微酸性电解水对家蚕黑胸败血芽孢杆菌的杀灭效果及机制研究

微酸性电解水作为一种安全、高效、广谱的新型消毒剂,具有制备简单、成本低、使用后无残留、对人体无毒无害等优点。研究微酸性电解水对家蚕黑胸败血芽孢杆菌的杀灭效果及其杀菌机制,为其在蚕桑生产中的应用奠定基础。体外抑菌试验结果表明,有效氯质量浓度为40 mg/L、pH 5.5、氧化还原电位(ORP)为1100 mV的微酸性电解水处理5 min即可全部杀灭家蚕黑胸败血芽孢杆菌。生物学试验结果表明,该电解水对家蚕黑胸败血芽孢杆菌处理5 min后,家蚕黑胸败血芽孢杆菌的灭活率达到90%;处理15 min时,灭活率为100%。经微酸性电解水处理后,家蚕黑胸败血芽孢杆菌的外部形态发生改变,菌体膨胀、逐渐伸长,之后出现孔洞,最后菌体破裂、死亡;胞外电导率、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量逐渐增加;菌体DNA发生降解。试验结果表明微酸性电解水主要通过破坏家蚕黑胸败血芽孢杆菌细胞外部形态,改变细胞膜通透性,导致细胞内容物外渗,DNA结构受到破坏,达到杀菌目的。

家蚕黑胸败血芽孢杆菌基因组测序及结构分析和功能注释

黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombyseptieus)是家蚕细菌性败血病的常见病原之一。在获得黑胸败血芽孢杆菌基因组完成图的基础上,对该菌株的基因组测序、基因组序列结构特征以及基因功能注释等信息进行分析。该菌株的基因组测序数据量达到2.1 Gb,基因组覆盖度超过360倍,基因组组装大小为5.87 Mb,包含2个复制子——1个核基因组(5 295.783 kb)和1个质粒基因组(577.809 kb);基因组重复序列比率为1.179 2%,包含136个非编码RNA和5 298个编码基因。测序得到的基因组数据通过KEGG和COG数据库进行功能注释,主要与物质转运、氨基酸代谢、碳水化合物代谢等相关。基因组共线性分析表明黑胸败血芽孢杆菌与芽孢杆菌属细菌的亲缘关系较近。该研究结果将为鉴定黑胸败血芽孢杆菌的毒力因子以及研究其致病机制和与宿主的相互作用提供重要数据支撑。

几种大环内酯类药物对家蚕细菌性败血病防治效果的研究

在对卒倒杆菌和黑胸败血菌引起的细菌性败血病的防治试验中,依托红霉素、克拉霉素、罗红霉素和琥乙红霉素有效浓度均在15.6mg/L和7.8mg/L以下。接种卒倒杆菌后添食不同时间药叶,10mg/L、20mg/L、50mg/L依托红霉素、克拉霉素3h以上处理和罗红霉素、琥乙红霉素5h以上处理能达到100%的防治效果。

家蚕氨肽酶(BmAPN5)与黑胸败血芽孢杆菌伴孢晶体(PC)毒素相互作用

氨肽酶N(APN)属于锌金属肽酶M1(Peptidase_M1)家族的成员,不仅参与蛋白水解过程,而且也作为毒素受体参与病原微生物的致病过程。家蚕氨肽酶家族含有16个成员,其中BmAPN4结合黑胸败血芽孢杆菌产生的伴孢晶体(PC)毒素,为研究该基因家族其他成员是否与PC毒素结合,参与其致病过程。本文克隆家蚕中肠特异表达的氨肽酶家族成员BmAPN5基因,全长3 313 bp,编码953个氨基酸,含有1个锌金属肽酶M1和ERAP1_C结构域。构建原核表达载体,表达和纯化获得可溶性GST-BmAPN5重组蛋白。Far-Western blotting、免疫共沉淀和ELISA等实验结果表明BmAPN5和活化的PC毒素相互结合。通过构建BmAPN5细胞转染载体,转染Sf9细胞系,与PC毒素共孵育,导致细胞形态改变和裂解死亡;同时,乳酸脱氢酶含量测定结果 (LDH)表明BmAPN5参与PC毒素致病过程,导致细胞裂解死亡,使细胞培养基中的乳酸脱氢酶升高。上述结果表明BmAPN5作为一种功能性受体,PC毒素与其相互作用,参与了病原物的致病过程,为进一步揭示病原微生物黑胸败血芽孢杆菌与宿主相互作用的致病机制研究奠定了基础。

