家蝇幼虫血淋巴MAC-1对LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌炎性因子的影响

目的探讨家蝇幼虫血淋巴多肽MAC-1对脂多糖(LPS)诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)水平的影响及其基于NF-κB转录因子可能的作用机制。方法用5%淀粉经小鼠腹腔注射诱导巨噬细胞产生,采用差速贴壁法分离纯化。96孔板中细胞随机分成6组:5mg/L LPS分别与50、200、500、1 000μg/ml浓度MAC-1共同作用组,阴性对照组(10%MEM),阳性对照组(5mg/L LPS);12孔板细胞随机分6组:MEM阴性对照组,50μg/ml MAC-1组,5mg/L LPS组,50μg/ml MAC-1+5mg/L LPS组,5mg/L LPS+10μmol/L PDTC组,5mg/L LPS+10μmol/L PDTC+50μg/ml MAC-1。两种分组均给药培养12h,收集细胞上清液并提取细胞mRNA,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测细胞炎性因子及其基因表达和Toll样受体(TLR4)、NF-κBp50基因相对表达量。结果阴性对照组和LPS组巨噬细胞IL-1β和IL-6分别为220.9±20.3pg/ml和269.06±13.54pg/ml以及212.21±13.54pg/ml和269.43±21.12pg/ml,差异有统计学意义(F=11.02,15.60,P<0.01);TNF-α为185.00±7.38和204.77±34.30pg/ml,差异无统计学意义(F=0.64,P>0.05)。50μg/ml组与其他MAC-1浓度组相比IL-1β、IL-6、TNF-α均显著降低(F=10.46,68.13,16.45,P<0.05);IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR4、NF-κB基因相对表达量LPS组较其他组显著增高(F=13.39,10.45,21.25,30.81,17.53,P<0.05或P<0.01),LPS组与50μg/ml MAC-1+LPS组比较差异有统计学意义(F=14.62,15.11,18.78,128.46,12.81,P<0.01),PDTC+LPS组与PDTC+LPS+MAC-1组比较差异均无统计学意义(F=0.25,2.40,0.27,1.55,1.22,P>0.05)。结论 MAC-1能抑制LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌相关炎性因子,其机制可能与NF-κB转录因子有关,尚待进一步研究。

家蝇幼虫血淋巴对鸡免疫功能的影响

将100只1日龄雏鸡随机分为4组,用家蝇幼虫血淋巴按不同剂量给鸡灌服,用药一定时间后,对21,35,50日龄鸡分别随机抽取8只进行称重、颈静脉采血和剖杀,取脾脏、法氏囊进行称量,测定血淋巴对鸡体重及免疫器官的影响,并利用E 花环形成试验、鸡新城疫血凝抑制(ND HI)试验检测血淋巴对鸡的细胞免疫、体液免疫功能的影响.结果表明:血淋巴对鸡体重、脾脏、法氏囊重各组间差异均不显著.E 花环试验中21,35日龄各组间差异显著,50日龄各组间差异极显著;ND HI试验中21,35日龄各组间差异不显著,50日龄各组间差异极显著.说明家蝇幼虫血淋巴在增强鸡的细胞免疫与体液免疫功能方面具有明显的促进作用.

家蝇幼虫血淋巴抗白念珠菌作用的初步研究

目的 用微量液体培养生长抑制法检测家蝇幼虫血淋巴的抗白念珠菌活性。方法 用大肠杆菌接种家蝇 3期幼虫 ,收集接种后不同时间血淋巴 ,设立空白对照、药物对照和蛋白酶K对照组 ,检测血淋巴和血淋巴 80℃ 5min去粗蛋白后提取多肽对 3株白念珠菌的抗菌活性。结果 大肠杆菌诱导 2 4h后血淋巴出现抗白念珠菌活性 ,能被水解蛋白酶灭活 ,去粗蛋白后仍有活性 ,对氟康唑敏感株及耐药株白念珠菌均有抑制作用。

