家蚕核型多角体病毒lef-8基因克隆及系统进化分析

【目的】了解云南省德宏州陇川县蚕区家蚕核型多角体病毒(BmNPV)株系的遗传地位和多样性,为厘清云南蚕区BmNPV的起源及科学防控家蚕血液型脓病提供参考依据。【方法】对分离自云南省德宏州陇川县蚕区的BmNPV进行lef-8基因克隆,通过ExPASy、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、NetOGlyc 4.0、NetPhos 2.0及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并基于lef-8基因核苷酸序列相似性,采用MEGA7.0中的邻接法(NJ)构建系统发育进化树。【结果】云南省德宏州陇川县蚕区BmNPV-YNLC株的lef-8基因序列全长2631 bp,共编码876个氨基酸残基;其编码蛋白(LEF-8)无信号肽序列,也不存在跨膜结构域,蛋白分子量为101.63 kD,理论等电点(pI)为8.8;在第750~800位氨基酸残基区域具有较高的疏水性,部分氨基酸位点表现为亲水性,且具有较高抗原指数和表面可及性;存在6个潜在的N-糖基化位点,62个磷酸化位点(25个丝氨酸磷酸化位点,23个苏氨酸酸化位点,14个酪氨酸磷酸化位点),但不存在O-糖基化位点。BmNPV-YNLC株与BmNPV-T3株的lef-8基因核苷酸序列相似性为99.7%,BmNPV-YNLC株lef-8基因在第96~98位核苷酸序列上存在3个碱基(CAA)缺失;此外,还存在2个非同义突变(^(646)T→A和^(1895)C→G)和7个同义突变。基于lef-8基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近,而与我国流行的BmNPV遗传关系较远。【结论】lef-8基因在不同地区来源的BmNPV株系中高度保守,BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近,但其LEF-8蛋白N端存在氨基酸缺失突变,说明BmNPVYNLC株为云南蚕区的新流行株系。

不同来源家蚕核型多角体病毒的致病力及其vp 39基因的遗传进化分析

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是养蚕生产中的主要病原微生物之一。收集广西壮族自治区9个蚕区的BmNPV分离株,纯化后分别给家蚕品种两广二号的2龄起蚕添食感染,调查9个BmNPV分离株对2龄起蚕的LC_(50)在1.55×10^(6)~4.19×10^(6)mL^(-1)之间,各分离株间的致病力差异不显著。选择BmNPV的感染相关基因vp 39设计合成序列引物进行PCR,对各分离株的扩增产物测序并进行遗传进化分析,结果表明不同来源分离株的vp 39基因在进化树上归于一个分支上的几个层次分支,序列间的相似度大部分>98%,相互间的遗传距离也较小,部分<1.0,提示vp 39基因相对比较保守。研究结果为解析家蚕抗病毒机制提供了一些新的参考信息。

耐家蚕核型多角体病毒病蚕品种“华康2号”的育成

以对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)侵染具有较强耐受力,且综合经济性状优良为家蚕新品种选育目标,选择我国蚕区推广量较大的家蚕品种秋丰和白玉作为受体,用BmNPV耐受性基因载体品种N作供体,采用杂交技术将耐病基因导入受体品种,再用受体品种秋丰和白玉分别作回交亲本连续进行4次回交,纯合固定耐病基因,通过系统选育提高、稳定回交后代的综合经济性状,育成对家蚕核型多角体病毒病具有较强耐受性的新品种秋丰N×白玉N(定名为华康2号)。BmNPV对新品种的LC50为2.033×109个/mL,是原系统秋丰×白玉LC50值的12 115倍,新品种的耐病力显著增强。新品种的发育经过及丝质、茧质等主要经济性状与原系统相仿,万头收茧量、万头产丝量分别提高5.5%和9.6%,解舒丝长增加60 m,洁净提高1.1分,达到实用化的水平。

dsRNA对家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制效果

以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制必需的极早期基因ie-1和细胞释放型病毒CRV入侵关键基因gp64为靶序列,分别人工设计并体外转录出dsRNA I1(438 bp)和dsRNA G1(337 bp),用家蚕培养细胞BmN研究目标dsRNA对BmNPV复制、增殖的抑制效果。结果表明:dsRNA I1能有效地抑制BmNPV在BmN细胞中的增殖,最大抑制效果使培养液中的病毒滴度(TC ID50)比对照降低了104.30倍;dsRNA G1能显著地抑制新形成的病毒粒子的细胞侵染能力,最高可使培养液中的病毒滴度降低103.17倍。

gp64基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖的抑制

【目的】研究gp64基因相对应的多个dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果。【方法】体外合成dsRNA,通过病毒滴度试验、实时定量RT-PCR法研究gp64基因的不同区域、不同长度与RNAi干扰效果的关系。【结果】供试的6个dsRNA的最大抑制效果相当(滴度TCID50的最大抑制差值为4.00左右);经RNAi的不同时间点的gp64mRNA表达水平均明显下调(P<0.01),其中48h的gp64mRNA的表达量约为对照的1/300。【结论】6个dsRNA均能有效地抑制病毒的基因表达和增殖;gp64ORF第1390～1499位点(G3-3)是RNAi的较佳靶位点。