盐酸诺氟沙星在健康及细菌感染家蚕中的药代动力学研究

比较抗菌素盐酸诺氟沙星在健康和细菌感染家蚕间的药代动力学特征,可为临床合理用药提供科学依据。对健康及黑胸败血菌(Bacillus bombysepticus)感染家蚕幼虫用250μg/mL盐酸诺氟沙星药液处理的桑叶(剂量18mg/kg)添食,经高效液相色谱法(HPLC)检测不同时间的血浆药物浓度,并用MCP-KP药代动力学分析程序进行分析。结果表明,盐酸诺氟沙星在健康及细菌感染家蚕体内的血药浓度与时间关系均符合一级吸收一室开放模型。与健康家蚕药物代谢动力学参数相比较,盐酸诺氟沙星在细菌感染家蚕体内的药-时曲线下面积(AUC)由81.194mg/(h.L)降为66.105mg/(h.L),吸收半衰期(T1/2Ka)由1.252h延长为1.591h,分布半衰期(T1/2α)由2.673h缩短为1.981h,消除半衰期(T1/2β)由9.298h缩短为5.338h,说明细菌感染使盐酸诺氟沙星在家蚕体内的吸收能力下降,吸收减慢,分布和消除加快。

致病菌与非致病菌诱导对家蚕抗菌肽基因defensinA/B的表达定量分析

在致病菌(Bacillus bombyseptieus)与非致病菌(Escherichia coli)诱导家蚕后的不同时间,采用实时荧光定量PCR方法,对抗菌肽基因defensinA/B在脂肪体中的表达进行了定量分析。结果表明,在家蚕被注射黑胸败血芽孢杆菌致病菌和非致病菌(大肠杆菌)后的3、9、12 h,检测到脂肪体中的Bm-defA/B的转录活性上调,Bm-defB的响应活性高于Bm-defA,Bm-defB对黑胸败血芽孢杆菌致病菌的响应快于Bm-defA,提示Bm-defensins在家蚕对抗细菌侵染的免疫反应中发挥重要的作用。

家蚕细菌病防治新药配方筛选试验

采用7种抗菌药物对黑胸败血菌及灵菌进行体外抑菌试验,筛选出对上述病菌具有显著效果的2种药物。联合抑菌试验,显示2种药物具有协同作用;剂量筛选试验,筛选出2种药物的合理剂量配比。

家蚕类钙粘蛋白BtR-175基因敲除突变体创制和抗性检测

家蚕类钙粘蛋白BtR-175不仅是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)晶体毒素蛋白的受体蛋白,也是黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombysepticus)晶体毒素蛋白的受体分子。为建立对黑胸败血芽孢杆菌具有抵抗能力的家蚕品系,采用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术,设计引导RNA(gRNA)对家蚕BtR-175基因进行精确定点编辑,对蚕卵显微注射重组质粒pU C57-hA 4-Cas9和T-U6-BtR-175后,筛选获得2个碱基插入导致蛋白质翻译提前终止的BtR-175基因敲除突变体,命名为ΔBtR-175。4龄起蚕经口添食黑胸败血芽孢杆菌,结果ΔBtR-175突变体家蚕的死亡率为34.4%±5.8%,野生型家蚕的死亡率为57.8%±8.4%,表明ΔBtR-175对黑胸败血芽孢杆菌的侵染抵抗性显著提高。饲养试验显示ΔBtR-175突变体和野生型家蚕的茧层量没有显著性差异。该突变体有望进一步培育为家蚕抗性育种素材。

盐酸左旋氧氟沙星在健康及感染细菌病家蚕体内的药物动力学特征

盐酸左旋氧氟沙星是第3代喹诺酮类药物氧氟沙星的左旋体,抗菌活性高。5龄第2天健康及感染黑胸败血芽孢杆菌(Bacillus bombysepticus,Bb)家蚕幼虫用500μg/mL盐酸左旋氧氟沙星药液浸渍的桑叶添食处理后,采用超高效液相色谱测定健康家蚕和感病家蚕血淋巴中的药物浓度,用DAS 2.0处理软件分析得到药物动力学参数,为生产上合理使用该药物防治家蚕细菌病提供科学依据。结果表明健康家蚕和感染Bb的家蚕添食盐酸左旋氧氟沙星后的血药经时过程均符合一级吸收一室开放式模型,健康家蚕的药动学参数吸收速率常数(Ka)为(0.507±0.032) h-1,吸收半衰期(T1/2Ka)为(1.425±0.017) h,最高血药浓度(Cmax)为(5.352±0.155)μg/mL,说明蚕体对盐酸左旋氧氟沙星吸收良好,血药浓度高;与健康家蚕相比,感染Bb家蚕的Ka由0.507 h-1降至0.386 h-1,T1/2Ka由1.425 h延长至1.798 h,药-时曲线下面积(AUC)从38.770μg/(mL·h)降为35.909μg/(mL·h),分布半衰期(T1/2α)由1.679 h缩短为1.483 h,消除半衰期(T1/2β)由4.922 h降为2.450 h,说明Bb感染家蚕后导致药物在蚕体内的吸收减慢,吸收能力下降,代谢和消除加快。建议生产上用盐酸左旋氧氟沙星防治Bb感染引发的家蚕细菌病时,可适当提高药物剂量和增加给药次数,使蚕体内药物浓度维持在较高水平,保证良好的防治效果。