寄主诱导的基因沉默提高植物真菌病害抗性研究进展

寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)以病原菌生长发育、产孢繁殖、侵染或致病过程中的关键基因作为靶点,在寄主植物中表达针对靶基因的RNAi构建体,在病原菌侵染植物的过程中,摄入相应的ds RNA或si RNA分子,通过识别、结合特异核苷酸序列,干扰病菌靶基因表达,从而抑制病菌侵染和扩展,使植物表现抗病。这项技术为培育基于病原菌特异序列的植物抗病性奠定了基础,显示了巨大的应用潜力。本文综述了利用HIGS技术提高植物真菌病抗性的最新研究进展,总结了国内外利用这项技术改良植物真菌病害抗性的主要策略、技术路线,展望了发展应用前景。

寄主诱导的基因沉默在增强植物真菌病害抗性方面的研究进展

寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)技术以RNAi技术为基础,可从反向遗传学角度研究基因功能,同时可创制具有持久抗性且稳定遗传的抗病品种,为增强植物抗病性提供了新的视角。本文阐明了HIGS技术的原理,总结了近年来该技术在增强植物真菌病害抗性方面最新的研究进展,分析了HIGS技术的优、缺点,并对HIGS技术的应用前景进行了展望。

寄主诱导的基因沉默技术研究和应用进展

病原真菌严重威胁着农作物的产量和品质,提高作物抗性是病原真菌病害防控的重要措施。寄主诱导的基因沉默(host induced gene silencing,HIGS)技术是在RNA干扰的基础上发展而来,以病原真菌生长发育和侵染过程中的关键基因为靶标,通过在寄主植物中表达这些基因的干扰RNA从而抑制病原真菌中靶标基因的表达,达到抵制病原真菌扩展,提高寄主植物抗病性的目的。近年来,HIGS技术被用于防控多种由病原真菌引起的病害,并取得了明显成效,为植物抗病资源的开发及应用提供了新途径。本文综述了HIGS技术的原理、技术路线、操作方法和国内外的主要研究进展,总结了操作中需要注意的事项,并对该技术的发展趋势和应用前景进行了展望。

尖镰孢5-氧脯氨酸酶基因的鉴定及功能分析

【目的】5-氧脯氨酸酶(5-oxoprolinase,OXP)是γ-谷氨酰循环中6种核心酶之一。鉴定尖镰孢(Fusariumoxysporum)5-氧脯氨酸酶基因,明确其与尖镰孢致病力的关系,为解析尖镰孢致病分子机制以及棉花枯萎病防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法从尖镰孢基因组中鉴定FoOXP,分析其基因结构、编码蛋白的结构域、染色体定位及进化关系。通过基因敲除突变株和回补菌株分析FoOXP2突变后尖镰孢的表型,并检测突变株和野生型菌株对棉花幼苗的致病力差异。利用寄主诱导的基因沉默(host-inducedgenesilencing,HIGS)技术调查转化棉花的病级率及病情指数。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测棉花中真菌生物量和转化FoOXP2干扰片段的棉花茎中FoOXP2的表达量。【结果】在尖镰孢基因组中共鉴定出两个FoOXP(FoOXP1和FoOXP2),其编码序列长度分别为4080和3921 bp,分别编码1359和1306个氨基酸,蛋白质分子量分别为14.90和14.07kDa,理论等电点分别为5.73和5.30。FoOXP1蛋白定位于线粒体,FoOXP2蛋白定位于细胞骨架。FoOXP1位于染色体JH657921,FoOXP2位于染色体JH657938,未形成基因簇,其序列相似性为52.00%。系统发育分析发现,FoOXP1和FoOXP2分属于两个亚群。与野生型菌株相比,FoOXP2敲除突变株产孢量和孢子萌发率显著降低,穿透能力丧失,对刚果红和山梨醇的耐受力有所增强,但对细胞壁胁迫(SDS和CFW)、氧化胁迫(H_(2)O_(2))和渗透胁迫(NaCl和KCl)更敏感。同时,对棉花的致病力显著下降。HIGS结果表明,接菌14和21 d后,FoOXP2基因沉默后的棉花植株发病明显减轻,其病情指数(17.3和40.2)显著低于对照(28.2和77.1),FoOXP2表达量和真菌生物量显著低于对照。【结论】FoOXP2正向调控尖镰孢的致病力,推测其在宿主-病原体互作过程中发挥重要作用。

RHO1基因的HIGS表达载体构建及转基因水稻的抗病性分析

【目的】使用Gateway技术构建稻瘟菌RHO1基因寄主诱导的基因沉默(HIGS)表达载体,将其转化入水稻后,观察稻瘟菌对转基因水稻的致病力。【方法】利用PCR技术从稻瘟菌cDNA扩增RHO1基因,通过Gateway技术构建pBDL03-RHO1载体,电转化进入农杆菌AGL1;以水稻日本晴为材料,通过农杆菌介导的转化方法获得转基因水稻植株,并对其接种稻瘟菌,分析转基因水稻对稻瘟菌抗性。【结果】通过PCR扩增获得了RHO1基因片段,利用BP反应构建了入门载体pDONR 221-RHO1,采用LR反应构建了HIGS表达载体pBDL03-RHO1。通过农杆菌介导的转基因方法将HIGS载体转入了水稻中,并利用mCherry红色荧光观察和PCR扩增验证了转基因植株构建成功。接种试验结果表明,HIGS转基因植株对稻瘟菌的抗性提高。【结论】利用Gateway技术可以简单快速构建HIGS表达载体,表达RHO1的转基因水稻抗病性提高,表明RHO1介导的HIGS在水稻-稻瘟菌互作过程中可以发挥作用。

