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实时荧光定量PCR检测工程酵母制备重组单克隆抗体原液中的宿主DNA残余
被引量:
1
1
作者
鲁仕豪
石萍萍
+2 位作者
王甜甜
吴军
刘波
《生物技术通讯》
CAS
2019年第5期643-647,共5页
目的:建立实时荧光定量PCR法检测基于新型工程化酵母制备的重组单克隆抗体原液中残留DNA的含量,完善临床前质量控制研究资料。方法:以毕赤酵母工程菌的基因组DNA作为标准品,选择在毕赤酵母中基因拷贝数高的5S rRNA基因作为检测基因,合...
目的:建立实时荧光定量PCR法检测基于新型工程化酵母制备的重组单克隆抗体原液中残留DNA的含量,完善临床前质量控制研究资料。方法:以毕赤酵母工程菌的基因组DNA作为标准品,选择在毕赤酵母中基因拷贝数高的5S rRNA基因作为检测基因,合成特异性引物;通过优化反应体系、加样回收方法,建立实时荧光定量PCR检测糖基工程酵母宿主DNA残余的方法。结果:优化后的实时荧光定量PCR法检测灵敏度达10^-3 pg/μL,标准品DNA浓度为10^3~10^-3 pg/μL时具有很好的线性关系,R2值达0.9984。不同浓度加样实验回收率为80%~120%,重组单克隆抗体原液的DNA残余量测定结果为2.45 ng/剂量。结论:建立了一种基于实时荧光定量PCR检测糖基工程酵母制备的单克隆抗体的宿主DNA残余的方法。该方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,可满足药典对毕赤酵母生物制品宿主DNA残余量的要求。为糖基工程酵母制备的重组单克隆抗体和其他生物制品的质量控制提供了一种普适性方法。
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关键词
糖基工程酵母
实时荧光定量PCR
单克隆抗体
宿主dna残余
重组蛋白
下载PDF
职称材料
诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证
被引量:
1
2
作者
姜英
雷清
+2 位作者
张巧玲
陈继军
杨俊杰
《中国生物制品学杂志》
CAS
CSCD
2020年第12期1426-1430,共5页
目的建立汉逊酵母表达的重组诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法,并进行验证。方法采用磁珠法提取汉逊酵母基因组DNA,获得标准品,建立q PCR标准曲线,并进行专属性、线性、准...
目的建立汉逊酵母表达的重组诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法,并进行验证。方法采用磁珠法提取汉逊酵母基因组DNA,获得标准品,建立q PCR标准曲线,并进行专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证。结果专属性验证结果显示,与对照制剂(注射用水、缓冲液、Vero细胞和CHO细胞培养上清DNA)相比,建立的方法对汉逊酵母DNA具有特异性扩增曲线;线性验证中5次试验标准曲线相关系数(R2)均>0.98;准确度验证试验不同浓度样品的加标回收率在95.12%~105.72%之间,均在70%~130%范围内;重复性和中间精密度验证试验相对标准偏差(RSD)均小于30%;耐用性验证中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的RSD为20.75%,不同蛋白浓度供试品检测结果的RSD为27.11%,均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论建立的方法专属性、线性、准确度、精密度和耐用性均符合要求,可用于检测重组诺如病毒类病毒颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗中残余宿主DNA。
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关键词
残余
宿主
dna
实时荧光定量PCR
重组诺如病毒VLP疫苗
汉逊酵母
原文传递
首批HEK293细胞DNA含量测定国家标准品的制备
3
作者
王光裕
杨靖清
+4 位作者
魏长龙
周泽鑫
杨志行
黄钰
周勇
《中国生物制品学杂志》
CAS
CSCD
2024年第3期316-321,共6页
目的制备HEK293细胞DNA含量测定用国家标准品,以期为行业内HEK293细胞残余DNA的测定提供支持。方法使用Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备HEK293细胞DNA,以其为标准物质原料,采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法进行纯度和...
