实时定量PCR法检测生物技术药物中宿主基因组DNA残留

利用基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时定量PCR方法检测酵母表达生物技术药物产品中宿主DNA残留量。该方法检测灵敏度可达到1.0 fg/μL,DNA浓度在1.0 fg/μL^1.0 ng/μL范围内线性良好,其标准曲线的相关系数为0.99以上。应用该方法对3批不同实验样本进行测定,宿主DNA残留量分别为8.635×105fg/μL、6.265×102fg/μL和1.436 fg/μL。实验表明该方法操作简便、灵敏度高,可用于生物技术药物产品中酵母DNA残留的定量测定。

生物制品中宿主细胞残留DNA的检测研究进展

宿主细胞残留DNA是生物制品中最为常见且影响安全性的工艺杂质之一,因其具有潜在的安全风险,国内外监管机构分别要求在成品检定或在适宜的中间产物控制阶段对其进行检测并控制在可接受的限度范围内。通过不同生产阶段产品的监测,验证去除的效果,有助于确认生产工艺的科学性与稳定性。为加深对生物制品宿主细胞残留DNA控制策略的认识与理解,作者结合实际工作及文献调研情况,对生物制品中宿主细胞残留DNA相关研究内容进行梳理,以期为今后相关工作提供参考。

Real-time PCR检测核酸疫苗中宿主基因组残留DNA

目的建立Real-time PCR方法,用于定量检测核酸疫苗中宿主基因组的残留DNA。方法以Lightcycler平台为基础,选择大肠杆菌23S核糖体RNA基因为靶标基因设计扩增引物,建立基于SYBR GreenⅠ荧光染料的Real-time PCR检测方法,并用于核酸疫苗纯化过程中间产物的检测。结果整个检测过程可在30min内完成,特异性强,检测灵敏度可达10fg/μl,其标准曲线的相关系数为-0.99。结论该方法可用于核酸疫苗中宿主基因组残留DNA的检测。

实时定量PCR检测重组技术产品中宿主基因组DNA残留

目的:建立Real-time PCR方法,用于定量检测重组技术产品中宿主基因组DNA的残留。方法:以ABI 7500 FAST平台为基础,选择大肠杆菌23S核糖体RNA基因为靶标基因设计扩增引物,建立基于SYBRGreenI荧光染料的real-timePCR检测方法,用于重组技术产品宿主DNA残留的质量控制。结果:该法检测宿主DNA残留灵敏度可达到1fg(1×10-6ng),DNA浓度在1×10-5～100ng.μL-1范围内线性良好,其标准曲线的相关系数为0.99以上。应用该法对4批重组人粒细胞刺激因子进行测定,外源DNA残留量分别为每剂量6.699×10-3,7.948×10-3,9.362×10-3,7.506×10-3ng。结论:该方法具有操作简便、灵敏度高等优点,可用于重组产品中大肠杆菌残余DNA的定量测定。

抗龋基因疫苗pcDNA3-gtfB整合宿主细胞基因组DNA的可能性研究

目的 用基因疫苗pcDNA3_gtfB免疫大鼠 ,探讨基因疫苗整合入宿主细胞的可能性。方法 将 36只Wistar大鼠分为两组 ,一组为pcDNA3_gtfB颌下腺免疫组 ,另一组为PBS缓冲液颌下腺对照组。取Wistar大鼠颌下腺、肾脏、肝脏、心脏、肺脏、脑组织 ,以对照组 6种组织基因组DNA为模板 ,加入不同梯度拷贝数的pcDNA3_gtfB ,采用Pyrobest聚合酶PCR反应体系 ,确定PCR反应敏感性。以免疫组 6种组织基因组DNA为模板 ,检测pcDNA3_gtfB的整合率。结果 本实验PCR体系的检测水平为在 1 0 0 0 0个组织细胞核中能检测出一个pcDNA3_gtfB拷贝(1∶1 0 0 0 0 ) ,在此检测水平下 ,免疫组 6种组织基因组DNA中未发现整合。结论 pcDNA3_gtfB整合入宿主细胞基因组DNA的概率不超过 1∶1 0 0 0 0 。

