家蚕核型多角体病毒lef-8基因克隆及系统进化分析

【目的】了解云南省德宏州陇川县蚕区家蚕核型多角体病毒(BmNPV)株系的遗传地位和多样性,为厘清云南蚕区BmNPV的起源及科学防控家蚕血液型脓病提供参考依据。【方法】对分离自云南省德宏州陇川县蚕区的BmNPV进行lef-8基因克隆,通过ExPASy、SignalP 5.0、TMHMM 2.0、NetOGlyc 4.0、NetPhos 2.0及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并基于lef-8基因核苷酸序列相似性,采用MEGA7.0中的邻接法(NJ)构建系统发育进化树。【结果】云南省德宏州陇川县蚕区BmNPV-YNLC株的lef-8基因序列全长2631 bp,共编码876个氨基酸残基;其编码蛋白(LEF-8)无信号肽序列,也不存在跨膜结构域,蛋白分子量为101.63 kD,理论等电点(pI)为8.8;在第750~800位氨基酸残基区域具有较高的疏水性,部分氨基酸位点表现为亲水性,且具有较高抗原指数和表面可及性;存在6个潜在的N-糖基化位点,62个磷酸化位点(25个丝氨酸磷酸化位点,23个苏氨酸酸化位点,14个酪氨酸磷酸化位点),但不存在O-糖基化位点。BmNPV-YNLC株与BmNPV-T3株的lef-8基因核苷酸序列相似性为99.7%,BmNPV-YNLC株lef-8基因在第96~98位核苷酸序列上存在3个碱基(CAA)缺失;此外,还存在2个非同义突变(^(646)T→A和^(1895)C→G)和7个同义突变。基于lef-8基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树显示,BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近,而与我国流行的BmNPV遗传关系较远。【结论】lef-8基因在不同地区来源的BmNPV株系中高度保守,BmNPV-YNLC株与日本和韩国地区的BmNPV亲缘关系较近,但其LEF-8蛋白N端存在氨基酸缺失突变,说明BmNPVYNLC株为云南蚕区的新流行株系。

家蚕Gloverin 2克隆、高效表达及其抗核型多角体病毒感染作用研究

为获得家蚕抗菌肽葛佬素2(BmGloverin 2),并研究其在家蚕抗核型多角体病毒(BmNPV)感染过程中的作用,以经BmNPV诱导的3龄3日家蚕中肠cDNA为模板,根据GenBank上BmGloverin 2基因序列设计特异性引物,克隆出去除信号肽部分(1—18 aa)的BmGloverin 2基因,与表达载体pET-28a(+)连接构建pET28a(+)-BmGloverin 2,对含有pET28a(+)-BmGloverin 2重组质粒的菌株诱导表达,然后对抗菌肽重组蛋白进行Ni-IDA亲和层析、透析及浓缩过滤以获得高浓度目的蛋白;并采用抑菌试验检测BmGloverin 2重组蛋白生物活性;最后,将具有生物活性的BmGloverin 2重组蛋白和BmNPV混合处理4 h后喂食家蚕,并以直接喂食BmNPV和无菌水处理为对照组,以检测BmGloverin 2对BmNPV感染家蚕的影响。结果显示,成功克隆BmGloverin 2基因,并构建重组pET28a(+)-BmGloverin 2;在37℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导表达可获得大量BmGloverin 2重组蛋白,经SDS-PAGE检测其分子质量为19.1 ku,与预期大小相符,经过纯化浓缩最终获得BmGloverin 2重组蛋白;抑菌试验证明,重组BmGloverin 2蛋白具有生物活性;与BmNPV对照组相比,饲喂重组BmGloverin 2蛋白与BmNPV混合液处理组幼虫存活率提高。可见,BmGloverin 2在家蚕抵抗BmNPV侵染中发挥作用。

