猪圆环病毒2型Cap蛋白家蚕表达体系的构建与鉴定

为了用家蚕杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白,将不同株系的PCV2 Cap蛋白基因、人工改造的Cap蛋白突变体基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体,用共转染技术成功构建了重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量Cap蛋白的表达产物。结果表明,纯化蛋白主要为病毒空衣壳粒子,推算PCV2空衣壳在家蚕中的表达量可达1.2 mg/蛹~1.6 mg/蛹。电镜观察可见到完整的空衣壳粒子,胶体金标记免疫电镜观察可见到完整的胶体金粒子,金粒大小为10 nm。

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDVVP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.

植酸酶基因在家蚕-杆状病毒表达系统中的表达及其酶学特性

将从黑曲霉菌株Aspergillusniger 96 3克隆并经改造后的植酸酶基因在昆虫 -杆状病毒表达系统中表达 ,SDS PAGE电泳检测蚕体和蛹的表达量分别达到 1.4 3g L血淋巴液和 1.90g L血淋巴液。酶活性测定结果表明 ,在蚕体和蛹的表达活性分别为 4 .6 7× 10 8u L血淋巴液和 5 .99× 10 8u L血淋巴液。该酶活性的最适温度范围为 5 0～6 0℃ ,最适pH值为 5 .5～ 5 .0和 2 .5。研究表明杆状病毒系统表达的植酸酶具有耐酸性和抗高温的特性 ,可以用于生产饲用植酸酶。

A组轮状病毒结构蛋白VP6在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

A组轮状病毒(rotavirus,RV)是婴幼儿严重病毒性腹泻的主要病原,VP6为轮状病毒的主要结构蛋白之一,天然VP6具有很强的抗原性和免疫原性。通过基因重组技术将A组轮状病毒T114中国地方株VP6基因克隆入转移载体质粒pBacPAK8中,并将重组质粒pBacPAK8-VP6与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6DNA共转染BmN细胞,获得重组病毒BmNPV-VP6。用BmNPV-VP6感染BmN细胞和家蚕5龄幼虫,Western blotting检测表明在BmN细胞和家蚕5龄幼虫的血淋巴中均可检测到120 kD的特异性条带,提示重组VP6蛋白在家蚕中获得表达,与VP6三体形式的大小相符合。ELISA检测结果显示,重组VP6蛋白在BmN细胞和家蚕5龄幼虫血淋巴中的表达分别在感染后第4天和第6天达到最高水平。VP6在家蚕杆状病毒表达系统中的成功表达可为新型轮状病毒疫苗的研制提供新的途径。

融合6个组氨酸的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在家蚕幼虫中的表达

将融合6个组氨酸(6×his)序列的hGM-CSF基因插入杆状病毒转移载体pBacPAK8中得到杆状病毒重组转移载体pBacPAKHis-GM-CSF,pBacPAKHis-GM-CSF DNA与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染BmN细胞,获得了表达rhGM-CSF融合蛋白的重组病毒vBacPAKHis-GM-CSF.用重组病毒感染家蚕五龄起蚕,分别在24、48、72、961、20 h和144 h剪腹足取蚕血淋巴,ELISA法测得rhGM-CSF融合蛋白在120 h的蚕血淋巴中表达量最高,约为15μg/mL蚕血淋巴.融合蛋白通过Poly-His Protein Purification Kit纯化.SDS-PAGE和Western blotting分析表明,表达产物是3种糖基化程度不同的,分子量分别约为18、203、1 kD的蛋白质.

O型口蹄疫病毒P1-2A3C基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进O型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取O型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法和间接血凝方法检测血淋巴中的表达产物:目的蛋白在感染病毒后120 h的蚕血淋巴中表达量最高,抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1∶128。结果显示O型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。

A型与亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒嵌合基因在家蚕杆状病毒载体中的表达

口蹄疫是一种严重危害畜牧业生产的烈性传染病。为了促进A型口蹄疫病毒(FMDV)基因工程活载体疫苗的研制,选取A型FMDV编码序列中的衣壳蛋白前体P1-2A基因中的VP1和VP3以及亚洲Ⅰ型蛋白酶3C基因,插入家蚕杆状病毒转移载体pVL1393中,构建重组载体pVL-P1-2A3C,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒Bm-P1-2A3C。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫,以双抗体夹心ELISA法检测血淋巴中的表达产物,结果显示目的蛋白在感染病毒后108 h的蚕血淋巴中表达量最高,A型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为1 024,而亚洲Ⅰ型抗原表达呈阳性的最大稀释倍数为2 048。结果表明A型和亚洲Ⅰ型FMDV的P1-2A3C基因已在家蚕体内获得表达。