家蝇幼虫血淋巴中凝集素的研究

家蝇幼虫血淋巴中凝集素不但能凝集兔、羊、鸡、豚鼠、小鼠和大鼠的红细胞,而且能凝集任何血型人的红细胞,其凝集活性能被D-半乳糖和乳糖所抑制。比较了不同诱导源诱导后血凝活性的动力学变化,发现体壁损伤后凝集素应答较快,活性高、消退快;^(60)Coγ射线诱导后凝集素应答较慢、活性低、消退较慢;超声波和紫外线几乎无诱导作用。还发现化蛹后24小时的血淋巴其凝集活性也较正常的高。

家蝇幼虫血淋巴粗提物抑菌活性初步研究

以4种细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌)为供试菌,测定了家蝇幼虫血淋巴粗提物的抑菌活性。结果显示,家蝇幼虫血淋巴各浓度粗提物对4种供试细菌均有一定的抑菌活性,其中对金黄色葡萄球菌的抑菌率最大,其他依次为大肠杆菌>枯草芽胞杆菌>巨大芽孢杆菌,在0.8mg/mL时的抑菌率分别为51.09%、48.66%、43.27%和40.62%;在各浓度下不同菌种之间的抑菌率差异不显著,抑菌活性随着血淋巴粗提物浓度的增加而增强。在0.8mg/mL时对各细菌的抑菌圈直径分别为12.00mm、12.22mm、9.11mm和10.33mm,均显著大于对照,但低于头孢霉素。

应用iTRAQ标记技术结合2DLC-MS/MS分析家蝇幼虫免疫诱导后血淋巴蛋白质组

目的分析家蝇幼虫免疫诱导前后血淋巴中的免疫防御相关靶标,探索其先天性免疫机制。方法采用同位素标记及相对定量技术(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)结合2D LC-MS/MS对家蝇幼虫诱导前后的血淋巴蛋白质组进行研究。结果与对照组比较研究后共获得237个不同肽段,鉴定到13个具有定量信息的差异蛋白。免疫刺激后显著上调的蛋白有9个,下调蛋白4个(P<0.05),对鉴定到的差异蛋白进行理化性质分析和GO(gene ontology)注释分析,发现这些蛋白分别具有抗菌、抗氧化、催化结合等功能,并参与了免疫、代谢、应激、转运等生物学过程,表明对家蝇幼虫经诱导后血淋巴中多种功能蛋白的表达发生了变化。结论 iTRAQ标记技术结合2D LC-MS/MS可以有效地分离鉴定昆虫血淋巴蛋白质组,为深入研究差异蛋白的功能奠定了基础。

感染大肠杆菌后家蝇幼虫血淋巴细胞的观察

目的探讨家蝇三龄幼虫被大肠杆菌感染后的细胞免疫反应。方法观察家蝇三龄幼虫感染大肠杆菌后4、8、16及24h血淋巴细胞总数(THC)及各类血细胞数量(DHC)的变化。观察大肠杆菌感染后家蝇幼虫血细胞形态的变化。结果①与对照组比较,感染4、8、16、24h组THC均有显著增加(P<0.01);感染后各时间组的浆血胞和粒血胞数均显著升高(P<0.01);感染后16、24h组的珠血胞数显著升高(P<0.01);各时间组的原血胞和类绛血胞数量无明显变化(P>0.05)。②感染后4、8、16h组的浆血胞和粒血胞的比例明显增加(P<0.01),感染后各时间组的珠血胞的比例均明显减少(P<0.01),各时间组原血胞和类绛血胞的比例均无明显变化(P>0.05)。③感染大肠杆菌后,浆血胞发生空泡、细胞变形等变化。结论家蝇幼虫感染大肠杆菌后在体内诱发的细胞免疫反应表现为血淋巴细胞数量、分类及形态出现变化,其中浆血胞和粒血胞两类细胞是免疫反应的主要参与者,珠血胞也可能参与细胞免疫反应。

