人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 。

人白细胞介素-4基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4（human interleukin-4，hIL-4）基因。为高效表达hIL-4，促进其临床应用，将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，构建重组载体pBacPAK-hIL-4，并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞，获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹（1×10^5PFU／头），表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测。用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高，分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg／mL体液；SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD；表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDVVP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.

利用优化改造的家蚕杆状病毒表达系统提高NS1表达产量

为优化家蚕杆状病毒表达系统,提高外源基因的表达产量。文中通过同源重组技术,用串联的氯霉素基因(Cm)表达盒和绿色荧光蛋白基因(egfp)表达盒将其替换,从而获得Chitinase和Cystein Protease两个基因缺失的家蚕杆状病毒载体。通过转座,将多角体启动子控制的家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)ns1基因表达盒,定点插入到改造后的该分子载体中。将重组载体转染Bm N细胞,获得能表达家蚕二分浓核病毒(Bm BDV)NS1的缺失型重组病毒;另外,将多角体启动子控制的ns1基因转座到野生型Bm-bacmid中,获得能表达Bm BDV NS1的野生型重组病毒。将这两种病毒分别皮下注射家蚕,对感染后的家蚕血液中NS1表达水平进行比较,发现缺失Chitinase和Cystein Protease重组病毒感染的家蚕血液中,NS1的表达量是对照组的3倍,从而建立了一种高效表达可溶性NS1蛋白的方法,为靶蛋白的结构与功能研究奠定基础。

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在家蚕中的表达与鉴定

目的 以家蚕为生物反应器表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），并检测其生物学活性。方法 将人TRAIL（93～281aa）基因重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacAK8-TRAIL。与经线性化修饰的家蚕棱型多角体病毒（BmBacPAK）DNA共转染家蚕培养细胞株BmN，获得了插入TRAIL基因的重组病毒，重组病毒感染家蚕细胞和家蚕幼虫，使其表达人TRAIL。结果 Southern杂交表明重组病毒基因组中含有人TRAIL基因片段，RNA斑点杂交表明人TRAIL基因得到了转录，重组病毒感染家蚕细胞株（BmN）、家蚕幼虫，在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫的体液样品中通过Westblot分析都能检测得到表达产物的特异性条带；采用L929细胞检测TRAIL的生物学活性。结论 提示人TRAIL基因分别在家蚕培养细胞和蚕幼虫中得到高效表达，此基因杆状病毒表达系统的建立为进一步研究TRAIL奠定了基础。

复制缺陷型BmNPV载体的构建及初步应用

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)表达载体系统可以利用线性化技术或通过Bac-to-Bac系统构建重组病毒。为了解决采用这些方法构建重组病毒需要多步克隆和筛选,无法满足实验室水平快速和高通量表达目的蛋白质需求的问题,建立了一种快速便捷的重组病毒构建方法。首先以BmNPV基因组为基础构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid,进而利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列,构建了一种复制缺陷型BmNPV穿梭载体RD-BmBacmid。利用RD-BmBac-mid单独转染或者与pBacPAK8-AcGFP共转染BmN细胞,证实了该载体的复制缺陷性,即需经同源重组修复orf1629基因后方可产生重组病毒。利用复制缺陷型BmNPV载体正筛选可以快速构建重组病毒表达目的蛋白质。

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒全长可读框的表达及其产物免疫原性分析

将亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)全长约为6.9kb的可读框(ORF)克隆到家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组家蚕杆状病毒转移质粒pVL-ORF.pVL-ORF与线性化的亲本病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞,经空斑筛选后成功获得携带有FMDV全长ORF的重组病毒Bm-ORF.免疫荧光技术证明,重组病毒能够正确表达插入的外源基因.将获得的重组病毒Bm-ORF感染家蚕5龄起幼虫,双抗体夹心ELISA法和电子显微镜观察证明,目的基因在蚕体中获得较高水平表达并组装成空衣壳.用蚕表达产物作抗原制备疫苗免疫牛,免疫动物均产生了特异性抗体.免疫后21d进行病毒攻击保护实验,获得了2/4的完全保护.

IL-28A在家蚕BmN细胞及蛹中的表达

IL-28A是2003年Sheppard等报道的白细胞介素，它属于干扰素λ（IFN-λ）类。IL-28主要功能有抗病毒、抗细胞增殖及免疫调节等作用。Bac—to-Bae家蚕杆状病毒表达载体系统不仅表达水平高而且对人安全，蚕蛹可药、可食，利用家蚕杆状病毒表达系统表达外源蛋白为基因工程口服药物的研发提供了可能。