人肠道病毒71型类病毒颗粒在家蚕BmN细胞及幼虫体内的表达

人肠道病毒71型（human enterovirus 71,EV71）是近年来暴发危害较严重的手足口病的病原。利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕卵巢培养细胞（Bm N）中共表达EV71病毒衣壳蛋白VP1与VP2,分析二者组装成病毒样颗粒（VLPs）的效率,比较用不同启动子构建重组病毒的表达效果,并利用家蚕幼虫进行2种蛋白质的共表达及VLPs纯化条件的研究。结果表明,重组病毒v Bm Bac-vp1-vp2与v Bm Bac-vp1-IRES-vp2均可介导EV71的VP1、VP2蛋白在Bm N细胞中表达,并能够组装成病毒样颗粒,但采用Pph及Pp10启动子的表达和组装效率明显高于Pph及IRES启动子组合;将重组病毒v Bm Bac-vp1-vp2以1×10^4TCID50/头的剂量注射5龄起蚕,Western blotting检测到VP1在幼虫血淋巴中特异性表达,并且随着感染时间的延长表达量增加;经蔗糖梯度密度离心能够有效地纯化蚕体血淋巴中的病毒样颗粒。研究结果为后续EV71疫苗研制奠定了一定的试验基础。

应用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕培养细胞和幼虫体内表达β-淀粉样蛋白

作为阿尔茨海默症(AD)重要神经病理学特征之一的脑内老年斑主要由β-淀粉样蛋白Aβ40和Aβ42聚集而成,Aβ42是其中的毒性成分。Aβ的特异性主动免疫对不同的转基因AD模型小鼠均有治疗作用,但临床试验中以注射方式给药容易诱发炎症反应。为了能够更好、更安全地采用主动的Aβ免疫疗法达到预防和治疗AD的目的,尝试用家蚕杆状病毒表达系统表达Aβ42蛋白。将Aβ42基因克隆入转移载体质粒pB acP AK8中,并使该重组质粒和家蚕杆状病毒Bm-BacP AK6线性化的DNA共转染家蚕卵巢培养细胞BmN,经筛选、纯化获得的重组病毒命名为BmN PV-Aβ42。用BmN PV-Aβ42感染BmN细胞和家蚕5龄起蚕后,利用Western blotting在BmN细胞和5龄幼虫血淋巴中均可检测到5 kD左右的特异性条带,证明重组Aβ42蛋白表达成功。ELISA检测显示,重组Aβ42肽在感染后第4天的BmN细胞和感染后第6天的5龄幼虫血淋巴中的表达量分别达到1.1 pg/个、2μg/mL。进一步提高Aβ42在家蚕杆状病毒表达系统中的表达效率,有望为研发预防和治疗阿尔茨海默症的可食性疫苗提供新型原料。

鸡κ干扰素在家蚕杆状病毒表达系统中的表达及其抗病毒活性检测

干扰素(interferon,IFN)是宿主先天免疫系统的重要组成部分,它是抵抗病原体的第一道防御。为了利用家蚕杆状病毒表达系统表达鸡κ干扰素,根据已报道的序列对鸡κ干扰素的基因序列进行家蚕密码子优化,并利用共转染技术成功构建了表达用重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量鸡κ干扰素的表达产物,并通过Western blot技术对产物进行了检测鉴定。用细胞病变抑制法对干扰素κ抑制VSV-GFP感染鸡成纤维细胞(CEF)的效果进行检测,结果显示鸡干扰素κ的抗病毒效价可以达到(1.04±0.23)×107 IU·mL-1以上。高效价鸡κ干扰素的成功表达为其在抗家禽疫病等方面提供了重要的试验数据。

家蚕杆状病毒表达系统及其在口蹄疫疫苗研究中的应用

口蹄疫（Foot and mouth disease, FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性人兽共患传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须通报的动物传染病，我国将其列为一类动物传染病。该病传播途径多，传播速度快。目前除了北美、澳洲等地区外，世界范围内多次暴发流行。最近几年，一些已经消灭FMD的国家又再次爆发，FMD防制形势依然严峻。在FMD防制中，加强流行病学监测和采取疫苗免疫是防制其发生的主要措施和关键环节。因此，特异性诊断抗原的制备和新型疫苗的开发就显得尤为重要。