目的制备HEK293细胞DNA含量测定用国家标准品,以期为行业内HEK293细胞残余DNA的测定提供支持。方法使用Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备HEK293细胞DNA,以其为标准物质原料,采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法进行纯度和含量筛选,随后稀释至浓度约为100 ng/μL后,按160μL/支进行分装。组织5家不同实验室,采用紫外分光光度法进行协作标定,并评价其稳定性和适用性。结果制备的HEK293细胞DNA国家标准品经检测,A260/A280均在1.8~2.0之间,电泳图谱为单一条带,符合规定。该标准品经5家实验室协作标定,共得到78个有效数据,平均含量为104.8 ng/μL,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为4.2%,均数的95%可信区间为103.8~105.8 ng/μL,单次测定的95%参考值范围为96.0~113.6 ng/μL,平均可信限率为1.0%,推荐保存条件为-80℃。采用2个不同型号的荧光定量PCR仪进行适用性研究,该标准品在0.3~3000 pg/反应范围内适用性良好,扩增效率分别为101%和95%,标准曲线R^(2)分别为0.9992和0.9995。结论该批HEK293细胞DNA国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品用于荧光定量PCR检测,含量定为104.8 ng/μL,批号为270039-202301。
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关键词
HEK293细胞
宿主
残余
dna
国家标准品
荧光定量PCR
原文传递
题名
实时荧光定量PCR检测工程酵母制备重组单克隆抗体原液中的宿主DNA残余
被引量:
1
1
作者
鲁仕豪
石萍萍
王甜甜
吴军
刘波
机构
军事医学研究院生物工程研究所
安徽大学物质科学与信息技术研究院
出处
《生物技术通讯》
CAS
2019年第5期643-647,共5页
基金
重大新药创制科技重大专项(2018ZX09101005-013-002)
国家自然科学基金(81773619,81673339)
文摘
目的:建立实时荧光定量PCR法检测基于新型工程化酵母制备的重组单克隆抗体原液中残留DNA的含量,完善临床前质量控制研究资料。方法:以毕赤酵母工程菌的基因组DNA作为标准品,选择在毕赤酵母中基因拷贝数高的5S rRNA基因作为检测基因,合成特异性引物;通过优化反应体系、加样回收方法,建立实时荧光定量PCR检测糖基工程酵母宿主DNA残余的方法。结果:优化后的实时荧光定量PCR法检测灵敏度达10^-3 pg/μL,标准品DNA浓度为10^3~10^-3 pg/μL时具有很好的线性关系,R2值达0.9984。不同浓度加样实验回收率为80%~120%,重组单克隆抗体原液的DNA残余量测定结果为2.45 ng/剂量。结论:建立了一种基于实时荧光定量PCR检测糖基工程酵母制备的单克隆抗体的宿主DNA残余的方法。该方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,可满足药典对毕赤酵母生物制品宿主DNA残余量的要求。为糖基工程酵母制备的重组单克隆抗体和其他生物制品的质量控制提供了一种普适性方法。
关键词
糖基工程酵母
实时荧光定量PCR
单克隆抗体
宿主dna残余
重组蛋白
Keywords
glycoengineered yeast
real-time quantitative PCR
monoclonal antibody
host nucleic acid residue
recombinant protein
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
下载PDF
职称材料
题名
诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证
被引量:
1
2
作者
姜英
雷清
张巧玲
陈继军
杨俊杰
机构
兰州生物制品研究所第四研究室
出处
《中国生物制品学杂志》
CAS
CSCD
2020年第12期1426-1430,共5页
基金
国家科技重大专项(2018ZX09739002-005)。
文摘
