加味异功散辅助马来酸曲美布汀治疗腹泻型肠易激综合征疗效及对结肠组织酪酪肽和密封蛋白1表达的影响

【目的】研究加味异功散辅助马来酸曲美布汀治疗腹泻型肠易激综合征(IBS-D)的临床疗效及对患者结肠组织中酪酪肽(PYY)和密封蛋白1(claudin-1)的影响。【方法】将160例脾胃虚弱型IBS-D患者随机分为观察组和对照组,每组各80例。对照组给予马来酸曲美布汀治疗,观察组在对照组的基础上联合加味异功散治疗,疗程为2周。观察2组患者治疗前后中医症状积分、血清胃肠激素和T淋巴细胞亚群水平,以及结肠黏膜组织PYY和claudin-1阳性表达率的变化情况,评价2组的中医证候疗效。【结果】(1)治疗2周后,观察组的总有效率为93.75%(75/80),对照组为75.00%(60/80),观察组的中医证候疗效明显优于对照组(P<0.01)。(2)治疗后,2组患者的中医症状总积分均较治疗前下降(P<0.05),且观察组对中医症状总积分的下降作用明显优于对照组(P<0.01)。(3)治疗后,2组患者血清5-羟色胺(5-HT),γ-干扰素(INF-γ)、神经肽Y(NPY)水平均较治疗前明显降低(P<0.05),且观察组对血清5-HT、IFN-γ、NPY水平的降低作用均明显优于对照组(P<0.01)。(4)治疗后,2组患者血清胃动素(MTL)、血管活性肠肽(VIP)水平均较治疗前明显降低(P<0.05),P物质(SP)水平均较治疗前明显升高(P<0.05),且观察组对血清VIP、MTL水平的降低作用和对血清SP水平的升高作用均明显优于对照组(P<0.01)。(5)治疗后,2组患者外周血CD3^(+)和CD4^(+)T淋巴细胞水平均较治疗前升高(P<0.05),CD8^(+)T淋巴细胞水平均较治疗前降低(P<0.05),且观察组对外周血CD3^(+)和CD4^(+)T淋巴细胞水平的升高作用和对CD8^(+)T淋巴细胞水平的降低作用均明显优于对照组(P<0.01)。(6)治疗后,2组患者结肠黏膜组织PYY的阳性表达率均较治疗前降低(P<0.05),而claudin-1的阳性表达率均较治疗前有所升高(P<0.05),且观察组对结肠黏膜组织PYY阳性表达率的降低作用和对claudin-1阳性表达率的升高作用均明显优于对照组(P<0.01)。【结论】加味异功散辅助马来酸曲美布汀治疗脾胃虚弱型IBS-D的疗效显著,能有效缓解患者炎症反应,调节患者胃肠道激素水平,增强患者机体免疫功能,对结肠黏膜PYY和claudin-1水平有良好的调节作用。

幽门螺杆菌感染胃上皮细胞诱导血管生成素样蛋白4表达的机制及其功能研究

目的 探究血管生成素样蛋白4(angiopoietin-like 4,ANGPTL4)在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染的胃上皮细胞中的表达调控及其功能机制。方法 收集2021年11月陆军军医大学第二附属医院消化内科胃镜室H.pylori阳性患者的胃镜标本以及H.pylori感染小鼠的胃组织,利用免疫荧光染色技术检测ANGPTL4在胃组织中的表达部位;用H.pylori感染胃上皮细胞和胃类器官,运用实时荧光定量PCR和Western blot等检测ANGPTL4的表达;探讨H.pylori感染诱导ANGPTL4表达的调控机制;利用ANGPTL4重组蛋白刺激胃上皮细胞,检测其对密封蛋白1 (claudin 1,CLDN1)表达的影响。结果 H.pylori感染能显著诱导胃上皮细胞ANGPTL4表达增加,且具有毒力因子CagA依赖性、细菌浓度依赖性和感染时间依赖性(P<0.05);相对于未感染组和CagA敲除(△cagA)H.pylori感染组,野生型(wild-type, WT)H.pylori感染组的人和小鼠胃类器官ANGPTL4表达显著上调(P<0.05);调控机制方面,阻断信号通路NF-κB可明显抑制胃上皮细胞ANGPTL4表达增加(P<0.05);功能机制方面,ANGPTL4重组蛋白通过激活通路ERK下调胃上皮细胞CLDN1表达(P<0.05)。结论 H.pylori依赖毒力因子CagA通过激活NF-κB信号通路诱导胃上皮细胞表达ANGPTL4;ANGPTL4激活通路ERK下调胃上皮细胞CLDN1表达,从而影响H.pylori感染相关胃部疾病的发展。

