生物质谱在生物制品宿主细胞蛋白残留分析中的应用

宿主细胞蛋白(host cell proteins,HCPs)残留影响生物制品的质量和安全,是生物制品生产的关键质控要素。目前,HCPs残留的主要质控方法是酶联免疫吸附试验(ELISA),但该方法的准确性高度依赖于抗体的特异性,且无法获得HCPs的种类及其含量分布信息,需要使用正交方法全面监测。而生物质谱技术无需依赖抗体即可实现HCPs的定性和定量分析,已逐渐成为除ELISA法外的主要分析表征方法,但质谱技术存在缺乏统一的操作流程和验证标准、高丰度药物信号抑制以及高昂的仪器成本等问题。本文总结了质谱法在生物制品HCPs分析中的工作流程及其应用进展,详细阐述了流程中涉及的样品准备、液相色谱分离、质谱数据采集、质谱数据分析和报告的开发原则和关键方法参数,并对未来的研究方向及挑战进行展望。

新孢子虫入侵对宿主细胞炎症反应与应答的调节

犬新孢子虫是一种寄生在动物细胞内的原虫,可引起新孢子虫病。该病临床表现为母牛的繁殖障碍,导致其流产或死胎,严重影响养殖业的正常发展。新孢子虫病广泛分布世界各地,但由于新孢子虫感染与宿主之间相互作用的机制尚未阐明,尚未研制出特效的药物与商品化疫苗。有研究表明,在虫体入侵宿主的过程中,宿主的天然免疫在抵抗新孢子虫感染中的作用不可忽视。论文主要阐述了犬新孢子虫入侵对宿主细胞免疫调节的影响以及虫体分泌的外泌体在新孢子虫入侵过程中的作用,为深入了解犬新孢子虫的致病机制以及新孢子虫病防治提供新的思路。

脂质代谢和糖代谢在PRRSV感染宿主细胞中作用研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染可引起母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道疾病及公猪精液质量下降,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。PRRSV不能自主复制,其生命周期的各个阶段均依赖于宿主的代谢系统。宿主细胞也可调节其代谢过程,以防止PRRSV复制和维持其正常生理功能。脂质代谢和糖代谢在PRRSV感染中均扮演了重要角色,PRRSV作为一种囊膜病毒对脂质代谢系统的依赖性较其他代谢系统更强。脂质参与了PRRSV生命周期的各个阶段,包括吸附、进入、复制、组装和释放,此外还与细胞炎症、免疫和凋亡有关。糖代谢也可干扰PRRSV的生命活动,从而促进或抑制PRRSV复制。文章综述了脂质代谢中脂肪酸、胆固醇、磷脂、脂滴和脂筏以及糖代谢中糖酵解和三羧酸循环在PRRSV感染宿主细胞中的作用,以期为阐明PRRSV的致病机制以及疫苗和抗PRRSV药物的研发提供基本理论依据。

生物制品中宿主细胞残留DNA的检测研究进展

宿主细胞残留DNA是生物制品中最为常见且影响安全性的工艺杂质之一,因其具有潜在的安全风险,国内外监管机构分别要求在成品检定或在适宜的中间产物控制阶段对其进行检测并控制在可接受的限度范围内。通过不同生产阶段产品的监测,验证去除的效果,有助于确认生产工艺的科学性与稳定性。为加深对生物制品宿主细胞残留DNA控制策略的认识与理解,作者结合实际工作及文献调研情况,对生物制品中宿主细胞残留DNA相关研究内容进行梳理,以期为今后相关工作提供参考。

ssRNA病毒侵染宿主细胞与细胞抗病毒作用的研究进展

单链RNA(single-strand RNA,ssRNA)病毒是感染人和动物的主要病原体之一,部分ssRNA病毒感染宿主后会对宿主产生致命的影响,也有部分ssRNA病毒进入宿主后不会引发明显的病变和临床症状。ssRNA病毒与宿主细胞之间的感染与抗病毒所产生的炎症反应、细胞凋亡、细胞溶酶体/自噬应答均是动物机体在ssRNA病毒入侵后产生的一系列抗病毒活动。大量研究解析了ssRNA病毒与宿主细胞之间的相互关系,但仍有许多未知领域阻碍着抗ssRNA病毒研究的前进步伐。基于已公开发表的研究论文,笔者梳理并分析了ssRNA病毒与被侵染细胞之间的相互关系,为后续研究ssRNA病毒与宿主细胞应答反应提供理论支持。