家蚕核型多角体病毒ODV囊膜蛋白基因的融合表达及引导外源蛋白进入多角体的研究

为了探索家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的包涵体衍生病毒(ODV)囊膜蛋白在病毒粒子包涵入多角体过程中的作用,选择2个ODV囊膜蛋白ODV-E25和ODV-E56作为研究对象,利用能够表达多角体蛋白的BmNPV Polh+Bac-to-Bac表达系统构建了融合表达E25-EGFP和E56-EGFP的重组病毒,在家蚕卵巢培养细胞系(BmN)中进行表达和定位分析。结果表明2种融合蛋白均在BmN细胞中成功表达,并于荧光显微镜下观察到绿色荧光主要分布在细胞核中。从感染的BmN细胞中收集纯化多角体,观察到多角体也能激发出绿色荧光,用Western blot方法进一步证实多角体中含有融合蛋白。这一现象表明当囊膜蛋白基因与外源基因融合表达时,外源融合蛋白能够进入多角体内部,推测这2种ODV囊膜蛋白不仅在病毒粒子包涵入多角体的过程中起信号引导作用,并能引导外源目的蛋白进入多角体。

不同来源家蚕核型多角体病毒的致病力及其vp 39基因的遗传进化分析

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是养蚕生产中的主要病原微生物之一。收集广西壮族自治区9个蚕区的BmNPV分离株,纯化后分别给家蚕品种两广二号的2龄起蚕添食感染,调查9个BmNPV分离株对2龄起蚕的LC_(50)在1.55×10^(6)~4.19×10^(6)mL^(-1)之间,各分离株间的致病力差异不显著。选择BmNPV的感染相关基因vp 39设计合成序列引物进行PCR,对各分离株的扩增产物测序并进行遗传进化分析,结果表明不同来源分离株的vp 39基因在进化树上归于一个分支上的几个层次分支,序列间的相似度大部分>98%,相互间的遗传距离也较小,部分<1.0,提示vp 39基因相对比较保守。研究结果为解析家蚕抗病毒机制提供了一些新的参考信息。

家蚕核型多角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因核苷酸序列分析

从家蚕核型多角体病毒中国镇江株 (BmNPV ZJ)基因组DNA中克隆出酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因 (ptp) ,该基因的编码部分由 5 0 7个核苷酸组成 ,其中A为 16 3、C为 99、G为 113、T为 132 ,G +C含量约为 4 2 %。根据其核苷酸序列推演的蛋白质由 16 8个氨基酸残基组成 ,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酯酶催化活性区的 11个氨基酸“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)ptp和BmNPV T3株 (日本 )的ptp核苷酸序列的同源性分别为 96 8%和 98 2 %。BmNPV ZJ酪氨酸蛋白磷酸酯酶 (BmNPV ZJPTPase)的氨基酸全序列与AcMNPV、BmNPV T3、芹菜夜蛾核型多角体病毒 (AfMNPV)PTPase和黄杉毒蛾核型多角体病毒 (OpMNPV)PTPase 1的氨基酸全序列的同源性分别为 97%、97 6 %、96 %和 6 0 % ,而与OpMNPVPTPase 2的同源性仅为 2 0 %。在NCBI数据库中查找BmNPV ZJPTPase的同源性序列 ,查找到的 5 99381个序列中发现至少有 14种mRNA加帽酶其N端部分存在PTPase催化活性区的“HC”基序 ,但其氨基酸全序列的同源性只有 31%～ 32 %。该基因序列已被GenBank数据库收录 ,登录号为AF316

家蚕核型多角体病毒egt基因的原核表达及侵染BmE细胞中的EGT蛋白检测

杆状病毒的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(ecdysteroid UDP glucosyltransferase,EGT)能使宿主昆虫体内的蜕皮激素失去活性而延迟蜕皮和化蛹,以利于病毒大量繁殖。从家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组DNA中扩增获得egt基因全长序列片段,利用原核表达载体pET28a在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测发现EGT蛋白以包涵体形式表达,并且在16℃条件下以0.4 mmol/L IPTG诱导20 h目的蛋白质的表达量最高。采用镍柱亲和层析和切胶回收的方法获得纯化的EGT蛋白,并制备兔源多克隆抗体,其效价>5.12×105。Western blotting检测发现BmNPV侵染BmE细胞后48 h开始有EGT蛋白合成,并一直持续到144 h细胞基本死亡时还存在大量的EGT蛋白。这些结果为进一步研究BmNPV与宿主的相互作用机制提供了一定的线索,也暗示可以利用EGT蛋白调控家蚕蜕皮激素含量,使开发"永久蛹"成为可能。

