究NbUbc9在家蚕微孢子增殖中的作用提供了参考,也为开发微粒子病防治药物提供了新的方向。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)向家蚕BmN细胞接种与增殖的观察

利用DIPA活体荧光染色的方法对家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis)的体外发芽、侵染、增殖的过程进行了观察。结果表明 :侵染过程从发芽开始持续到感染后 2 4h ,感染初期的芽体具有二核性 ,随后合二为一 ,感染后 2 4h进入裂殖体增殖阶段形成多核裂殖体 ,感染后 5 4h出现孢子母细胞、短极丝孢子及孢内发芽现象 ,感染后 6 0h出现二次感染体及趋于成熟的孢子 ,感染后 96h开始形成大量的成熟孢子、空孢壳及二次感染体的再分裂 ,此时在感染家蚕BmN细胞中 ,难于明确划分家蚕微孢子虫的各发育阶段。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)孢壁蛋白提取方法的优化研究

分别用SDS法、煮沸法、碱溶法和Brosson法，提取家蚕微孢子虫孢壁蛋白，并对孢壁蛋白及处理后的孢子形态进行比较研究。结果表明，不同方法处理后的孢子形态均保持完整，SDS处理后孢子为短杆状且明显变得粗壮．煮沸处理后孢子变小呈梭形，其他方法处理的孢子均有膨胀现象。SDS—PAGE检测显示，SDS法提取的孢壁蛋白出现3条明显的主带，煮沸法提取的孢壁蛋白出现5条明显的主带，0．1mol／L KOH提取的孢壁蛋白出现2条主带；而Brosson法提取的孢壁蛋白呈现出20～30条带，体现了家蚕微孢子虫孢壁蛋白组成的复杂性，并适合于孢壁蛋白质组学的研究。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21)体系的建立

家蚕微孢子虫(Nosemabombycis,简称N.b)经KOH处理后,接种于草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf21),建立家蚕微孢子感染增殖体系,同时,对孢子与宿主细胞在感染增殖过程中的形态变化进行了跟踪观察。KOH处理的孢子发芽率约为67%,Sf21细胞的初期感染率约为4.3%,接种24h内,细胞感染率变化不明显,但随后逐渐增加,到接种后的第7天达76.9%。接种后第12天起,细胞内充满不同发育阶段的孢子,并可见大量的胞外游动孢子。随后,大量细胞破裂,孢子逸出后,破裂的细胞内出现大量囊泡,且有合胞体(巨型多核融合细胞)出现。另外,将感染孢子的家蚕中肠组织和丝腺组织用胰蛋白酶处理后直接接种Sf21细胞,不经发芽处理,细胞也能感染。

家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）孢子人工发芽的研究

研究表明，目前常用的适合于向昆虫培养细胞接种的Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ孢子的几种人工发芽方法的发芽率存在较大差异．同一种方法在不同的发芽培养基中的发芽率也有所不同．并发现在Ｎ．ｂｏｍｂｙｃｉｓ孢子的人工发芽过程中Ｋ＋促进作用比Ｎａ＋明显，而且还证实Ｎ．

基于第三代PacBio测序技术的家蚕微孢子虫浙江株全基因组及其比较分析

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是危害家蚕养殖业的主要病原微生物,已在不同养蚕地区发现多种株型。本研究采用第三代基因组测序技术PacBio RSⅡ对分离自浙江地区的家蚕微孢子虫浙江株(N.bombycis Zhejiang)进行基因组测序,并对其基因组序列特征和基因功能注释进行分析。该微孢子虫基因组测序数据量为2.34 Gb,基因组大小为17.3 Mb,共拼接获得95个scaffolds,基因组覆盖深度达到138倍。比较基因组分析结果显示,N.bombycis Zhejiang与N.bombycis CQ1的基因组大小和GC含量相似,并且具有较好的基因组共线性关系。GO注释热图分析表明,不同微孢子虫基本功能分类基因丰度相似,但是浙江株在代谢过程等方面具有更高丰度。基于GLUT3氨基酸序列的系统进化分析显示,家蚕微孢子虫GLUT3蛋白主要分为2个亚家族,浙江株有3个GLUT3蛋白与CQ1株的亲缘关系最近,其余8个则与柞蚕微孢子虫形成进化支。利用实时荧光定量PCR对葡萄糖诱导后的浙江株GLUT3基因表达模式进行分析,结果表明,50 mmol/L葡萄糖诱导1 h后,A3834和A5849基因表达显著升高。各微孢子虫的GLUT3保守基序片段构成转运体的核心α螺旋结构,分子对接分析表明该片段氨基酸残基可能是葡萄糖结合和蛋白质稳定的关键位点。此外,家蚕微孢子虫2个GLUT3亚家族的蛋白序列长度、跨膜次数和平均疏水性均存在不同,推测2株家蚕微孢子虫在葡萄糖的摄取转运方面可能有所差异。研究结果为今后深入研究家蚕微孢子虫不同株型的进化机制和与宿主的相互作用提供了支撑。