SEC11基因的HIGS表达载体构建及转基因水稻的抗病性分析

【目的】为克服传统抗病水稻材料抗病性易于丧失的缺点。【方法】利用寄主诱导基因沉默(HIGS)技术创制水稻抗稻瘟菌的新材料。【结果】首先,选取稻瘟菌信号肽复合物中的关键亚基SEC11为靶基因,利用Gateway基因重组技术将稻瘟菌SEC11基因的干扰片段构建到pBDL03载体上获得HIGS表达载体。通过农杆菌介导的转化法,成功将SEC11基因的HIGS载体导入水稻品种日本晴中获得阳性转基因水稻植株。最后,通过水稻叶片喷雾接种试验,证明以稻瘟菌SEC11基因为靶标的HIGS转基因水稻对稻瘟菌具有显著的抗病性。【结论】本研究创制了新的抗稻瘟病水稻材料,将HIGS技术应用于抗稻瘟病分子育种提供了科学依据。

HIGS-SsCCS转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定

【目的】菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默(HIGS)的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因(copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS)为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H2O2的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS(SS1G_00102)全长为1010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27176.96 Da,等电点(PI)为5.04,与灰霉病菌BcCCS(EDN25358)亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS(AT1G12520.1)亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T1及T2代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T2代中获得3个稳定表达的T3代HIGS-CCS转基因拟南芥株系:HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H2O2的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。

大丽轮枝菌木糖苷酶基因的鉴定及基于HIGS技术的功能分析

【目的】从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)中鉴定木糖苷酶基因,研究其与大丽轮枝菌致病力的关系,为解析大丽轮枝菌致病分子机制提供理论依据,同时为制定更好的棉花黄萎病防治策略提供科学依据。【方法】利用生物信息学方法从大丽轮枝菌基因组数据库中鉴定全部木糖苷酶基因,并对基因编码蛋白的结构域、基因的染色体定位及进化关系等进行分析。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品种根系分泌物培养0、6、12、24和48 h大丽轮枝菌中的表达量。利用寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)技术对木糖苷酶基因VdxyL3在大丽轮枝菌侵染过程中的功能进行初步分析。将VdxyL3的目标片段转化棉花,采用伤根法接种大丽轮枝菌Vd991,观察转化植株的表型,调查病情指数,同时利用qRT-PCR技术对植株中真菌生物量和VdxyL3的表达量进行检测。【结果】利用生物信息学方法从大丽轮枝菌中查找出13个木糖苷酶基因(VdxyL1—VdxyL13),其编码序列长度介于1461—2544 bp,蛋白质分子量介于38.78—90.97 kD,理论等电点介于4.67—5.89。结构域和进化树分析发现13个木糖苷酶基因中包括9个糖苷水解酶43家族成员、1个3家族成员和3个31家族成员。染色体定位分析发现13个基因分布在6条染色体上,未形成基因簇。qRT-PCR结果发现选取的6个基因均受到根系分泌物的诱导,在一种或多种根系分泌物中培养6 h或12 h后,表达量均明显升高,然后降低。其中VdxyL3受海岛棉根系分泌物诱导后表达量明显升高,表明该基因的表达明显受海岛棉根系分泌物的诱导。HIGS研究结果表明,接菌14 d和21 d后转化VdxyL3基因干扰片段的棉花发病明显较重,其病情指数(33.3和83.9)明显高于空载体对照(21.7和66.1)。qRT-PCR分析发现转化VdxyL3基因干扰片段的棉花植株茎中VdxyL3的表达量明显低于空载体对照,真菌生物量显著多于对照。【结论】利用HIGS技术将VdxyL3基因沉默后,棉株的抗病性明显降低,表明VdxyL3在大丽轮枝菌致病及宿主-病原体互作过程中可能发挥着重要的作用。

PstVosA1转录因子基因在调控小麦条锈菌耐高温反应中的生物学功能分析

小麦条锈病是典型的冷凉生态区气传真菌病害,病原菌在越夏易变区(即秋季菌源基地)的越夏情况决定了冬季繁殖区条锈菌的初侵染菌源。小麦条锈病的发生流行极易受到温湿度关键气象因子的影响。近年来的调查研究发现,我国小麦条锈菌越夏海拔下限逐年下降,且越夏区范围进一步扩大,说明条锈菌耐高温胁迫能力增强,给未来小麦条锈病流行规律研究及制定防治策略带来了全新挑战。真菌特有的Velvet转录因子家族中VosA基因参与了真菌生长发育和次生代谢的调控,但关于该转录因子在条锈菌耐高温性中的作用却知之甚少。实时荧光定量PCR分析发现,温度敏感菌系蓬9和耐高温菌系A4在侵染寄主过程中PstVosA1基因均受高温胁迫诱导表达,但耐高温菌系PstVosA1相对表达水平明显高于温度敏感菌系蓬9。利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)沉默小麦条锈菌耐高温菌系A4中的PstVosA1基因能显著降低在高温(21℃)接种条件下的平均发病严重度、孢子堆密度和生物量。研究结果说明PstVosA1基因正调控小麦条锈菌耐高温胁迫反应过程,增加该基因的表达水平,有利于增强小麦条锈菌耐高温性。