巯基乙醇对家蝇幼虫血淋巴抑菌活性的影响

以大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌为指示菌,利用琼脂糖孔穴扩散法,检测了巯基乙醇对家蝇幼虫血淋巴抑菌活性的影响。结果显示,巯基乙醇本身对3种指示菌具有抑菌活性,其非抑菌浓度为至少稀释106倍;当巯基乙醇稀释106倍时,可有效保护不高于1∶5浓度的家蝇幼虫血淋巴悬液不被氧化,且与对照相比不影响血淋巴的抑菌活性;当巯基乙醇稀释少于106时,血淋巴的抑菌活性明显增大。

家蝇幼虫血淋巴粗提物的抑菌活性分析

试验对家蝇幼虫血淋巴的抑菌活性进行了测定。结果显示,家蝇幼虫血淋巴对革兰阴性菌大肠杆菌、沙门菌和革兰阳性菌金黄色葡萄球菌均有抑杀作用,对于革兰阴性菌的抑杀作用大于革兰阳性菌,0.8mg/mL的血淋巴粗提物可达到约50%的抑杀率。

两种提取家蝇幼虫血淋巴方法的比较

目的:对剪头法和瞬时破壁法提取的家蝇幼虫血淋巴粗提液进行蛋白浓度和SDS-PAGE分析比较。方法:分别采用剪头法和瞬时破壁法提取家蝇幼虫血淋巴粗提液,同时设立未诱导组和热诱导组,测定各组的蛋白浓度进行比较分析,并对各组血淋巴粗提液进行SDS-PAGE的分析比较。结果:剪头法热诱导组的血淋巴粗提液蛋白浓度高于未诱导组,瞬时破壁法提取的血淋巴粗提液蛋白浓度高于剪头法;经SDS-PAGE分析,瞬时破壁法提取的血淋巴粗提液蛋白条带明显多于剪头法。结论:瞬时破壁法提取家蝇幼虫血淋巴简便易行,所提取的血淋巴蛋白成分多于剪头法。

巯基乙醇在家蝇幼虫血淋巴中适宜添加量研究

[目的]为家蝇幼虫血淋巴抗菌活性物质的分离、纯化提供依据。[方法]以大肠杆菌为指示菌,利用琼脂糖孔穴扩散法研究巯基乙醇对家蝇幼虫血淋巴抑菌活性的影响,确定巯基乙醇作为抗氧化剂在家蝇幼虫血淋巴中的适宜添加量。[结果]巯基乙醇能抑制大肠杆菌的生长,抑菌效果随其浓度的增加更为明显。当巯基乙醇体积浓度≤10-6时,其对大肠杆菌无抑菌效果,说明巯基乙醇的最大非抑菌体积浓度为10-6。体积浓度为10-6的巯基乙醇可有效保护浓度小于或等于1∶5的家蝇幼虫血淋巴悬液不被氧化,且其对大肠杆菌的抑菌效果不受影响。[结论]巯基乙醇在家蝇幼虫血淋巴中的适宜加入量应根据试验中具体情况确定。

家蝇幼虫血淋巴对鸡免疫器官发育和免疫球蛋白IgA含量的影响

向15日龄的雏鸡饲料中添加0.024g·只-1·日-1的家蝇幼虫血淋巴冻干粉,连续饲喂至49日龄,试验期间每周随机抽样8只,称重,采血,解剖取法氏囊、脾脏和胸腺,测定免疫器官指数和免疫球蛋白IgA含量。试验结果显示:添加家蝇幼虫血淋巴的试验组与对照组相比,试验期内体重和脾脏的变化差异不明显,法氏囊和胸腺前期差异不显著而后期差异显著,免疫球蛋白IgA能够维持较高水平。所以,家蝇幼虫血淋巴能显著增强鸡体的免疫力。

家蝇免疫血淋巴对几种动、植物病原菌的抑菌作用

针刺损伤诱导的家蝇三龄幼虫免疫血淋巴对几种动、植物病原菌具有抗菌活性。同时，未经诱导的家蝇幼虫血淋巴也具有抗菌活性，但外源诱导能衡量增强抗菌物质的活性，这表明家蝇免疫血淋巴中抗菌物质的表达可能受结构基因的调控。