宿主蛋白CD1d通过网格蛋白介导的内吞作用影响ASFV侵入宿主细胞

非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种蜱传的大型双链DNA病毒,该病毒可以感染不同种属、不同生长阶段的猪,引起猪的病毒性出血性疾病,发病率和死亡率均很高。近年来,该病已成为全球养猪业的重大威胁,给许多国家造成了巨大的经济损失,目前尚无商品化的疫苗或药物控制该病。由于ASFV的结构复杂,基因组庞大,编码蛋白众多,因此至少有一半的病毒蛋白功能未知,其介导病毒侵入和复制的分子机制也不清楚,这在一定程度上限制了非洲猪瘟疫苗和抗病毒药物的开发。

金黄色葡萄球菌与宿主细胞相互作用机制的研究进展

金黄色葡萄球菌一直被认为是细胞外病原体,然而,最新研究表明金黄色葡萄球菌能够侵入人体多种细胞并在细胞内存活,与感染复发、扩散和持续性感染有关。金黄色葡萄球菌在宿主细胞内免疫逃避和诱导宿主细胞死亡的分子机制尚未阐明。总结近几年研究发现金黄色葡萄球菌在宿主细胞内免疫逃避、诱导宿主细胞死亡可能与MpsABC系统、宿主细胞Ca+稳态、半胱氨酸蛋白酶诱导宿主细胞死亡等机制有关。

TGEV膜蛋白协同HSC70分子介导病毒入侵宿主细胞

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)属于α-冠状病毒,是引起仔猪腹泻脱水的常见病原之一。因其是现有的猪肠道冠状病毒中受体较为明确的成员,所以是研究冠状病毒入侵机制的理想模型。冠状病毒的纤突蛋白(S)蛋白属于I类病毒糖蛋白,有识别并结合宿主细胞受体的功能,负责病毒粒子的入侵,即吸附和内化过程。冠状病毒膜蛋白(M)是病毒包膜的主要成分,在病毒生命周期中发挥着重要作用。目前对冠状病毒M功能的研究主要聚焦于病毒粒子的组装和出芽阶段,先前有研究表明针对TGEV M的抗体具有一定的中和效果,并利用电镜观察到M的C-末端位于病毒粒子的包膜外表面,这为M参与病毒的入侵过程提供了可能,那么M能否在病毒的入侵过程中发挥作用?以及具体作用机制是什么?

一种切割宿主细胞ATP的免疫策略可以保护细菌和更高级的生物免受病毒感染

据Rousset F 2023年8月17日[Cell,2023,186(17):3619-3631.e13.]报道,以色列魏茨曼科学研究所的研究人员研究发现一种新的蛋白家族,该蛋白家族的成员能够消耗细胞的能量,从而保护细胞免受入侵者的伤害。这一发现是以前未知的免疫机制,且并不仅仅存在于单细胞生物中。

质谱技术在单克隆抗体类药物宿主细胞残留蛋白检测中的应用进展

单克隆抗体类药物是近年来生物制药领域增长率最快的一类生物技术药物,以其靶向性强、治疗效果明显等优势在癌症、自身免疫性疾病等领域应用广泛。宿主细胞残留蛋白(HCP)是其生产中无法去除且易引起免疫原性的一类工艺杂质,HCP含量测定是单抗药物质量控制中重要的一项指标。酶联免疫法(ELISA)是目前HCP检测最常用的方法,可以定量检测HCP的总量,但存在局限性。而质谱法作为一种高精密度高准确性的检测方法,已被应用于单克隆抗体类生物药物生产工艺中HCP的监测,可以与ELISA形成互补,弥补ELISA方法存在的不足,为生产条件优化、纯化效果验证提供了依据。文中将从样品前处理技术、分离技术以及数据采集技术3个方面介绍近年来质谱技术在单克隆抗体类药物HCP研究中的应用与进展,为后续质谱法应用于HCP检测研究提供了参考和指导。

牛病毒性腹泻病毒侵染宿主细胞的电镜观察

用电镜观察了牛病毒性腹泻病毒OregonC2 4 株在侵染新生犊牛睾丸细胞中的形态发生。成熟的病毒颗粒呈直径约为 5 0nm的球形颗粒 ,内含直径约为 30nm的核芯。病毒侵染宿主细胞后 ,在胞质内复制 ,通过糙面内质网膜出芽成熟。病毒可通过侵染细胞外排或在细胞死亡后含有病毒颗粒的空泡破溃而释放到胞外。

