植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序中降低宿主污染的方法

植物内生菌能够帮助植物生长,增强其抗逆性与抗病性,研究植物内生菌对了解植物入侵机制、保护生态环境与农业的健康发展具有重要意义。通过阅读相关文献,总结归纳了降低植物内生菌16S rRNA基因扩增子高通量测序(16S-seq)中宿主基因污染的4种方法,即:①寻找特异性错配引物用来扩增细菌16S rRNA基因;②添加特异性阻断物用来抑制宿主16S rRNA基因扩增,如PNA-PCR和LNA-RCR钳位技术;③在文库构建过程中剪切宿主细胞器的16S rRNA基因,如Cas-16S-seq方法;④改变PCR扩增流程,如巢式PCR技术。了解上述各种方法的特点,有助于在植物内生菌16S-seq中选择合适的方法,避免或者减少宿主基因的污染,更准确地进行植物内生细菌群落的研究。

GSS高通量测序在川芎内生细菌群落多样性分析中的应用

目的:宿主线粒体DNA(mtDNA)及叶绿体DNA(cpDNA)污染严重影响植物内生细菌高通量测序分析,该研究旨在探索和评价药用植物内生细菌高通量测序中宿主基因扩增抑制的新策略。方法:以川芎为研究材料,在其内生细菌的16S rDNA聚合酶联式反应(PCR)过程中引入绿盾测序(GSS)技术以屏蔽宿主基因的非靶扩增,对比分析GSS-PCR及常规PCR在内生细菌及根际土壤细菌高通量测试分析中的性能差异。结果:与常规扩增相比,GSS-PCR显著降低了川芎高通量测序中mtDNA及cpDNA扩增,非靶基因占比降幅超过60%;且内生细菌群落多样性指数显著提高,物种注释信息成倍增加,但不影响对优势菌群物种组成信息的提取。对川芎16S rDNA V4区的GSS扩增比对V3-V4区的扩增显示出更低的宿主污染率和更丰富的内生细菌多样性。结论:GSS扩增策略可以显著降低川芎内生细菌的高通量分析中宿主基因污染,在同等测度深度下提高内生细菌多样性分析的准确性,有效改善内生细菌的高通量分析质量,这使得内生细菌的16S rDNA V3-V4区、V4区的高通量测序变得可行,结果更加可靠。该研究所采用的GSS技术为其他药用植物内生细菌的分析提供了方法参考。