家蝇幼虫淋巴液的抑菌作用及其SDS-PAGE分析

目的观察针刺诱导家蝇幼虫血淋巴抗菌物质抑菌作用与抗菌分子。方法室内饲养的家蝇三龄幼虫,经针刺体壁处理后48h,提取其血淋巴,观察单独使用血淋巴和血淋巴与氨苄青霉素混合对9种应试细菌的抑菌效果,血淋巴与抗真菌药氟康唑混合对酵母真菌抑菌效果,应用SDS-PAGE分析血淋巴抗菌分子表达。结果针刺家蝇幼虫后48h的血淋巴,作用于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏痢疾杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、黄色小球菌,结果显示:针刺家蝇幼虫后48h的血淋巴对试验9个标准株细菌,均产生明显抑菌环,经单因素方差分析,显示各抑菌试验组的抑菌效果,皆有显著差异(P<0.001)。其中对黄色小球菌抑菌活力最强。1μ1氨苄青酶素与7μ1针刺诱导家蝇幼虫淋巴液混合对白色葡萄球菌抑菌效果呈现最好的加强抑菌作用。针刺诱导家蝇幼虫血淋巴与抗真菌药物氟康唑混合对酵母真菌抑菌效果呈现明显协同增强作用。SDS-PAGE分析结果显示:针刺幼虫后发育的成蝇和针刺幼虫血淋巴的电泳条带与未针刺者相比,针刺幼虫后发育的成蝇,在24000￣97000范围内表达尤为增强,在12000附近有一条特异性条带。针刺家蝇3龄幼虫血淋巴SDS-PAGE分析显示,在24000、35000、40000￣96000范围内表达明显增强,其中35000、12000条带较为特异。结论本研究进一步验证了家蝇血淋巴的抑菌活性,发现针刺诱导家蝇幼虫血淋巴对黄色小球菌抑菌活力最强,氨苄青霉素与家蝇幼虫淋巴液混合对白色葡萄球菌抑菌效果呈现最好的加强抑菌作用,针刺诱导家蝇幼虫血淋巴与抗真菌药物氟康唑混合对酵母真菌抑菌效果呈现明显增强作用,上述发现在国内外报道较少,本研究结果,为进一步开发这类抗菌物质,提供了实验资料。

家蝇免疫血淋巴的抑菌作用及其免疫活性的研究

目的研究家蝇幼虫免疫血淋巴抑菌作用及其机制并探讨其免疫调节功能。方法分未经诱导、针刺诱导、蘸菌液诱导三组提取家蝇幼虫免疫血淋巴,分别针对多个标准菌株做抑菌实验,并设立空白对照和药物对照,观察抑菌效果。淋巴细胞转化实验研究家蝇血淋巴的免疫调节作用。结果三种处理方法所提取的家蝇幼虫血淋巴对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、肺炎克氏菌、铜绿假单胞菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等革兰氏阳性菌、阴性菌及单细胞真菌白色念珠菌均有强的抑菌作用,其中带菌诱导的血淋巴抑菌效果较好,并且抑菌活力具有一定的热稳定性。血淋巴对人淋巴细胞的激活作用明显,淋巴细胞的转化率与对照组比较差异有显著性。结论本研究进一步验证了家蝇血淋巴的抑菌活性和免疫功能,为家蝇血淋巴的抗菌机制及免疫调节作用的深入研究和应用提供资料。

家蝇免疫血淋巴抗HeLa肿瘤细胞蛋白的筛选及纯化

目的从家蝇3龄幼虫血淋巴筛选具有抗肿瘤细胞HeLa(宫颈癌细胞)的蛋白。方法采用固相萃取、反相高效液相色谱分离、四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色法,从热诱导家蝇3龄幼虫免疫血淋巴筛选抗肿瘤多肽。结果经10%～50%乙腈洗脱C18固相萃取柱,获得mp1、mp2、mp3、mp4、mp5等5个具有抗HeLa的活性组分,以40%乙腈萃取组分活性最强达38%,而顺铂抑制率为57%,经反相高效液相色谱分析,该固相萃取活性组分由2个片段组成,分别为出现在280nm波长下24 min和29 min,对HeLa具有抑制作用,与顺铂的抗肿瘤活性相接近。结论家蝇3龄幼虫血淋巴具有抗He-La的mp1、mp2、mp3、mp4、mp5 5个组分,MP4活性最强,由2个分子量为16KDa成酸性的多肽片段组成。