痛泻要方对肝郁脾虚型UC大鼠结肠组织Claudin-1、ZO-1及血清COX-2、iNOS表达的影响

目的:探讨痛泻要方对肝郁脾虚型溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)模型大鼠血清中环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、诱导型一氧化氮合酶(induced nitric oxide synthase,iNOS)含量及结肠组织中密封蛋白1(Claudin-1)、紧密连接蛋白1(ZO-1)基因及蛋白表达的影响。方法:100只Wistar大鼠用病-证结合法复建肝郁脾虚型UC模型,按随机数字表法将造模组大鼠分为模型组(10 g/kg蒸馏水灌胃),美沙拉嗪组(0.4 g/kg美沙拉嗪灌胃),痛泻要方高、中、低剂量组(20.8、10.4、5.2 g/kg痛泻要方灌胃),每组20只。另取20只正常大鼠作为空白组(10 g/kg蒸馏水灌胃),各组灌胃体积均为10 mL/kg,连续21 d。药物治疗结束后,取血清及结肠组织,ELISA法检测血清中COX-2、iNOS含量;观察结肠组织大体形态及损伤情况,HE染色观察病理表现,RT-qPCR法检测Claudin-1、ZO-1 mRNA表达,免疫组化法和Western blot法检测Claudin-1、ZO-1平均光密度值及蛋白表达。结果:光镜观察显示,模型组大鼠结肠黏膜充血、水肿,炎性细胞浸润,细胞间紧密连接断裂;经痛泻要方干预后,大鼠结肠黏膜病理变化明显改善,细胞间紧密连接正常。与空白组比较,模型组大鼠血清中COX-2、iNOS含量明显升高(P<0.01);Claudin-1、ZO-1 mRNA、平均光密度值和蛋白表达明显降低(P<0.01)。与模型组比较,美沙拉嗪组COX-2、iNOS含量降低(P<0.01);痛泻要方高、中剂量组COX-2、iNOS含量显著降低(P<0.01),痛泻要方低剂量组COX-2、i NOS含量降低(P<0.05);美沙拉嗪组及痛泻要方高、中剂量组Claudin-1、ZO-1 mRNA平均光密度值及蛋白表达量显著升高(P<0.01);痛泻要方低剂量组Claudin-1、ZO-1 mRNA表达量与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05);痛泻要方低剂量组Claudin-1、ZO-1平均光密度值升高(P<0.05),蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05)。结论:痛泻要方治疗肝郁脾虚型UC的作用可能与上调关键蛋白Claudin-1、ZO-1的表达量及降低炎症细胞因子COX-2、iNOS的含量有关。

