流式细胞仪微量全血法与密度梯度离心PBMCs法测定HLA-A2的比较

目的 :探讨流式细胞仪检测外周淋巴细胞HLA -A2分子的简便方法。方法 :健康志愿者新鲜血液 ,分别用全血染色 ,加红细胞裂解液裂解方法与密度梯度离心分离PBMCs后再染色。用FACSCalibur流式细胞仪检测。结果 :两种方法检测结果一致。阳性细胞百分率、荧光强度差异均无显著性P>0 05。结论 :微量全血法能够代替传统的密度梯度离心分离PBMCs方法检测HLA -A2。并且所需样本量小 ,更接近人体生理环境 ,操作简便 。

浮游板优化精液与密度梯度离心结合上游法的比较

目的应用浮游板和密度梯度离心结合上游法优化人类精液,明确优化效果并比较两种方法优化后精子参数的差异。方法收集正常精液样本85例和轻中度少弱精子症精液样本59例,每例样本分为原液组、密梯组和浮游组各1 ml进行后续处理。原液组在精液液化后未做任何处理;密梯组精液液化后用密度梯度离心法结合上游法进行处理,浮游组则在精液液化后应用精子浮游板进行处理。比较原液组、密梯组、浮游组3个亚组间的精子浓度、前向运动精子百分率、正常形态精子百分率;应用流式细胞仪检测精子线粒体膜电位和精子DNA碎片指数,使用单精子活性氧分析仪检测单精子活性氧水平,使用电子显微镜观察精子超微结构并进行组间比较。结果无论是正常精液还是轻中度少弱精子症精液,与原液组比较,密梯组与浮游组的前向运动精子百分率、正常形态精子百分率及精子线粒体膜电位均显著升高(P<0.05),精子DNA碎片指数显著降低(P<0.05);密梯组和浮游组各指标无显著性差异(P>0.05)。正常精液中,浮游组的精子浓度显著高于密梯组(P=0.029),单精子活性氧水平显著低于原液组(P=0.038)。轻中度少弱精子症精液中3亚组间的单精子活性氧水平均无显著性差异(P>0.05)。电子显微镜观察发现正常精液中3个亚组的精子均未见明显异常;轻中度少弱精子症精液中密梯组部分精子可观察到精子细胞膜断裂和线粒体肿胀等异常,而浮游组精子超微结构未见明显异常。结论密度梯度离心结合上游法和浮游板法用于精液的处理和优化,均可有效回收活力、形态和功能更好的精子。精子浮游板法的体外干预小,操作简便,可以获得活性氧更少、损伤更小的精子。

Ficoll密度梯度离心法分离猪外周血单个核细胞条件的探讨

目的探讨猪外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,为寄生虫免疫学研究提供有效的方法。方法使用猪淋巴细胞分离液,在不同离心转速和时间条件下分离猪PBMC,观察所得云雾状PBMC层的厚度,计算细胞得率及细胞活力,以确定猪淋巴细胞分离液分离猪PBMC的最佳实验条件。同时采用文献报道的人淋巴细胞分离液分离猪PBMC的分离条件(1500r/min,30min)分离猪PBMC,比较两者分离PBMC效果。结果使用猪淋巴细胞分离液(密度1.110ng/L),在20～25℃室温下以1500r/min(半径15cm)离心30min,接着低温(4℃)1500r/min离心10min,洗涤2次,这样获得的猪PBMC效果最好。同样条件下,用人的淋巴细胞分离液分离猪PBMC,不仅所得细胞沉淀中混杂细胞如红细胞及其他细胞碎片较多,而且PBMC细胞得率及活力也不好。结论本实验提出了获得大量有活力的猪PBMC的方法和条件。