基于DNA载体的RNAi抑制家蚕核型多角体病毒复制

基于DNA载体的RNA i技术可以较长时间高效地抑制基因的活性。利用家蚕核型多角体病毒ie-1基因启动子,构建了在细胞内能转录形成与ie-1基因+19^+446区域互补同源的发夹状dsRNA的RNA i DNA载体。研究结果表明,该载体DNA在体外、体内均能较好地抑制家蚕核型多角体病毒在细胞中的复制。

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。

喂食家蚕核型多角体病毒诱导家蚕抗菌肽基因表达

【目的】阐明家蚕抗菌肽基因对病毒感染的中肠免疫应答模式,为揭示昆虫抗病毒机制提供参考。【方法】采用喂食家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)给家蚕的方式进行诱导,以实时荧光定量PCR检测诱导后家蚕抗菌肽基因的表达情况,并比较Bm NPV诱导下8类已知家蚕抗菌肽主基因(cecropin D、moricin、gloverin2、defension B、attacin1、enbocin2、lysozyme和lebocin3)在肠道组织中表达水平的差异。【结果】在喂食Bm NPV处理3 h时,家蚕中肠组织中呈上调表达的抗菌肽基因仅有moricin基因;处理6 h时,cecropin D、gloverin2、moricin基因转录水平均呈明显的上调趋势,尤其以gloverin2基因的诱导活性相对最高,是对照组gloverin2基因的9.22倍;而在处理12和24 h时检测,发现8类已知家蚕抗菌肽基因表达量均小于1.0,呈下调趋势。【结论】Bm NPV侵染家蚕后gloverin2基因表达量明显上调,可能是gloverin2基因作为主要功能基因在病毒侵染早期过程中发挥了重要作用。

家蚕核型多角体病毒云南株(Bm NPV-YN1)对不同龄期家蚕的侵染致病效应

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是主要的家蚕病毒病病原之一,由其侵染家蚕引发的家蚕核型多角体病(血液型脓病)严重影响云南的蚕业生产。测定分离自云南蚕区的BmNPV株系(BmNPV-YN1)对家蚕1~5龄幼虫的毒力,并运用“时间-剂量-死亡率”模型模拟分析该病毒株对家蚕各龄幼虫的感染致病力。结果表明,以浓度为1×10^8~1×10^5mL^-1的BmNPV-YN1多角体悬液添食处理后,家蚕各龄幼虫的感病死亡率随添食病毒多角体悬液浓度的降低而下降,添食1×10^7mL^-1BmNPV多角体悬液后第7天,家蚕1~5龄幼虫的累积死亡率分别为100%、76.67%、72.22%、56.67%和26.67%。BmNPV-YN1对家蚕幼虫的致病力与龄期相关,其敏感程度从高到低排序依次为1龄、2龄、3龄、4龄、5龄。用BmNPV-YN1多角体悬液添食家蚕1~5龄幼虫后第7天,致死中浓度(LC50)估计值分别为4.78×10^4mL^-1、5.38×10^5mL^-1、2.22×10^6mL^-1、7.95×10^6mL^-1和3.92×10^8mL^-1。在1×10^8~1×10^5mL^-1浓度范围内,BmNPV-YN1对家蚕幼虫的致死中时(LT50)与添食浓度相关,对1~4龄幼虫的LT50值随着BmNPV-YN1添食浓度的降低而增加。研究结果表明,BmNPV-YN1对家蚕具有较强的侵染致病效应,提示云南蚕区对血液型脓病的防控应以小蚕期为主,同时密切关注各龄期的眠初期。

家蚕核型多角体病毒egt基因的结构和功能分析

以苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)的egt基因作探针 ,从家蚕核型多角体病毒镇江株 (BmNPVZJ- 8)基因组中克隆了egt基因及其旁侧序列 ,作了该片段的酶切图谱 ;测定了BmNPVZJ - 8egt基因序列。与AcMNPV的egt基因相比同源性为 95 % ;基因大小都为 15 18bp。利用egt基因旁侧序列构建了转移载体pUDegt,以绿色荧光蛋白基因 (EGFP)作报告基因取代egt基因 ,构建了由EGFP取代egt基因的重组病毒BmDegt。将含egt基因的BmNPV和不含egt基因的重组病毒BmDegt分别注射感染四龄家蚕幼虫 ,发现BmDegt感染的家蚕个体生长速度缓慢 ,家蚕个体小 。

