耻垢分枝杆菌宿主整合因子(IHF)对DNA拓扑结构的影响

结核分枝杆菌(Mycobaterium tuberculosis)是结核病的病原菌,每年导致数百万人死亡.对于分枝杆菌基本生物学特性的研究有助于新的药物及治疗手段的研发.耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)是分枝杆菌属中的一种非致病菌,与结核分枝杆菌亲缘关系较近,是实验室常用的研究分枝杆菌的模式菌种.分枝杆菌主要编码三种染色质蛋白,类组蛋白HU、Lsr2和宿主整合因子IHF.为研究IHF在染色体包装中的作用,我们在大肠杆菌中表达、纯化了耻垢分枝杆菌IHF蛋白(MsIHF),并对其影响DNA拓扑结构的性质进行了系统分析.体外研究的结果表明,MsIHF以同二聚体的形式存在,其对负超螺旋DNA具有一定的结合偏好性,同时,该蛋白可以有效地固定DNA负超螺旋.进一步的研究表明,MsIHF可以调控拓扑异构酶的活性.MsIHF的结合明显地抑制拓扑异构酶Ⅰ的松弛活性,而与此相反,该蛋白可以轻微地促进旋转酶引入DNA负超螺旋的能力.以上结果提示,MsIHF可能通过调控拓扑异构酶的活性影响染色体DNA的结构,进而调控其包装.

宿主整合因子对伤寒沙门菌动力的影响

目的:探究宿主整合因子(integration host factor,IHF)对伤寒沙门菌动力的影响及其潜在机制。方法:选用IHF两个亚基HimA和HimD的基因缺失株(△himA-pBAD、△himD-pBAD),并构建相应回补株(himA-C、himD-C),进行细菌动力实验,观察himA和himD对伤寒沙门菌动力的影响。通过实时荧光定量PCR比较野生株(WT-pBAD)与△himA-pBAD、野生株与△himD-pBAD中鞭毛相关基因flhD、fliA和fljB等mRNA表达差异,分析IHF对鞭毛基因的调控作用。结果:与WT-pBAD相比,△himA-pBAD和△himD-pBAD动力均明显减弱(P均<0.05),himA-C、himD-C动力则基本一致。与WT-pBAD相比,△himA-pBAD、△himD-pBAD中鞭毛相关基因flhD、fliA和fljB的mRNA表达均显著降低(P<0.01或<0.05)。结论:IHF可能通过正向调节鞭毛相关基因flhD、fliA和fljB等转录,增强伤寒沙门菌的动力。

霍乱弧菌宿主整合因子β亚单位的可溶性克隆表达

目的克隆表达霍乱弧菌全局性调节子宿主整合因子(integration host factor,IHF)β亚单位基因ihfB。方法以C7258染色体为模板,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增ihfB基因,扩增产物经NheⅠ和SapⅠ酶切后克隆入表达载体p XTB1;将ihfB的N端和α亚单位基因ihf A的C端通过搭桥PCR重组,重组片段N-ihfB-C-ihf A经NheⅠ和SapⅠ双酶切后克隆入表达载体p XTB1。重组质粒导入大肠埃希菌ER2566,0.4 mmol/L IPTG诱导表达,超声裂解,上清经CBD柱吸附纯化,二硫苏糖醇(DTT)柱上裂解洗脱。结果成功构建表达野生型ihfB基因和嵌合体N-ihfB-C-ihf A的重组表达质粒p XTB1-ihfB和p XTB1-N-ihfB-C-ihf A,并在宿主菌ER2566中诱导表达。p XTB1-ihfB为不溶性的包涵体表达,p XTB1-N-ihfB-C-ihf A为可溶性表达,并获得高纯度的表达产物。结论克隆表达了IHFβ亚单位基因ihfB,IHF-α的C端可显著提高IHF-β的可溶性,获得可溶性表达的纯化IHF-β嵌合体蛋白,为后续调控功能研究奠定了基础。

大肠杆菌整合宿主因子的表达与纯化

[目的]构建大肠杆菌整合宿主因子两亚基的共表达载体并对其表达纯化条件进行探索。[方法]PCR扩增himA和hip基因,重叠PCR连接起来后利用重组酶连接到表达载体p ET-duet1中,筛选阳性重组子,转化Rosetta(DE3)表达菌,调整诱导时IPTG的浓度及诱导时间,确定最佳诱导条件,最后通过himA基因C端的6×His标签与镍的结合,进行蛋白纯化。[结果]成功扩增himA和hip基因;重组表达载体p ET-duet-himAhip经PCR和DNA测序鉴定构建成功;SDS-PAGE检测到大小约为11. 1 k Da和10. 7 k Da的目的蛋白,IHF的表达成功;37℃,A600=0. 6~0. 8时,在IPTG终浓度分别为0. 2 mmol/L、0. 5 mmol/L条件下诱导2 h、4 h,目的蛋白的表达量没有明显区别。[结论]成功构建IHF两个亚基的共表达载体,在37℃诱导条件下简单快速得到等比例的可溶性IHF-α和IHF-β,为后续研究奠定基础。

侵袭性肺曲霉病49例临床分析

目的通过分析侵袭性肺曲霉病（IPA）病例，提高IPA临床诊治水平。方法回顾性分析49例IPA患者的人口学资料、宿主因素、基础疾病、胸部CT表现、微生物检验、组织病理学检查、治疗和转归。结果49例IPA患者确诊19例（38．8％），临床诊断30例（61．2％）。3例（6．1％）无宿主因素，与IPA相关的宿主因素和基础疾病25例（51．0％），关系不肯定的基础疾病21例（42．9％）。胸部CT表现：结节29例次，斑片影15例次，团块12例次，实变10例次，空洞34例次，晕征19例次，支气管充气征18例次，新月征6例次，双肺影33例次，多发病灶38例次。痰真菌培养阳性率为26．5％（13／49），支气管肺泡灌洗液真菌培养阳性率为66．7％（10／15），曲霉半乳甘露聚糖试验阳性率为30．6％（11／36），肺组织病理检查阳性率为90．5％（19／21）。烟曲霉为主要病原菌81．0％（17／21）。抗真菌药物初始治疗有效率为50％（21／42）。结论IPA患者胸部影像学表现以双肺、多发、结节影、空洞为主，晕征、新月征少见。侵袭性诊断技术具有较好的诊断价值。