claudin 1和E-cadherin蛋白在大肠癌组织中的表达及临床意义

目的探讨密封蛋白1(claudin 1)和上皮钙黏素(E-cadherin)在大肠癌组织中的表达情况及其与大肠癌患者临床特征的关系。方法收集80例大肠癌患者的大肠癌组织标本和癌旁组织标本,采用免疫组织化学染色法检测大肠癌组织和癌旁组织中claudin 1 和E-cadherin 蛋白的表达情况,分析大肠癌组织中claudin 1 和E-cadherin蛋白表达与大肠癌患者临床特征的关系。结果大肠癌组织中claudin 1蛋白的阳性表达率为65.0%(52/80),明显高于癌旁组织的27.5%(22/80),差异有统计学意义(P﹤0.01);大肠癌组织中E-cadherin 蛋白的阳性表达率为42.5%(34/80),明显低于癌旁组织的75.0%(60/80),差异有统计学意义(P﹤0.01)。TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期、低分化、有淋巴结转移、侵及浆膜的大肠癌患者大肠癌组织中claudin 1 蛋白的阳性表达率均高于TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期、中高分化、无淋巴结转移、未侵及浆膜的患者,差异有统计学意义(P﹤0.05)。有淋巴结转移、侵及浆膜的大肠癌患者大肠癌组织中E-cadherin 蛋白的阳性表达率均明显低于无淋巴结转移、未侵及浆膜的患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。结论 claudin 1蛋白在大肠癌组织中高表达,E-cadherin蛋白在大肠癌组织中低表达,并且与大肠癌的发生发展关系密切。

轮状病毒感染致腹泻乳鼠模型粪便中志贺杆菌的分离、鉴定及其对人克隆结肠腺癌细胞中紧密连接蛋白表达的影响

目的:探讨密封蛋白1(Claudin-1)和闭合蛋白(Occludin)在志贺杆菌感染的人克隆结肠腺癌细胞(Caco-2)中的表达情况,阐明志贺杆菌对人克隆结肠腺癌Caco-2细胞的影响及其相关机制。方法:将10窝SPF级昆明系5日龄乳鼠分为对照组乳鼠5窝和实验组乳鼠5窝,对照组乳鼠每天每只灌胃PBS缓冲液100μL,实验组乳鼠每天每只灌胃病毒滴度为1×10^(6) PFU·mL^(-1) SA11株轮状病毒100μL,采集乳鼠粪便标本通过生化实验、血清学检测及16S rRNA测序,进行志贺杆菌的分离和鉴定。将Caco-2细胞分为对照组和志贺杆菌感染组,采用不同浓度梯度的志贺杆菌感染Caco-2细胞不同时间后,台盼蓝染色检测各组细胞存活率,Real-timePCR和Westernblotting法检测各组细胞中Claudin-1和OccludinmRNA及蛋白表达水平。结果:细菌生化鉴定可观察到双糖铁培养基斜面不变色,底部为黄色,且穿刺线明显,疑似致病性肠道菌。该菌对乳糖呈阴性,对葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇呈阳性。16S rRNA测序,与志贺杆菌序列同源性为99%,确定为志贺杆菌。与对照组比较,志贺杆菌感染组志贺杆菌感染4 h内细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05):与1×10^(6) CFU·mL^(-1)志贺杆菌共培养3 h时,Caco-2细胞中Claudin-1和Occludin mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:通过轮状病毒感染致腹泻乳鼠模型粪便中分离的志贺杆菌可降低人克隆Caco-2中Occludin和Claudin-l的表达水平,提高肠上皮细胞的通透性,从而影响肠上皮细胞的正常屏障功能。