地高辛标记的DNA探针检测核酸疫苗中宿主菌基因组DNA的含量

将合成的引物与宿主菌的染色体模板 DNA进行 PCR扩增的核糖体 DNA片段 ,以地高辛进行标记 ,与待测 DNA样品进行点杂交 ,确定制备的乙肝 DNA疫苗中其宿主菌基因组含量 <15 ng/μg质粒 DNA。这提示地高辛标记的探针用于检测基因组 DNA的方法灵敏。

一种快速检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留的方法

总RNA样本中残留基因组DNA会严重影响qRT-PCR的准确性。为了检测RNA样本中的DNA残留,依据持家基因TIP41-like的部分内含子序列设计了1对基因组DNA残留检测引物:LDRG-F:5'-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3'及LDRG-R:5'-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3'。利用这对引物对3种不同RNA提取试剂盒提取的总RNA样本以及2种不同第1链c DNA合成试剂盒合成的cDNA样本进行PCR扩增检测,能高效快速地检测岷江百合总RNA以及cDNA样本中有无基因组DNA残留。

实时定量PCR检测重组生物制品中毕赤酵母基因组DNA的残留量

目的：建立real-time PCR定量检测毕赤酵母基因组DNA的残留量,提高重组生物制品的产品安全性。方法：以Thermo Fisher Piko Real 96扩增仪平台为基础,选择毕赤酵母GS115的r DNA的5.8s RNA基因为靶基因设计扩增引物,提取酵母基因组DNA,稀释后作为扩增模板,建立实时-PCR定量检测方法,并进行检测限、精密度和回收率等方法学验证,用于重组产品宿主DNA残留的质量控制。结果：该方法检测灵敏度可达0.005 pg·μL-1,DNA浓度在0.005~500 pg·μL-1范围内线性良好,其标准曲线的相关系数为0.99以上。结论：该方法具有操作简便、灵敏度高、可定量等优点,可用于重组产品中毕赤酵母菌残余DNA的定量测定。

猪肺炎支原体基因组DNA文库的构建

将猪肺炎支原体Z菌株接种于A2 6液体培养基中培养 ,在收获菌体细胞后 ,提取和纯化其基因组DNA。并经EcoRI大量酶切获得 4 .0～ 8.0kb的DNA片段 ,与λgt11载体臂连接为重组λDNA ,然后进行包装 ,感染于Y10 90宿主菌 ,构建了猪肺炎支原体基因组DNA文库 ,并得以表达。

生物工程产品中残留宿主DNA检测方法的研究

生物工程产品中残留宿主ＤＮＡ检测方法的研究军事医学科学院放射医学研究所（北京１００８５０）刘耀清刘志红杨景庚黄文杰王勇马立人生物工程产品中残留的宿主细胞ＤＮＡ是一种潜在的与工艺相关的杂质。各种产品中所含的残留ＤＮＡ，取决于所用的宿主微生物（细菌或细胞...

地高辛标记探针检测重组白细胞抑制因子-水蛭肽嵌合蛋白宿主DNA残留量的研究

重组白细胞抑制因子一水蛭肽嵌合蛋白（recombinantneutrphilinhibitoryfactorandhiruloghybrid，TNHH）是一种通过基因工程技术改造的新型嵌合蛋白，临床上可用于急性脑栓塞后的脑组织损伤修复，减少脑水肿，防止微小血栓形成从而改善微循环，是一种有前景的心脑血管疾病治疗创新药物，

生物技术药物中宿主DNA残留Q-PCR检测法的方法验证

自20世纪50年代,用于生产生物技术药物的细胞基质一直因其安全性而备受关注,生产用基质细胞经历了从原代细胞,二倍体细胞到传代细胞的发展历程,人们对其潜在风险的认识也在不断变化。虽然,至今没有因为生物制品中DNA残留量而引发不良反应或安全事故,但其用量随着临床治疗的需求越来越大,需要长期反复用药的生物制品也越来越多,同时,疫苗的使用者为健康人群,这些都使得药品监管部门更加重视生物技术产品的安全性，其中DNA残留量的质量控制一直是人们关注的热点。