家蚕核型多角体病毒LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立针对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的环介导等温扩增(LAMP)可视化检测技术,为生产现场进行家蚕血液型脓病早期诊断提供技术支持。【方法】以Bm NPV多角体蛋白基因polh为扩增靶标,分别设计5组内/外引物和5条环引物,根据扩增效率筛选最佳引物组合;优化LAMP反应条件,并进行LAMP检测的特异性、敏感性及临床样本检测试验;使用羟基萘酚蓝(HNB)染色对结果进行比色观察,对简化样品处理的条件进行摸索。【结果】使用环引物后LAMP对Bm NPV基因组DNA的最低检测浓度为7 fg/μL,检测灵敏度得到有效提高,且反应时间缩短。建立的LAMP检测方法对靶标DNA扩增具有特异性,对样本的检出率高于常规PCR,其最低检测限是常规PCR的100倍。在反应前加入HNB,结果易判断且能减少交叉污染。感染家蚕血淋巴进行100℃煮沸处理后即可直接用于LAMP反应,既简化了操作步骤,又降低了检测成本。【结论】针对Bm NPV建立的LAMP可视化检测技术具有灵敏、快捷、可靠的特点,适合用于生产现场的Bm NPV感染早期诊断。

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。

柞蚕核型多角体病毒和家蚕核型多角体病毒的同义密码子使用模式分析

基因组中的基因和基因密码子组成不同使柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)间不能交叉感染。通过计算有效密码子数(ENc)、相对同义密码子使用度(RSCU)、GC含量、GC3s含量、密码子适应指数(CAI),比较分析ApNPV和BmNPV同义密码子使用模式差异。ApNPV和BmNPV的密码子偏好性均较弱,但二者的ENc值和GC含量差异显著;除碱基组成外,还存在其它因素影响密码子使用模式,但各影响因素的贡献率均较低,在基于密码子使用频率的对应分析中BmNPV的第1、第2向量轴贡献率均低于ApNPV;ApNPV的基因表达水平与GC含量、GC3s含量以及ENc值极显著相关(r分别为0.418、0.735、-0.628,P=0.000),而BmNPV的基因表达水平只与GC3s含量呈弱相关(r=0.214,P=0.010)。分析结果显示,ApNPV和BmNPV的密码子偏好性虽均较弱,但同义密码使用模式及其影响因素存在差异。

家蚕核型多角体病毒bro基因的单核苷多态性研究

bro(baculovirus repeated ORFs)基因家族是一类存在于核型多角体病毒中比较复杂的基因家族。家蚕核型多角体病毒T3BmNPV基因组中有5个bro基因,分别为bro-a,bro-b,bro-c,bro-d,bro-e。对我国的BmNPVCQ1株进行了全基因组测序,与T3序列比较发现两个差异较大区域,分别命名为V1,V2区。在此基础上,对来自国内不同地区的另外5株BmNPV分离株对应的差异区域进行了研究,克隆了包含15个bro基因的10个DNA片段,其中包含了5个bro-c基因序列,5个bro-d基因序列,4个bro-e基因序列,加上公共数据库中已有的2个bro-c、2个bro-d、1个bro-e,合并后对bro-c、bro-d、bro-e分别进行核苷酸多态性分析,结果表明bro-c、d、e类基因都存在高密度的SNP位点。出现在这3类基因中的单核苷酸位点或核苷酸片段的插入/缺失数目分别为9、1、1。(θ,π)分析表明bro-c类基因的多态性在3类bro基因中最高。Tajima’D检验结果说明这些核苷酸变化符合中性突变假说。Pi(a)/Pi(s)分析暗示bro-c,bro-d和bro-e的N端的一些区段受到正向选择。

家蚕核型多角体病毒gp64基因的克隆和全序列测定

：Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因在杆状病毒分子生物学和杆状病毒表达系统研究中具有重要的作用，以ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６４ 基因为探针，杂交显示Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因定位于其基因组Ｂａｍ ＨＩ酶切的４ ．２ｋｂ 和７－４ｋｂ 片段上，克隆阳性片段，重组质粒分别命名为ｐＺＤＢＭ４２ 和ｐＺＤＢＭ７４ 。对重组质粒进一步杂交，将片断更精确定位于０－４５ｋｂ 片段、０－７５ｋｂ 片断上和１－１５ｋｂ 片断上，将三个片断ＤＮＡ 进行序列分析，结果表明：Ｂｍ ＮＰＶ 的ｇｐ６４ 基因的开放阅读框（ＯＲＦ） 有１５３０ 核苷酸，编码５０９ 个氨基酸。序列同源性比较显示，Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因和ＡｃＭＮＰＶｇｐ６４ 基因的核苷酸序列同源性达８４－３ ％ ，氨基酸序列同源性达９４－７ ％ 。Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因Ｃ 端的信号肽序列和Ｎ 端的锚定序列对于Ｂｍ ＮＰＶ 表达系统的改进具有重要的意义。