肠易激综合征患者炎性细胞因子的表达与酪酪肽、密封蛋白-1的相关性

目的通过检测IBS患者血清和结肠黏膜中炎性细胞因子与酪酪肽、密封蛋白1的表达及其相关性，探讨IBS的发病机制。方法选取2013年4月至2015年4月IBS门诊患者50例和健康对照者20名，采用ELISA法检测其血清酪酪肽、IL-10、TNF-α和密封蛋白-1水平；采用免疫组织化学法检测结肠黏膜中酪酪肽、IL-10、TNF-α和密封蛋白-1的蛋白表达水平。统计学分析采用单因素方差分析、最小显著差异（LSD）法、卡方检验和Pearson相关性分析。结果50例IBS患者中，腹泻型IBS组27例，便秘型IBS组23例。腹泻型IBS组血清酪酪肽水平及其结肠黏膜阳性表达率均高于健康对照组[（16.28±2.75） ng/L比（10.12±1.55） ng/L，66.7%（18/27）比30.0%（6/20）]，差异均有统计学意义（LSD-t＝10.19，χ2＝6.182；P均〈0.05）。腹泻型IBS组血清IL-10水平及其结肠黏膜表达率均低于健康对照组[（2.95±0.24） ng/L比（3.58±0.35） ng/L，22.2%（6/27）比50.0%（10/20）]，差异均有统计学意义（LSD-t＝4.52，χ2＝3.948；P均〈0.05），血清TNF-α水平及其结肠黏膜表达率均高于健康对照组[（8.73±0.41） ng/L比（7.73±0.51） ng/L，66.7%（18/27）比30.0%（6/20）]，差异均有统计学意义（LSD-t＝8.43，χ2＝6.182；P均〈0.05）。便秘型IBS组与健康对照组血清酪酪肽、IL-10、TNF-α水平[（10.24±1.34） ng/L比（10.12±1.55） ng/L，（3.43±0.71） ng/L比（3.58±0.35） ng/L，（7.81±0.26） ng/L比（7.73±0.51） ng/L ]及其结肠黏膜阳性表达率[39.1%（9/23）比30.0%（6/20），56.5%（13/23）比50.0%（10/20），34.8%（8/23）比30.0%（6/20）]比较差异均无统计学意义（P均〉0.05）。腹泻型IBS组血清密封蛋白-1水平及其结肠黏膜表达阳性率均低于健康对照组[（94.44±6.61） ng/L比（103.64±5.47） ng/L，11.1%（3/27）比40.0%（8/20）]，差异均有统计学意义（LSD-t＝5.76，χ2＝5.349；P均〈0.05）；便秘型IBS组血清密封蛋白-1水平及其结肠黏膜表达阳性率均高于健康对照组[（115.54±3.42） ng/L比（103.64±5.47） ng/L，73.9%（17/23）比40.0%（8/20）]，差异均有统计学意义（LSD-t＝5.56，χ2＝5.055；P均〈0.05）。腹泻型IBS组血清IL-10与酪酪肽，以及TNF-α与密封蛋白-1均呈负相关（r＝－0.874、－0.863，P均〈0.05），血清TNF-α与酪酪肽，以及IL-10与密封蛋白-1均呈正相关（r＝0.865、0.876，P均〈0.05）。结论IBS患者可能存在抗炎因子和促炎因子失衡；酪酪肽可能通过促进IL-10和抑制TNF-α水平降低密封蛋白-1的表达，改善IBS患者的低度炎性反应。

高温通过下调密封蛋白-1表达加重局灶性脑缺血再灌注大鼠脑损伤

目的 探讨高温对局灶性脑缺血大鼠密封蛋白-1表达的影响及其在缺血性脑损伤中的机制.方法 健康雄性Sprague-Dawley大鼠100只,随机分为假手术组、常温组和高温组,常温组和高温组再分为缺血（1 h）再灌注3h、6h、24h3个时间点.采用线栓法制作大鼠大脑中动脉闭塞模型.再灌注24 h时,采用干湿重法检测脑含水量,2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色法检测脑梗死体积.再灌注3h、6h和24 h时分别应用蛋白质印迹法和免疫组化染色法检测缺血脑组织密封蛋白-1表达.结果 再灌注24h时,常温组平均神经功能评分显著性低于高温组[（2.3±0.48）分对（3.2±0.63）分；=3.576,P=0.002）],假手术组、常温组和高温组手术侧脑组织含水量分别为（79.31±0.60）％、（81.13 ±0.12）％和（84.4±0.55）％,存在显著性差异（F=147.115,P=0.000）.蛋白质印迹分析显示,再灌注3h、6h和24 h时,常温组和高温组密封蛋白-1表达水平均较假手术组显著性降低（P均=0.000）,而且密封蛋白-1表达水平均随着缺血再灌注时间的延长进行性降低（P均＜0.05）.在相同时间点,高温组密封蛋白-1表达水平均显著性低于常温组（P均＜0.01）.假手术组、常温组再灌注3h和6h以及高温组再灌注3h和6h均可见密封蛋白-1在脑血管内皮细胞间呈阳性表达,而在再灌注24h时均未见密封蛋白-1阳性细胞.与假手术组相比,再灌注3h时,常温组和高温组密封蛋白-1阳性细胞数量和密封蛋白-1 IOD/Area（累计光密度/阳性细胞累计面积）均开始下降,6h时显著性降低,24h时消失（P=0.000）.再灌注3h和6h时,高温组密封蛋白-1 IOD/Area均显著低于常温组（P均＜0.01）.结论 脑缺血再灌注时,高温可能通过下调血脑屏障密封蛋白-1表达加重缺血性脑水肿和脑损伤.