Sindbis病毒的繁殖与宿主细胞BHK—21的凋亡

详细报道了Sindbis病毒诱导BHK-21细胞凋亡的过程,病毒感染6h后即可观测到核染色质的断裂,病毒感染12h后染色质可见明显的凝集,感染后24h DNA电泳出现明显的DNA“阶梯”(DNA ladder)。电镜观察更清楚地显示了凋亡小体形成的某些细节:在染色质凝集处核外膜突起,最后与细胞核分离形成凋亡小体。在此基础上将一段病毒非结构蛋白nsP2基因克隆到真核表达载体pMAMneo中,并得到瞬间表达,在其中一些细胞中出现DNA断裂这一细胞凋亡的基本特征,通过对nsP2氨基酸序列的分析,结合以前的实验结果推测nsP2可能与诱导细胞凋亡直接相关。

弓形虫侵入宿主细胞的研究进展

在弓形虫侵入宿主细胞的过程中,弓形虫表面抗原(surface antigen,SAG)、微线体蛋白(micronemes, MIC)、棒状体蛋白(rhoptry protein,ROP)、致密颗粒抗原(dense granules antigen,GRA)及钙离子起着重要的作用,蛋白激酶则对弓形虫侵入宿主细胞过程所必需的蛋白质的正确折叠及加工起作用。本文对此进行了简单综述。

白念珠菌与宿主细胞粘附机制的探讨

白念珠菌是重要的条件致菌病，常继发于大剂量广谱抗生素、皮质激素及免疫抑制剂的广泛应用，可侵犯皮肤、粘膜和内脏。近２０年来白念珠菌感染增长了２０倍以上，已成为医院感染的主要死亡原因之一，危害极大，引起了医学工作者的重视［１］。研究表明白念珠菌与宿主细胞...

蜂胶黄酮对宿主细胞抗病毒能力的影响

本试验旨在研究蜂胶黄酮对宿主细胞抗病毒能力的影响。首先采用MTT法测定蜂胶黄酮对宿主鸡胚成纤维细胞(CEF)和PK-15细胞的安全浓度;然后将蜂胶黄酮从最大安全浓度250μg/mL开始倍比稀释至15.6μg/mL共5个浓度,将蜂胶黄酮分别与新城疫病毒(NDV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)及猪细小病毒(PPV)一起加到相应长成单层的宿主细胞CEF或PK-15中,在感染后24、48和72h分别用MTT法测定宿主细胞的存活率,代表蜂胶黄酮提高宿主细胞抗病毒能力的指标。结果显示,蜂胶黄酮可显著提高宿主细胞抗病毒能力,这种活性与其剂量正相关,即剂量越大作用越好。蜂胶黄酮提高宿主细胞抗有囊膜病毒NDV和TGEV作用主要体现在病毒感染的前期,而提高宿主细胞抗无囊膜病毒IBDV和PPV作用主要体现在病毒感染的后期。提示蜂胶黄酮可用于NDV和TGEV的预防及IBDV和PPV的治疗。

人工感染雏鹅新型病毒性肠炎病毒的形态发生及宿主细胞的超微结构变化

应用超薄切片及电镜观察发现,人工感染雏鹅新型病毒性肠炎病毒(goslingnewtypeviralenteritisvirus,NGVEV)后不同时间宰杀的及发病的雏鹅,其心、肝及小肠上皮细胞的细胞核(质)中均有典型腺病毒粒子。病毒侵害的靶器官主要是小肠粘膜上皮细胞,以上皮细胞微绒毛断裂、脱落开始,进一步发展为上皮细胞核畸形,固缩,核仁消失,核膜模糊和胞核崩解;胞浆严重空化,形成含有很多病毒粒子的"封入体";粗面内质网严重扩张呈囊状,其上的核蛋白体严重脱落;线粒体外膜破裂或嵴断裂及空化,部分受到损害的线粒体充满大量的病毒粒子;形成肠道栓子的外层假膜由大量的病毒粒子、细菌以及坏死的肠上皮细胞组成。肝和心的损害主要发生于感染早期,其粗面内质网和线粒体出现类似于小肠粘膜上皮细胞的变化。病毒在细胞核复制和装配,通过芽生或核膜的破裂而进入胞质,病毒于胞浆中主要是以"封入体"的形式存在,此外还有少量游离病毒。病毒释出细胞外可通过细胞膜芽生或破裂方式,也可通过与核外膜紧密联系的特殊膜性管道将病毒由胞核运至胞外。还讨论了小鹅瘟与雏鹅新型病毒性肠炎在超微结构上的区别。