家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1)的基因克隆及原核表达

极管作为微孢子虫高度特异的结构,在微孢子虫侵染宿主细胞的过程中扮演重要角色。利用家蚕微孢子虫和兔脑炎微孢子虫基因组数据,通过共线性分析获得一个编码家蚕微孢子虫假定极管蛋白的基因NBO_7g0016。序列特征分析表明该基因编码富含脯氨酸的409个氨基酸,预测蛋白质分子质量39.6 kD,蛋白质序列的N端具有信号肽,有40个潜在的O-糖基化位点和17个磷酸化位点。以家蚕微孢子虫基因组DNA为模板克隆NBO_7g0016基因,并构建插入该基因的重组质粒,转化E.coli BL21(DE3)进行原核表达,融合蛋白经亲和层析纯化后免疫昆明小鼠制备多克隆抗体。免疫印迹实验证明该基因编码的蛋白质在成熟孢子中有表达,间接免疫荧光实验将蛋白质定位于家蚕微孢子虫的极管,确证该蛋白质为家蚕微孢子虫极管蛋白1(NbPTP1,GenBank登录号:EOB15198.1)。初步推测家蚕微孢子虫极管蛋白1具有糖基化修饰特征。

家蚕微孢子虫感染BmN细胞的差异表达基因筛选及Akirin的原核表达

为探究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染宿主细胞的分子机制,以感染Nb的家蚕卵巢上皮细胞(BmN)为材料,通过GeneFishing技术进行基因差异表达分析,发现感染Nb的BmN细胞有10个基因被诱导或抑制表达,这些差异表达基因功能涉及蛋白质合成、细胞信号转导、线粒体呼吸链电子传递、细胞能量代谢、细胞免疫及一些未知功能。运用RT-PCR方法克隆在感染Nb的BmN细胞中差异表达的免疫相关基因Akirin,获得一个长588 bp的完整ORF,编码195个氨基酸,预测蛋白质分子质量21.98 kD,等电点为8.97,属于碱性蛋白,该蛋白质经SignalP在线预测未见信号肽。通过原核表达获得家蚕Akirin的外源融合表达蛋白,为进一步研究家蚕Akirin在家蚕先天免疫系统中的功能奠定了基础。

家蚕微孢子虫Nosemabombycis抗体蛋白非特异性结合的去除研究

Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ（Ｎ．ｂ）抗血清常受非特异性干扰而难于实用。本试验通过硫酸铵盐析、透析袋及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ—２５柱层析脱盐、ＤＥＡＥ纤维素柱层析、组织粉吸收等一系列纯化过程，并经ＰＡＣＥ电泳检查表明所获得的高纯度抗体蛋白成分具有很强的特异性。用以制成致敏炭素检液，对Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ发生阳性反应，对ＳＣＭ６、ＳＣＭ７均不发生阳性凝集反应。经万余张原种实用性试验，证明其灵敏度增强５０倍，误判率为０，可以准确无误地检出Ｎｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓ，具有广泛的应用前景。

35℃高温对家蚕微孢子虫在BmN细胞中发育、增殖的抑制

研究了 35℃高温处理对家蚕微孢子虫体外发育、增殖的影响时期和时间。结果表明 :35℃高温对家蚕微孢子虫体外发育、增殖具有明显的抑制作用 ,其最为敏感的时期是微孢子虫的裂殖体增殖阶段 (接种后 2 4～ 72h) ,进入孢子形成期 (接种 72h以后 )抑制作用则明显降低。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)表面蛋白提取法研究

对微孢子虫表面蛋白的提取法研究表明，在微孢子虫的纯化中采用蔗糖法、甘油法及Ｐｅｒｃｏｌ法，结果Ｐｅｒｃｏｌ法是纯化微孢子虫的理想方法。微孢子虫表面蛋白采用高盐法、碱法及ＳＤＳ法提取，其蛋白量的ＯＤ值分别为０．０９４，０．０２１和０．２６８，ＳＤＳ法提取量最多。