上皮细胞黏附分子增强细胞间紧密连接促进乳腺癌细胞耐药

乳腺癌是致死率很高的恶性肿瘤,由ABCG2(ATP-binding cassette G2)介导的多药耐药(multidrug resistance,MDR)是导致其化疗失败的重要原因,探讨ABCG2介导的耐药机制并探寻其关键分子是当前亟待解决的难题。上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)参与多种肿瘤耐药,且与乳腺癌MDR密切相关,但它在ABCG2介导的乳腺癌耐药中的作用尚未阐明。本研究目的在于探究EpCAM对于ABCG2介导的乳腺癌细胞的多药耐药的调节作用及其机制。CCK8细胞毒性结果证实,相对于人乳腺癌药物敏感株MCF-7,耐药株MCF-7/MX对米托蒽醌(mitoxantrone,MX)的耐药性显著增强;Western印迹结果显示,与MCF-7相比,MCF-7/MX细胞中ABCG2高表达,EpCAM表达上调。siRNA法敲低MCF-7/MX细胞中EpCAM可下调其ABCG2表达,并恢复对MX的敏感性。倒置显微镜观察细胞形态,发现敲低EpCAM可减少MCF-7/MX细胞间连接。免疫荧光双染法观察到EpCAM与密封蛋白1(claudin 1)在MCF-7/MX细胞共定位;进一步Western印迹结果表明,敲低EpCAM减少MCF-7/MX细胞中密封蛋白1表达。综上所述,EpCAM可能通过与密封蛋白1相互作用,增强细胞间紧密连接,促进ABCG2介导的乳腺癌多药耐药。

葛根芩连汤抑制特应性皮炎小鼠模型炎症反应及恢复皮肤屏障功能的实验研究

目的 观察葛根芩连汤对2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene,DNFB)诱导的特应性皮炎(atopic dermatitis,AD)模型小鼠的干预作用及潜在作用机制。方法 24只雄性BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、中药组(葛根芩连汤治疗)和对照组(糠酸莫米松治疗)。DNFB反复刺激皮肤致敏诱导AD小鼠模型。观测各组小鼠皮损评估、皮肤组织病理学、皮肤p H值、经皮水分流失、搔抓行为及血清总免疫球蛋白E (immunoglobulin E,Ig E)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)含量。逆转录—聚合酶链式反应(quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)法测定丝聚合蛋白、密封蛋白1的m RNA的表达;蛋白免疫印迹法(Weston blot,WB)检测丝聚合蛋白、密封蛋白1的蛋白表达水平。结果 (1)治疗前,与正常组相比,模型组背部皮肤有明显的红斑水肿,并可见结痂、鳞屑、皮肤肥厚增生;搔抓次数明显增多,经皮失水及皮肤p H值显著升高;经治疗,与模型组比较,中药组与对照组皮肤损伤情况改善,搔抓次数、经皮失水、皮肤p H值显著降低(P <0.05);(2)治疗前,模型组小鼠血清总Ig E、IL-6、IL-10水平均与正常组有显著差异;经治疗,中药组、对照组总Ig E、IL-6水平与模型组相比含量降低(P <0.05);(3)与正常组比较,模型组q RT-PCR显示丝聚合蛋白、密封蛋白1的表达水平降低;WB显示丝聚合蛋白、密封蛋白1蛋白的含量降低;经治疗,中药组、对照组丝聚合蛋白、密封蛋白1的基因表达水平增高;丝聚合蛋白、密封蛋白1蛋白含量增高(P <0.05);(4)皮肤病理学显示与正常组相比,模型组表皮层存在不完全角化,颗粒层和棘层皮肤增厚,表皮、真皮层均有大量炎细胞浸润;经治疗,中药组及对照组小鼠表皮层角化不全程度较轻,颗粒层、棘层皮肤轻微增厚,炎细胞浸润减轻。结论 葛根芩连汤可以减轻AD模型小鼠皮损程度,减少搔抓次数,有效降低经皮失水、皮肤p H值,下调小鼠血清Ig E、IL-6水平,上调丝聚合蛋白、密封蛋白1的表达,抑制炎症反应和改善皮肤屏障,为中医“皮应大肠”理论和皮肤病从肠论治提供了实验依据。