家蚕抗核型多角体病毒基因与蛋白的研究进展

追踪研究蚕体内的抗家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)基因与蛋白,了解家蚕抗BmNPV的机制,对减轻甚至解除血液型脓病、促进桑蚕产业发展具有重要意义。文章就家蚕抗BmNPV基因和蛋白的研究进展进行综述,提出今后对家蚕抗BmNPV的研究策略应是运用多种技术同时从DNA、RNA、蛋白质水平上进行研究,鉴定家蚕抗BmNPV基因或蛋白及其与抗BmNPV的相关性;再采用RNA干涉、转基因技术对家蚕进行基因操作,改变其对BmNPV的抵抗能力,确认这些基因、蛋白的抗病毒功能。另外,使用免疫组化、免疫共沉淀,ELISA等技术探索基因—蛋白、蛋白—蛋白间的相互作用,找到基因或蛋白的上、下游作用因子,解释清楚家蚕抗BmNPV的详细机制,为最终解除家蚕脓病危害、促进蚕业发展提供参考资料。

日本三株斜纹夜蛾核型多角体病毒的增殖特性及其多角体蛋白基因的序列分析

利用斜纹夜蛾Spodopteralitura培养细胞 ,对近年来在日本本州、九州和四国等地发现并筛选出的对斜纹夜蛾幼虫具有强烈杀虫活性的 3株斜纹夜蛾核型多角体病毒 (SpltMNPV) (K 3、G1 2和G10 3)进行了生物学活性和分子生物学的初步研究 ,克隆了多角体蛋白基因 ,并进行了序列分析和比较。结果表明 :(1)SpltMNPV日本分离株K 3、G1 2和G10 3分别具有不同的特征性酶切图谱 ,分别属于 3种基因型 (A型、B型和C型 ) ;(2 ) 3个分离株的芽生型病毒 (buddedvirus)产生能力和多角体产生能力有差异 ,免疫印迹分析表明 ,多角体蛋白的分子量也不同 ;(3)日本株SpltMNPV核型多角体蛋白结构基因由 74 7个核苷酸编码序列 (编码 2 4 9个氨基酸 )组成 ,其序列与中国株SpltMNPV的同源性为 98 9% ,与其他 6种核型多角体病毒有较高的同源性 (6 1 7%～ 74 2 % ) ,但其 5′端侧翼序列 (nt_1～_10 0 )与AcMNPV和BmNPV相比差异显著 ,在对该基因表达调控起决定性作用的 8个高度保守核苷酸序列中 (nt_4 4～_5 1)有 2处发生自然突变。

家蚕中肠组织抗核型多角体病毒病的相关蛋白分析

家蚕中肠上皮是病毒经口侵入遇到的第一个组织。昆虫幼虫抵御杆状病毒的感染,可通过选择性的使感染的中肠上皮细胞发生调亡并在释放病毒粒子进入血淋巴之前使感染的细胞从中肠脱落。为研究家蚕抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopoledrovirus,BmNPV)病的机制,通过对BmNPV高度抗性和高度敏感性的家蚕品系杂交和回交构建了近等基因系。本文对家蚕高抗,敏感及近等基因系5龄起蚕中肠组织的蛋白质表达谱进行了二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分析,并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight,MALDI-TOF)质谱对差异蛋白进行鉴定。结果发现了5个差异表达的蛋白。推测这些蛋白可能与家蚕中肠对BmNPV的抗性或感性有关。

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析王根张传溪贡成良金伟吴祥甫（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）关键词棉铃虫，核型多角体病毒，多角体蛋白基因，核苷酸序列，同源性棉铃虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉ...

gp64基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖的抑制

【目的】研究gp64基因相对应的多个dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果。【方法】体外合成dsRNA,通过病毒滴度试验、实时定量RT-PCR法研究gp64基因的不同区域、不同长度与RNAi干扰效果的关系。【结果】供试的6个dsRNA的最大抑制效果相当(滴度TCID50的最大抑制差值为4.00左右);经RNAi的不同时间点的gp64mRNA表达水平均明显下调(P<0.01),其中48h的gp64mRNA的表达量约为对照的1/300。【结论】6个dsRNA均能有效地抑制病毒的基因表达和增殖;gp64ORF第1390～1499位点(G3-3)是RNAi的较佳靶位点。