戊型肝炎病毒结构蛋白p166在家蚕细胞及蛹体中的表达

目的探讨戊型肝炎病毒结构蛋白基因片段p166(HEVp166)在家蚕/BmNPV表达载体系统中的表达水平。方法应用PCR、基因克隆及共转染等技术将p166插入到家蚕杆状病毒多角体启动子的下游,构建重组病毒;并在家蚕细胞及家蚕蛹中表达p166。用间接免疫荧光试验检测感染36h后家蚕培养细胞中p166蛋白的表达情况。收集感染后144h的蛹样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodiumdodecylsulphate-Polyacrylamidegelelectrophoreses,SDS-PAGE)及Westernblot-ting分析。结果获得含有HEVp166基因片段的重组杆状病毒表达载体Bm-HEV166。Bm-HEV166能在家蚕细胞中表达p166蛋白,感染后的培养细胞中出现绿色球状体;感染Bm-HEV166的家蚕蛹血淋巴能高效表达p166蛋白,蛹血淋巴能与抗p166单克隆抗体发生特异性反应,在Mr为19000大小的位置出现一条明显的杂交条带。结论HEVp166基因片段在家蚕蛹中能获得高效表达,为进一步研制HEV口服疫苗奠定基础。

人白细胞介素-4基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4（human interleukin-4，hIL-4）基因。为高效表达hIL-4，促进其临床应用，将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，构建重组载体pBacPAK-hIL-4，并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞，获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹（1×10^5PFU／头），表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测。用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高，分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg／mL体液；SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD；表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。

家蚕生物反应器表达A组轮状病毒结构蛋白VP7

A组轮状病毒(rotavirus,RV)是引起某些幼龄动物患急性胃肠炎的主要病原之一,给家畜养殖业造成严重的经济损失。VP7蛋白是RV最外层的糖蛋白,具有强抗原性和免疫原性。本研究构建了重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP7,并分别感染家蚕细胞、家蚕5龄幼虫以及蚕蛹。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,在重组病毒感染的家蚕细胞、5龄幼虫以及蚕蛹中均检测到35 ku的特异性条带,说明成功表达了VP7蛋白。ELISA检测结果显示,VP7蛋白在家蚕细胞和蚕蛹中的表达分别在感染后第5天和第7天达到最高水平;而在家蚕5龄幼虫中,VP7蛋白表达量不高。家蚕具有食用和药用价值,我们构建的重组家蚕杆状病毒BmNPV-VP7在家蚕生物反应器中成功表达了VP7蛋白,为A组轮状病毒疫苗的研制提供了一条新途径。

家蚕杆状病毒DNA聚合酶在Bac-to-Bac系统的表达及活性检测

DNA复制是杆状病毒生活史中最重要的事件,其中DNA聚合酶是病毒复制过程的关键酶。从家蚕杆状病毒(Bm NPV)基因组PCR扩增获得DNA聚合酶基因Bm NPV-pol的序列,利用Bac-to-Bac系统构建重组杆状病毒v Bm NPV-POL,并感染家蚕5龄幼虫,通过SDS-PAGE和Western blotting检测重组Bm NPV-POL蛋白在蚕体内成功表达,经Ni-NTA柱纯化获得了纯度较高的重组Bm NPV-POL蛋白。以poly(d A)/oligo(d T)为模板,比较在原核细胞和家蚕杆状病毒表达系统获得的重组Bm NPV-POL蛋白的酶活性,结果表明在家蚕幼虫体内表达并纯化的重组Bm NPV-POL的酶活性明显较高。利用家蚕杆状病毒表达系统简便、快速获得重组Bm NPV-POL蛋白,有助于后续对Bm NPV复制机制的研究。

低分子量尿激酶与Annexin V的融合基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

将低分子量尿激酶与膜联蛋白 (AnnexinV)的融合基因重组到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK UKAV ,并与线性化的病毒Bm PAK6DNA共转染家蚕细胞 ,获得重组病毒BacPAK UKAV。将重组病毒BacPAK UKAV感染家蚕培养细胞 (MOI=10 )和 5龄幼虫 (10 5pfu/头 ) ,Western印迹方法表明表达产物大小约为 6 9kD。用纤维蛋白平板溶圈法测定表达产物的纤溶活性 ,其融合蛋白具有明显的纤溶活性 ,约为 5× 10 -5U/个细胞。用APTT法测定表达产物的抗凝活性 ,比野生病毒Bm PAK6感染表达产物的APTT时间延长了 1倍以上 ,表现出明显的抗凝活性。体外实验表明 ,家蚕培养细胞和幼虫表达的重组低分子量尿激酶与AnnexinV融合蛋白具有溶栓与抗栓双功能。研究结果为今后进一步探索具有溶栓抗栓功能的血栓药物提供了新的方向。