一种适用于家蚕核型多角体病毒的PCR检测方法

建立家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的快速检测技术,有利于病害的早期诊断。选择家蚕核型多角体病毒极早期基因pe38为靶基因设计特异性检测引物,对不同浓度BmNPV基因组DNA模板及含有pe38的重组质粒pMD18-pe38标准品进行PCR检测,结果扩增出BmNPV 370 bp的特异性片段,病毒多角体的最低检测浓度为4.86×103mL-1,标准质粒的最低检测量为0.7 pg。将BmNPV感染家蚕幼虫后不同时间取其血淋巴用于PCR检测方法的验证,结果表明,接种病毒多角体浓度为4.86×108mL-1时,感染36 h后取样的幼虫血淋巴中能扩增出370 bp的病毒特异条带,可检出病毒的时间随添毒浓度的递减而延迟。该检测方法具有较好的特异性和灵敏度。

家蚕核型多角体病毒碱性磷酸酶基因(alk-exo)与杆状病毒的分子进化分析

基于为杆状病毒分类提供新的依据,克隆了家蚕核型多角体病毒苏州株(BmNPV-SU)碱性核酸酶基因(alk-exo)及其侧翼区,并进行序列和进化分析。BLAST检索显示,BmNPV-SUalk-exo上游的部分ORF109序列仅在AcNPV、RoNPV中检索到同源序列;下游区域在AcNPV、RoNPV、SlNPV的基因组中检索到同源序列。序列分析表明,BmNPV-SU的alk-exo基因编码420个氨基酸残基,下游区域存在2个正向的重复。比对结果分析显示,在22种杆状病毒中,alk-exo基因间核苷酸序列和氨基酸序列的同源性不高,变异较大。同时,利用MEGA软件包中的UMEGA算法建立了基于alk-exo基因的分子进化系统树,表明通过杆状病毒的进化可以反映宿主昆虫的进化,杆状病毒与其宿主昆虫之间存在共进化关系。

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)T3株对家蚕的亚致死作用测试

病毒对宿主昆虫的亚致死作用是指感染病毒后未死亡的昆虫,其生长发育、生殖等生命活动能力发生了明显变化。为了探明生产上发生家蚕血液型脓病时是否存在病原物家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)对家蚕的亚致死作用,以家蚕品种菁松×皓月的蚁蚕为材料,测试以低于致死中浓度(LC_(50))的Bm NPV-T3多角体悬液添食处理对存活家蚕的亚致死作用。测定Bm NPV-T3对蚁蚕的LC_(50)值为1.41×10~5m L^(-1)。以浓度为10~5~10~3m L^(-1)的Bm NPV-T3多角体悬液给蚁蚕添食后,存活幼虫的体质量显著降低;10~5m L^(-1)多角体悬液添毒试验组存活幼虫的发育历期明显延长,而对蛹期发育历期的影响不显著;10~5m L^(-1)和10~4m L^(-1)多角体悬液添毒试验组的存活幼虫发育至成虫,其产卵量显著低于对照组;10~5m L^(-1)多角体悬液添毒试验组存活幼虫的蛹体质量、全茧量、茧层量、茧层率均受到一定影响,其中对雌蚕的茧层量影响显著。依据上述试验结果初步认为,以低于致死中浓度的Bm NPV悬液给蚁蚕添毒后,对蚕体的生长发育和产茧、产卵性状都具有一定的影响,Bm NPV对家蚕存在亚致死作用。

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm 。

家蚕核型多角体病毒株系的分子鉴定初探

来自不同地域或蚕区的家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)对家蚕的致病力存在较大差异,出现明显的株系分化现象。对Bm NPV流行株系鉴定是病害监测与防控的重要基础。以最早完成基因组测序的Bm NPV-T3株的多角体蛋白基因(polh)序列与其他6个Bm NPV株系进行同源基因序列及氨基酸序列的BLAST比对,结果表明不同株系的Polh氨基酸序列高度同源,相似度达到99.94%;再以Bm NPV-T3株的143个开放阅读框序列为参照,对不同Bm NPV株系的基因组序列进行双序列比对,发现不同株系重复阅读框基因(bro)家族成员的组成、序列及拷贝数存在差异,且分布位置呈现多样性。初步认为,高度保守的polh基因可用于Bm NPV病毒的鉴定,而相对保守的bro家族基因可作为Bm NPV病毒株系分子鉴定的依据。