目的建立汉逊酵母表达的重组诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)检测方法,并进行验证。方法采用磁珠法提取汉逊酵母基因组DNA,获得标准品,建立q PCR标准曲线,并进行专属性、线性、准确度、精密度和耐用性验证。结果专属性验证结果显示,与对照制剂(注射用水、缓冲液、Vero细胞和CHO细胞培养上清DNA)相比,建立的方法对汉逊酵母DNA具有特异性扩增曲线;线性验证中5次试验标准曲线相关系数(R2)均>0.98;准确度验证试验不同浓度样品的加标回收率在95.12%~105.72%之间,均在70%~130%范围内;重复性和中间精密度验证试验相对标准偏差(RSD)均小于30%;耐用性验证中,Proteinase K不同消化温度下检测结果的RSD为20.75%,不同蛋白浓度供试品检测结果的RSD为27.11%,均符合《中国药典》三部(2015版)要求。结论建立的方法专属性、线性、准确度、精密度和耐用性均符合要求,可用于检测重组诺如病毒类病毒颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗中残余宿主DNA。
关键词
残余
宿主
dna
实时荧光定量PCR
重组诺如病毒VLP疫苗
汉逊酵母
Keywords
Residual host
dna
Real-time fluorescent quantitative PCR(qPCR)
Recombinant norovirus VLP vaccine
Hansenula polymorpha
分类号
R373.1 [医药卫生—病原生物学]
原文传递
题名
首批HEK293细胞DNA含量测定国家标准品的制备
3
作者
王光裕
杨靖清
魏长龙
周泽鑫
杨志行
黄钰
周勇
机构
中国食品药品检定研究院药品监管科学全国重点实验室
广州派真生物技术有限公司
湖州申科生物技术有限公司
武昌首义学院
出处
《中国生物制品学杂志》
CAS
CSCD
2024年第3期316-321,共6页
基金
北京市科技计划(Z2211000079220155)
2022年度国家药品标准制修订研究课题(2022S07)。
文摘
目的制备HEK293细胞DNA含量测定用国家标准品,以期为行业内HEK293细胞残余DNA的测定提供支持。方法使用Genomic-tip 500/G以及基因组DNA纯化试剂制备HEK293细胞DNA,以其为标准物质原料,采用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶电泳法进行纯度和含量筛选,随后稀释至浓度约为100 ng/μL后,按160μL/支进行分装。组织5家不同实验室,采用紫外分光光度法进行协作标定,并评价其稳定性和适用性。结果制备的HEK293细胞DNA国家标准品经检测,A260/A280均在1.8~2.0之间,电泳图谱为单一条带,符合规定。该标准品经5家实验室协作标定,共得到78个有效数据,平均含量为104.8 ng/μL,相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为4.2%,均数的95%可信区间为103.8~105.8 ng/μL,单次测定的95%参考值范围为96.0~113.6 ng/μL,平均可信限率为1.0%,推荐保存条件为-80℃。采用2个不同型号的荧光定量PCR仪进行适用性研究,该标准品在0.3~3000 pg/反应范围内适用性良好,扩增效率分别为101%和95%,标准曲线R^(2)分别为0.9992和0.9995。结论该批HEK293细胞DNA国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品用于荧光定量PCR检测,含量定为104.8 ng/μL,批号为270039-202301。
关键词
HEK293细胞
宿主
残余
dna
国家标准品
荧光定量PCR
Keywords
HEK293 cells
Host residual
dna
National reference standard
Fluorescence quantitative PCR
分类号
R917 [医药卫生—药物分析学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
实时荧光定量PCR检测工程酵母制备重组单克隆抗体原液中的宿主DNA残余
鲁仕豪
石萍萍
王甜甜
吴军
刘波
《生物技术通讯》
CAS
2019
1
下载PDF
职称材料
2
诺如病毒基因工程疫苗中残余宿主DNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及验证
姜英
雷清
张巧玲
陈继军
杨俊杰
《中国生物制品学杂志》
CAS
CSCD
2020
1
原文传递
3
首批HEK293细胞DNA含量测定国家标准品的制备
王光裕
杨靖清
魏长龙
周泽鑫
杨志行
黄钰
周勇
《中国生物制品学杂志》
CAS
CSCD
2024
0
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