人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在家蚕中的表达与鉴定

目的 以家蚕为生物反应器表达人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），并检测其生物学活性。方法 将人TRAIL（93～281aa）基因重组于质粒pBacPAK8构建重组转移载体pBacAK8-TRAIL。与经线性化修饰的家蚕棱型多角体病毒（BmBacPAK）DNA共转染家蚕培养细胞株BmN，获得了插入TRAIL基因的重组病毒，重组病毒感染家蚕细胞和家蚕幼虫，使其表达人TRAIL。结果 Southern杂交表明重组病毒基因组中含有人TRAIL基因片段，RNA斑点杂交表明人TRAIL基因得到了转录，重组病毒感染家蚕细胞株（BmN）、家蚕幼虫，在细胞培养上清、细胞抽提物、幼虫的体液样品中通过Westblot分析都能检测得到表达产物的特异性条带；采用L929细胞检测TRAIL的生物学活性。结论 提示人TRAIL基因分别在家蚕培养细胞和蚕幼虫中得到高效表达，此基因杆状病毒表达系统的建立为进一步研究TRAIL奠定了基础。

RNA干扰技术和家蚕杆状病毒表达系统在纤维素酶研究中的应用前景

植物通过光合作用产生的纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素酶是糖苷水解酶的一种,能有效地将农作物秸杆等富含纤维素的物质水解为葡萄糖,进而发酵产生生物乙醇,从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。随着生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展,获得适合工业化的高活力的纤维素酶指日可待。RNA干扰是利用双链RNA特异性地降解相应序列的mRNA,从而特异性地阻断相应基因的表达,是后基因组时代的一种强有力的调控目的基因表达的实验工具。家蚕杆状病毒表达系统是一种快速、高效表达外源基因的技术手段,目前该系统的发展和应用已经非常成熟。本文综述了纤维素酶的特性以及近年来国内外对纤维素酶、RNA干扰和家蚕杆状病毒表达系统的研究进展,并对该两种实验技术手段在今后纤维素酶研究中的应用前景作了预测和展望。

鸭α干扰素在家蚕中的表达及抗病毒活性检测

鸭α干扰素(DuIFN-α)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤等生物学活性的细胞因子,可用于鸭及其他家禽养殖业中各种病毒性疾病的预防和治疗。将编码鸭α干扰素的基因序列密码子优化后进行合成,再对翻译起始序列进行优化,然后将2条序列分别克隆到杆状病毒转移载体上得到pVL1393-DuIFN-α和pVL1393-DuIFN-αm,与缺失orf1629的杆状病毒reBmBac共转染家蚕卵巢细胞系,获得携带目的片段的重组病毒reBmBac-DuIFN-α和reBmBac-DuIFN-αm。用重组病毒感染5龄起蚕后从血淋巴中获得表达产物,在鸡胚细胞中采用微量细胞病变抑制法检测表达产物对VSV?GFP病毒的抑制效果。结果显示,重组DuIFN-α产物的效价可达813×10^5U/mL,重组DuIFN-αm的效价可达307×10^5U/mL;重组病毒reBmBac-DuIFN-α经筛选纯化后,表达量提高,最高效价可达(190±025)×10^6U/mL。研究结果为利用家蚕杆状病毒表达系统表达生产高抗病毒活性的重组鸭α干扰素奠定了基础。

用杆状病毒表达载体在家蚕中表达犬γ干扰素及产物的抗病毒活性

利用杆状病毒表达载体在家蚕5龄幼虫体内高效表达犬γ干扰素(CaIFNγ)。将优化、合成的犬γ干扰素基因克隆到杆状病毒转移载体pVL1393的多角体蛋白基因启动子下游,与orf1629基因缺损的亲本病毒Bm-Bacmid DNA共转染BmN细胞进行同源重组,将获得的重组病毒接种家蚕5龄幼虫。Western blot检测感病幼虫的血淋巴中有分子质量约19 kD的目的蛋白质条带。用微量细胞病变抑制法在MDCK/VSV-GFP系统测定重组犬γ干扰素具有抗病毒活性,效价>5×106U/mL。研究结果为进一步研究犬γ干扰素的抗病毒活性和利用家蚕生物反应器生产犬γ干扰素奠定了一定的基础。