生物制品宿主细胞残留DNA检测限定标准及方法浅析

近年来热度骤增的生物制品药物对诸多疾病疗效斐然,在药品市场中所占比重也是节节攀升。于是生物制品与之俱来的生物安全性问题被渐渐提上日程,其中宿主细胞残留DNA由于可能会传递肿瘤或病毒相关基因,存在潜在的危险性,各国药品监督管理机构对其残留量有着严格的限度控制。同时,各国药典也陆续提供数种关于宿主细胞残留DNA检测经典的方法,目前以实时定量聚合酶链式反应(PCR)方法为最优,因其专一性强、灵敏度高、快速且可实现高通量。本文介绍了一些国内与国外监管机构出台的关于生物制品宿主细胞残留DNA检测的限定规定,并对现有的常见检测方法进行描述、总结和比较。

裁剪重组酶可切除插入基因组的HIV DNA

据医业网6月28日报道（原载Science2007；29：1912-1915），研究者研发了一种裁剪重组酶，这种酶能够识别和切除整合到宿主细胞基因组的HIV DNA。德国分子生物学和遗传学研究所的Frank Buchholz博士及其同事指出，当前的抗HIV治疗主要是靶向病毒酶，或防止病毒一细胞融合。

qPCR在重组腺相关病毒产品大片段宿主细胞残留DNA检测中的应用

目的考察qPCR法检测重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)基因治疗产品中大片段宿主细胞残留DNA(host cell residual DNA,HCD)的可行性。方法提取4种不同血清型rAAV核酸,采用qPCR法对宿主HEK293细胞基因组长末端重复序列(long terminal repeat sequence,LTR)中244和562 bp两个片段序列进行特异性定量,计算HCD在基因组中的占比。结果可在qPCR法定量限范围内检出4种不同血清型rAAV样品大片段HCD,占比为0.3%~5.4%,且随着检测片段长度增加,占比呈降低趋势。结论qPCR技术可用于rAAV产品中大片段HCD的检测。

DNA含量测定方法在生物制品安全控制中的应用

为避免宿主细胞残留DNA可能带来的致癌性、感染性与免疫原性等危害,有必要在生物制品生产过程中对DNA进行纯化去除与含量测定,保障生物制品的安全性和有效性。该文从残留DNA的危害性分析出发,介绍5种DNA含量测定方法在生物制品安全控制中的应用。

适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法

根据最近文献报道的方法,以基因组测序用典型菌株Corynebacterium glutamicum ATCC13032为宿主,采用E.coli-C.glutamicum穿梭质粒pC2以及可以整合到谷氨酸棒杆菌基因组DNA上的质粒pAK进行电转化条件优化的实验,建立了一种简便的,适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化方法。建立的新方法与原方法相比,细胞预培养时间缩短4h,细胞培养时间缩短1d左右。细胞培养基被简化,不再需要添加进口生化试剂。转化率可达5.5×106cfu／μgDNA,是一种适用于异源DNA高效整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法。

λDNA体外重包装法进行化学诱变的初步研究

λDNA体外重包装技术,是基因工程中的一个重要技术。该方法是先把带有目的基因的外源DNA片段插入到DNA载体上,然后再与发生了突变的特殊噬菌体提供的噬菌体壳蛋白混合。即可在离体条件下装配成有感染活性的噬菌体颗粒,以用于基因组文库的构建和外源基因表达的研究。λDNA体外重包装,要求λDNA长度约在野生型λDNA的75-105％之间。在此范围以外,就不能包装成噬菌体颗粒。另外,λ噬菌体是迄今为止研究得最为详尽的噬菌体,现在已经知道λ噬菌体约有61个基因,其中有一半参与了噬菌体的生命周期活动。

HBV DNA整合与肝癌关系的研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)与人基因组整合在肝细胞癌发生和发展过程中发挥关键作用。目前研究表明,HBV包含编码表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X蛋白的4个开放阅读框(ORF),均可以形成断裂位点整合到人基因组,其整合率从高至低依次是X区、S区、C区和P区。HBV在人染色体上的整合位点并非随机分布,而是存在与肝癌相关的潜在优势整合位点,这些优势整合位点附近的基因常常涉及到细胞生长、增殖、分化和永生化。HBV DNA整合入人基因组后,通过影响整合位点周围基因功能、形成具有致癌作用的HBV截短蛋白以及增加人染色体的不稳定性促使肝细胞的癌变。