用rRNA序列分析家蚕病原性微孢子虫Endoreticulatus bombycis的进化

利用GENETOOL、TREECON软件包,对克隆的家蚕病原性微孢子虫Endoreticulatus bombycis的SSUrRNA(small subunit ribosomal RNA)序列和 GenBank中已登录的其他微孢子虫SSUrRNA序列进行了进化分析,构建了微孢子虫的进化树。该进化树显示:微孢子虫门分为4大类群,除第一、第二类群由双单倍期纲(Class Dihaplophasea cl.n.Sprague,1992)构成之外,其它2个类群均由双单倍期纲和单倍期纲(Class Haplophase cl.n.Sprague,1992.)构成;双单倍期纲分布在4个类群中,显示了微孢子虫发育呈现多系性;在真核生物中,缺乏线粒体营独立生活的双滴虫(Diplomonadida)首先从原核生物中分离出来,接着是毛滴虫(Trichomonadida),然后是微孢子虫和真菌(Fungi),显示出了微孢子虫与真菌有较近的亲缘关系;微孢子虫的4大类群中,双单倍期纲中离异双倍期目(Dissociodihaplophasida)起源最早;单倍期纲中格留目(Glugeida)进化程度最高。家蚕病原性微孢子虫Endoreticulatus bombycis位于第三类群中,处于相对较高的进化位置。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染家蚕丝腺组织后的免疫胶体金标记观察

为了探讨家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究方法和手段,利用免疫胶体金标记电镜技术,对被感染的家蚕丝腺组织中家蚕微孢子虫的蛋白质分泌状况进行了观察。结果显示,有大量的胶体金颗粒存在于家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内,说明了家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内存在大量的孢子蛋白质,证实了家蚕微孢子虫在寄生过程中将许多孢子蛋白质分泌到宿主体内。初步探讨了家蚕微孢子虫与宿主家蚕之间的互作关系。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)对蚯蚓的感染性试验

为了进一步探索家蚕微孢子虫的感染宿主范围以及感染致病机制,试验采用属于原生动物环节动物门的动物—蚯蚓作为被感染对象,使用不同浓度的家蚕微孢子虫对其进行感染试验,观察并统计蚯蚓的感染和死亡情况,并通过显微镜观察蚯蚓体内微观变化及微粒子孢子的变化情况。试验结果表明,家蚕微孢子虫对蚯蚓的感染能力较强,其半致死浓度LC50为8.6×107个/mL。

家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性分析

为研究家蚕微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶Nbslp2的保守性及转录活性,采用生物信息学相关软件对微孢子虫类枯草杆菌蛋白酶slp2基因共线性、多重序列及系统进化进行比对分析,并通过Western blot分析Nbslp2在家蚕微孢子虫、柞蚕微孢子虫及纳卡变形微孢子虫中的表达特征,以验证其保守性;进一步以感染家蚕微孢子虫不同天数的家蚕中肠组织为材料,利用RT-PCR检测Nbslp2的转录活性。共线性、多重序列比对及系统进化分析发现,Nbslp2在微孢子虫基因组中的位置较保守,Western blot结果显示Nbslp2抗体在柞蚕微孢子虫总蛋白中杂交出2条带,而在纳卡变形微孢子虫没有杂交条带,说明Nbslp2相对保守,并且可将Nbslp2作为区分柞蚕微孢子虫和纳卡变形微孢子虫的靶标;RT-PCR结果显示Nbslp2在感染家蚕微孢子虫后72 h检测到转录活性,进一步推测Nbslp2可能在家蚕微孢子虫感染家蚕早期发挥作用,为分子水平深入研究Nbslp2的功能奠定理论基础。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)与其它微孢子虫及真菌的进化关系

综述了应用分子生物学和生物信息学对家蚕微孢子虫系统发育的研究进展,以及多菌灵等苯并咪唑类杀真菌剂对微孢子虫和真菌的抑制作用,认为研究家蚕微孢子虫和真菌的进化关系对家蚕微粒子病的控制技术研究具有重要参考价值。

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)对蝗虫的防治效果

用不同浓度梯度的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)对中华稻蝗(Oxya chinensis)和云南板齿蝗(Sinstauchira yunnan)进行了转宿主添食感染试验。结果表明,家蚕微孢子虫在高浓度(107个/mL)添食的情况下对蝗虫有较强的感染力和致死率,家蚕微孢子虫对蝗虫的半致死浓度(LC50)为6.9×106个/mL。

家蚕微孢子虫N.bombycis分离纯化方法的优化

对家蚕微孢子虫的分离纯化条件进行了探索。微孢子虫的分离 ,采用差速离心法或自然沉降法的效果均可。蔗糖平衡密度离心法的较优条件为 5 0 %～ 6 0 %的蔗糖连续梯度、2 30 0 0rpm离心 30min ,而Percoll法的最佳条件为 2 5 %、5 0 %、75 %和 10 0 %的Percoll不连续梯度、175 0 0rpm离心 2 0min ;两种纯化方法相比较 。