加味四君子汤对脑缺血大鼠脑组织Occludin,ZO-1,Claudin-1蛋白及其mRNA表达的影响

目的:探讨加味四君子汤对脑缺血大鼠脑组织闭合蛋白(Occludin),密封蛋白-1(Claudin-1),闭锁连接蛋白-1(ZO-1)表达的影响,并探讨相关的作用机制。方法:将60只雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,依达拉奉组(3.2×10-3g·kg-1),加味四君子汤加减低、中、高剂量组(4.77,9.54,19.08 g·kg-1)。采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,治疗7 d后处死,运用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠缺血侧脑皮质区Occludin,ZO-1,Claudin-1蛋白的表达,运用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测大鼠缺血侧脑皮质区Occludin,ZO-1,Claudin-1 mRNA表达。结果:与假手术组比较,模型组Occludin,Claudin-1,ZO-1蛋白显著减少(P<0.01);与模型组比较,依达拉奉组、加味四君子汤各剂量组Occludin,Claudin-1,ZO-1蛋白均显著增高(P<0.01)。与假手术组比较,模型组大鼠Occludin,Claudin-1,ZO-1 mRNA表达下调(P<0.01);与模型组比较,依达拉奉组、加味四君子汤各剂量组大鼠Occludin,Claudin-1,ZO-1 mRNA表达上升(P<0.01)。结论:加味四君子汤可能通过增加紧密连接蛋白Occludin,ZO-1,Claudin-1的表达,保护血脑屏障,减轻缺血性脑卒中大鼠脑水肿。

健脾益气利水方对脑缺血大鼠脑水肿及其脑组织Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达的影响

目的:探讨健脾益气利水方(JPF)对脑缺血大鼠脑水肿及脑组织紧密连接蛋白闭合蛋白(Occludin)、密封蛋白-1(Claudin-1)、闭锁连接蛋白-1(ZO-1)表达的影响。方法:将105只雄性SD大鼠随机分为假手术组,模型组,依达拉奉组,JPF小、中、大剂量组。采用线栓法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,治疗7d后处死,运用伊文思蓝(EB)渗出法检测血脑屏障的通透性,运用免疫组化法检测大鼠缺血侧脑组织Occludin、Claudin-1、ZO-1蛋白表达。结果:与假手术组比较,模型组缺血侧脑组织EB的含量显著增加(P<0.01),Occludin、Claudin-1、ZO-1阳性细胞表达显著降低(P<0.01);与模型组比较,依达拉奉组和JPF中、大剂量组大鼠缺血侧脑组织EB的含量明显降低(P<0.05),各给药组Occludin、Claudin-1、ZO-1阳性细胞表达明显增强(P<0.01,P<0.05)。结论:健脾益气利水法组方可能通过上调紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、ZO-1表达保护血脑屏障,减轻脑缺血再灌注大鼠脑水肿。