以家蚕核型多角体病毒为载体高效表达天花粉蛋白基因

本文报道以家蚕核型多角体病毒为载体，在家蚕体内高效表达天花粉蛋白基因的结果。天花粉蛋白基因是用ＰＣＲ技术从栝楼基因组中分离的，该基因被插入到家蚕核型多角体病毒转移载体质粒ｐＢｍ—１的多角体蛋白基因启动子下游，构建成重组质粒ｐＢｍＴＣＳ。将重组质粒ＤＮＡ和野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕培养细胞，通过在家蚕培养细胞中进行同源重组和筛选，获得了无多角体的重组病毒ＢｍＴＣＳ。采用ＰＣＲ技术对重组病毒进行了鉴定，证实重组病毒合天花粉蛋白基因。重组病毒对家蚕的感染性不及野生病毒，提示表达产物对病毒的增殖有抑制作用。对重组病毒感染的家蚕血淋巴进行了ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和免疫印迹分析，结果显示在蚕体血淋巴中的表达产物天花粉蛋白占总蛋白的５％。本实验为利用基因工程方法大量生产天花粉蛋白提供了又一条新的途径。

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。

喂食家蚕核型多角体病毒诱导家蚕抗菌肽基因表达

【目的】阐明家蚕抗菌肽基因对病毒感染的中肠免疫应答模式,为揭示昆虫抗病毒机制提供参考。【方法】采用喂食家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)给家蚕的方式进行诱导,以实时荧光定量PCR检测诱导后家蚕抗菌肽基因的表达情况,并比较Bm NPV诱导下8类已知家蚕抗菌肽主基因(cecropin D、moricin、gloverin2、defension B、attacin1、enbocin2、lysozyme和lebocin3)在肠道组织中表达水平的差异。【结果】在喂食Bm NPV处理3 h时,家蚕中肠组织中呈上调表达的抗菌肽基因仅有moricin基因;处理6 h时,cecropin D、gloverin2、moricin基因转录水平均呈明显的上调趋势,尤其以gloverin2基因的诱导活性相对最高,是对照组gloverin2基因的9.22倍;而在处理12和24 h时检测,发现8类已知家蚕抗菌肽基因表达量均小于1.0,呈下调趋势。【结论】Bm NPV侵染家蚕后gloverin2基因表达量明显上调,可能是gloverin2基因作为主要功能基因在病毒侵染早期过程中发挥了重要作用。

家蚕核型多角体病毒几丁质酶基因

序列分析表明 :家蚕核型多角体病毒苏州株 (BmNPVsu)编码的ChiA基因的ORF为 16 5 6个核苷酸 ,编码 5 5 1个氨基酸。同源性分析表明 :杆状病毒编码的ChiA基因在DNA水平上、氨基酸水平上都具有较好的同源性 ,与灵菌的ChiA在氨基酸水平上的同源性达 47 8%～ 5 8 5 % ,推测杆状病毒编码的ChiA基因由细菌通过基因的水平转移而来。在杆状病毒ChiA的系统树中 ,舞毒蛾核型多角体病毒 (LdNPV)为一单独分枝 ,处于进化树的最根部 ,其余可分 2组 ,其中棉铃虫核型多角体病毒 (HaNPV)ChiA、谷实夜蛾核型多角体病毒 (HzNPV)ChiA为一组 。

家蚕核型多角体病毒egt基因的结构和功能分析

以苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒 (AcMNPV)的egt基因作探针 ,从家蚕核型多角体病毒镇江株 (BmNPVZJ- 8)基因组中克隆了egt基因及其旁侧序列 ,作了该片段的酶切图谱 ;测定了BmNPVZJ - 8egt基因序列。与AcMNPV的egt基因相比同源性为 95 % ;基因大小都为 15 18bp。利用egt基因旁侧序列构建了转移载体pUDegt,以绿色荧光蛋白基因 (EGFP)作报告基因取代egt基因 ,构建了由EGFP取代egt基因的重组病毒BmDegt。将含egt基因的BmNPV和不含egt基因的重组病毒BmDegt分别注射感染四龄家蚕幼虫 ,发现BmDegt感染的家蚕个体生长速度缓慢 ,家蚕个体小 。