肠道病毒71型感染前后宿主细胞蛋白质组的二维液相色谱分离和比较

以肠道病毒71型及其宿主细胞为研究主体,建立了一种二维液相色谱分离和分析比较病毒感染前后细胞蛋白表达谱的方法.该方法以高效液相色谱(HPLC)为技术平台,对细胞裂解物先后进行一维色谱聚焦分离和二维反相色谱分离.利用ProteoVue软件将二维色谱数据转换成模拟胶图,再利用DeltaVue软件对感染前后的宿主蛋白表达谱进行比较和分析,找出差异蛋白.二维液相色谱分离法能够根据蛋白的等电点和疏水性建立精确的细胞蛋白表达图谱,每0.2个pH为一个收集区段,在pH8.5～3.9的范围内可见蛋白条带约1 200条.该方法良好的重现性、自动化以及结果分析的简易化,使之在细胞表达谱差异显示中的应用潜力巨大,并且为研究病毒与宿主相互作用提供了新的方法和思路.

东方对虾杆状病毒在宿主细胞内的装配

东方对虾杆状病毒在宿主细胞内的装配张立人，张建红，陈棣华，肖莲春（中国科学院武汉病毒研究所，武汉４３００７１）１９７４年美国Ｃｏｕｃｈ首次在桃红对虾的仔虾体内发现昆虫核型多角体病毒。１９８１年Ｌｉｇｈｔｎｅｒ第一次在斑节对虾体内发现杆状病毒。其后日本...

不同毒力的猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附

为研究不同毒力的猪肺炎支原体对宿主细胞的黏附作用,本研究采用体外培养的猪气管环检测不同毒力的猪肺炎支原体代表菌株对猪气管上皮细胞及纤毛的损伤情况,初步验证不同猪肺炎支原体代表菌株的毒力。应用间接免疫荧光技术研究不同猪肺炎支原体分离株、标准株、168致弱株及疫苗株对猪肾细胞PK15、肺泡上皮细胞SJPL和猪肺泡巨嗜细胞3D4/31的黏附情况。结果表明猪肺炎支原体野毒株XLW-1能引起猪气管上皮细胞严重病变及纤毛损伤、脱落;国际标准弱毒株J株仅能引起猪气管上皮细胞轻微病变;168疫苗株既不能引起猪气管上皮细胞病变,也不能引起纤毛损伤。野毒株XLW-1、国际标准强毒株232株、弱毒株J株及168疫苗株均能黏附PK15、SJPL和3D4/31,168致弱株可以黏附PK15和SJPL。野毒株、标准强毒株、标准弱毒株、168致弱株及疫苗株均能黏附PK15、SJPL和3D4/31。

不同毒力猪肺炎支原体侵入宿主细胞的观察

旨在研究不同毒力猪肺炎支原体对宿主细胞的侵入以及侵入后在宿主细胞内的分布位置。首先用猪肺炎支原体野毒株XLW-1感染PK15细胞不同时间后,间接免疫荧光染色,激光扫描共聚焦显微镜对PK15细胞进行断层扫描,以观察XLW-1能否侵入细胞以及感染时间对XLW-1侵入细胞的影响。然后,在能侵入细胞的基础上,用不同毒力的猪肺炎支原体感染宿主细胞STEC、PK15、SJPL和3D4/21,观察它们对宿主细胞的侵入情况。结果表明,猪肺炎支原体野毒株XLW-1与PK15细胞作用8h时不能侵入PK15,作用10h以上时可以侵入PK15,并且随着作用时间的延长侵入的猪肺炎支原体也在增加。研究还表明猪肺炎支原体野毒株XLW-1、168致弱株和168疫苗株均能侵入STEC、PK15、SJPL和3D4/21。并且,STEC中3个菌株均随机分布在细胞质中;PK15中3个菌株均主要分布在靠近细胞膜和细胞两端狭长的细胞质中;SJPL中XLW-1和168疫苗株主要分布在贴近细胞膜内侧的细胞质中,168致弱株则散布在细胞质中;3D4/21中XLW-1和168致弱株主要分布在贴近细胞膜内侧的细胞质中,168疫苗株则在整个细胞质中分布较多。结果提示不同毒力的猪肺炎支原体均能侵入宿主细胞STEC、PK15、SJPL和3D4/21。