家蝇幼虫血淋巴提取物抗肿瘤作用

目的探讨家蝇3龄幼虫血淋巴40%固相萃取组分抗肿瘤作用及机制。方法应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测40%固相萃取组分对S180肉瘤细胞株生长的抑制作用;通过体内试验检测40%固相萃取组分对S180小鼠实体瘤生长的抑制率,测定荷瘤小鼠血清总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量变化。结果在体外,40%固相萃取组分25μg/mL对S180肉瘤细胞增殖抑制率最高达79%,与阴性对照组比较差异有统计学意义(t=6.40,P<0.05);40%固相萃取组分有抑制S180实体瘤小鼠肿瘤生长的作用,高、中、低剂量组肿瘤生长抑制率分别为46.23%、35.23%、32.13%;与模型对照组(3.19±0.80)、(163.41±22.65)U/mL比较,3个剂量组的血清T-AOC和SOD活性均升高,其中高剂量组小鼠血清T-AOC和SOD活性分别为(4.91±0.46)、(213.19±43.37)U/mL,差异均有统计学意义(tT-AOC=7.12、tSOD=-7.16,P<0.01);3个剂量组的血清MDA含量均降低,其中高剂量组血清MDA含量为(8.85±1.81)nmol/mL,差异有统计学意义(tMDA=6.79,P<0.01)。结论 40%固相萃取组分在体外和体内均具有抑制S180肉瘤细胞生长的作用,清除自由基可能是其体内抗肿瘤机理。

家蝇幼虫血淋巴不同Tricine-SDS-PAGE分析方法比较

目的用3种不同的三羟甲基甘氨酸-十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)方法分析家蝇三龄幼虫血淋巴。方法分别用不含尿素也不含甘油的分离胶组成的普通Tricine-SDS-PAGE方法,分离胶中有尿素组分的三层胶方法,分离胶中有甘油组分的三层胶方法分析家蝇三龄幼虫血淋巴。结果家蝇幼虫血淋巴中含有丰富的小分子多肽,用不含尿素也不含甘油的分离胶组成的普通Tricine-SDS-PAGE方法不能有效分离分子量在<10.700 kDa的小分子蛋白或多肽;分离胶中有尿素组分的三层胶方法虽能清晰分离家蝇幼虫淋巴中<16.949kDa的小分子蛋白或多肽,但对其分子量的测定可能不够准确;而分离胶中有甘油组分的三层胶方法既能很好分离>14.4 kDa的蛋白,也能清晰分离<8.159 kDa的小分子多肽,并能较准确的反映其分子量大小,用于分析家蝇幼虫血淋巴效果较好。结论分析家蝇幼虫血淋巴应采用分离胶中有甘油组分的三层胶的电泳方法。

家蝇幼虫血淋巴纯化蛋白对Hela肿瘤细胞抑制作用的形态学观察

目的研究家蝇幼虫血淋巴纯化蛋白(anticancer protein from Musca domestica larva hemolymph,MAC-1)对体外培养的人宫颈癌Hela细胞抑制作用引起的形态学改变。方法应用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法、光学显微镜、HE和吖啶橙(AO)染色、透射电镜(SEM)的方法检测MAC-1对体外培养的人宫颈癌Hela细胞的抑制作用及形态学改变。结果 MAC-1对人宫颈癌Hela细胞株的增殖抑制作用呈剂量依赖性,同时呈时间依赖性。MAC-112.5μg/ml作用12 h后在倒置显微镜、HE及AO染色和透射电镜均观察到典型细胞凋亡形态变化。结论 MAC-1对人宫颈癌Hela细胞株具有抑制增殖及诱导凋亡作用。