家蚕核型多角体病毒gp64基因的克隆和全序列测定

：Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因在杆状病毒分子生物学和杆状病毒表达系统研究中具有重要的作用，以ＡｃＭＮＰＶ ｇｐ６４ 基因为探针，杂交显示Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因定位于其基因组Ｂａｍ ＨＩ酶切的４ ．２ｋｂ 和７－４ｋｂ 片段上，克隆阳性片段，重组质粒分别命名为ｐＺＤＢＭ４２ 和ｐＺＤＢＭ７４ 。对重组质粒进一步杂交，将片断更精确定位于０－４５ｋｂ 片段、０－７５ｋｂ 片断上和１－１５ｋｂ 片断上，将三个片断ＤＮＡ 进行序列分析，结果表明：Ｂｍ ＮＰＶ 的ｇｐ６４ 基因的开放阅读框（ＯＲＦ） 有１５３０ 核苷酸，编码５０９ 个氨基酸。序列同源性比较显示，Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因和ＡｃＭＮＰＶｇｐ６４ 基因的核苷酸序列同源性达８４－３ ％ ，氨基酸序列同源性达９４－７ ％ 。Ｂｍ ＮＰＶ ｇｐ６４ 基因Ｃ 端的信号肽序列和Ｎ 端的锚定序列对于Ｂｍ ＮＰＶ 表达系统的改进具有重要的意义。

异源多角体蛋白对家蚕核型多角体病毒粒子的包装

利用PCR方法从AcMNPV基因组DNA中分离出多角体蛋白基因 ,将该扩增片段克隆到转移载体pBacPAK8中 ,得到重组转移载体pOAc。将该质粒DNA与线性化的Bm BacPAK6病毒基因组DNA共传染BmN细胞 ,得到了能形成多角体且不产生蓝色空斑的重组病毒hp BmNPV。纯化该重组病毒的多角体颗粒 ,并对多角体蛋白、病毒核酸及多角体病毒颗粒进行分析 ,发现AcMNPV的多角体蛋白能在家蚕细胞中大量表达且能在细胞内识别家蚕核型多角体病毒并组装成多角体颗粒 ;病毒基因组DNA因部分交换 ,其酶切行为发生了相应的变化 ;电镜观察发现经AcMNPV多角体蛋白包装的家蚕核型多角体病毒的多角体颗粒大小为1 2 μm～ 2 9μm 。

家蚕核型多角体病毒bro基因的单核苷多态性研究

bro(baculovirus repeated ORFs)基因家族是一类存在于核型多角体病毒中比较复杂的基因家族。家蚕核型多角体病毒T3BmNPV基因组中有5个bro基因,分别为bro-a,bro-b,bro-c,bro-d,bro-e。对我国的BmNPVCQ1株进行了全基因组测序,与T3序列比较发现两个差异较大区域,分别命名为V1,V2区。在此基础上,对来自国内不同地区的另外5株BmNPV分离株对应的差异区域进行了研究,克隆了包含15个bro基因的10个DNA片段,其中包含了5个bro-c基因序列,5个bro-d基因序列,4个bro-e基因序列,加上公共数据库中已有的2个bro-c、2个bro-d、1个bro-e,合并后对bro-c、bro-d、bro-e分别进行核苷酸多态性分析,结果表明bro-c、d、e类基因都存在高密度的SNP位点。出现在这3类基因中的单核苷酸位点或核苷酸片段的插入/缺失数目分别为9、1、1。(θ,π)分析表明bro-c类基因的多态性在3类bro基因中最高。Tajima’D检验结果说明这些核苷酸变化符合中性突变假说。Pi(a)/Pi(s)分析暗示bro-c,bro-d和bro-e的N端的一些区段受到正向选择。

家蚕核型多角体病毒碱性磷酸酶基因(alk-exo)与杆状病毒的分子进化分析

基于为杆状病毒分类提供新的依据,克隆了家蚕核型多角体病毒苏州株(BmNPV-SU)碱性核酸酶基因(alk-exo)及其侧翼区,并进行序列和进化分析。BLAST检索显示,BmNPV-SUalk-exo上游的部分ORF109序列仅在AcNPV、RoNPV中检索到同源序列;下游区域在AcNPV、RoNPV、SlNPV的基因组中检索到同源序列。序列分析表明,BmNPV-SU的alk-exo基因编码420个氨基酸残基,下游区域存在2个正向的重复。比对结果分析显示,在22种杆状病毒中,alk-exo基因间核苷酸序列和氨基酸序列的同源性不高,变异较大。同时,利用MEGA软件包中的UMEGA算法建立了基于alk-exo基因的分子进化系统树,表明通过杆状病毒的进化可以反映宿主昆虫的进化,杆状病毒与其宿主昆虫之间存在共进化关系。