密度梯度离心法与直接上游法优化处理精液对宫腔内人工授精临床妊娠率的影响

目的:应用密度梯度离心法和直接上游法处理不明原因不孕和轻度精液异常患者的精液,比较两种方法对宫腔内人工授精(IUI)临床妊娠率的影响。方法:回顾性分析2013年1月至2014年12月期间,在我中心进行促排卵+IUI的571个周期患者,统计其精液优化处理方法和临床妊娠率。结果:总体临床妊娠率为密度梯度离心法(17.8%)显著高于直接上游法(11.4%)(P<0.05);不明原因不孕组的临床妊娠率为密度梯度离心法(33.7%)显著高于直接上游法(20.3%)(P<0.05);轻度精液异常组的临床妊娠率为密度梯度离心法(11.6%)显著高于直接上游法(7.6%)(P<0.05)。结论:密度梯度离心法相对直接上游法能有效提高因不明原因不孕和轻度精液异常患者IUI的临床妊娠率。

宫腔内人工授精中应用上游法和密度梯度离心法的系统评价

背景:精子体外优选方法很多,最常见的是上游法和密度梯度离心法。采用何种方法来减少体外处理过程对精子的不良刺激,优选出具有良好受精潜能的精子,目前尚无定论。目的:系统评价上游法和密度梯度离心法在宫腔内人工授精中的应用,比较两种精子优选法的优劣。方法:计算机检索PubMed、Cochrane Library、EMBASE等数据库,手工检索专业相关期刊,检索时间为1966-01/2009-02。纳入关于两种精液优选法在宫腔内人工授精中应用的随机对照试验或半随机对照试验,评价纳入研究的方法学质量,并提取有效数据用RevMan5.0.软件进行Meta分析。结果与结论:纳入6个研究,包括4个随机对照试验和2个半随机对照试验,共486例患者,1099个周期(优选精子的次数)。Meta分析结果显示,上游法与梯度离心法相比,周期妊娠率[OR=1.11,95%CI(0.8,1.55)]、流产率[OR=0.31,95%CI(0.09,1.04)]、精子密度[WMD=-0.89,95%CI(-14.17,12.38)]、精子活力[WMD=-2.31,95%CI(-7.27,2.65)],4项测量指标差异均无显著性意义。尽管与其他精子优选法相比,上游法与梯度离心法的周期妊娠率较高,但是该系统评价结果还不能提示这两种方法在宫腔内人工授精应用中何者临床效果更好。建议今后进行更多高质量的随机双盲对照试验为临床提供最佳证据,并且增加处理前后精子的质量对比,包括精子活力、精子密度以及精子功能等指标测量,以全面考察两种方法的优劣。

密度梯度离心加上游法处理对精子形态学的影响

目的观察男性精液经密度梯度离心加上游法处理前、后精子形态学改变情况,探讨密度梯度离心加上游法对精子形态学的影响。方法选择行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕治疗的93对不孕夫妇,男方精液在经密度梯度离心加上游法处理前、后分别进行精液常规检查,运用Diff-Quick精子形态分析法进行精子形态学分析。结果经密度梯度离心加上游法处理后正常形态精子率显著增加,中段畸形精子率、混合畸形精子率与处理前比较有明显下降(P<0.05)。结论经密度梯度离心加上游法处理可降低中段畸形精子率和混合畸形精子率,显著提高正常形态精子率。

密度梯度离心法加上游法处理精液对精子运动参数及形态学的影响——附102份标本分析

目的:了解密度梯度离心法加上游法处理精液对精子各运动参数和形态学的影响。方法:采用密度梯度离心法加上游法处理102份男性精液标本,应用计算机辅助精液分析系统软件分析精子各项运动参数,并运用改良巴氏染色法观察精子形态。结果:经密度梯度离心法加上游法处理后,精子活动率、活动力、曲线速度、直线速度等运动参数值均明显提高(均为P<0.01)。经该法处理后,畸形精子百分率、精子畸形指数均明显降低(均为P<0.01)。结论:密度梯度离心法加上游法可使精子的运动参数及形态学均得到明显改善,是较好的体外处理精液方法。

小鼠胚胎干细胞密度梯度离心去核法

在细胞松弛素B的参与下,通过Ficoll密度梯度离心法可有效制备小鼠无核ES细胞,在适宜条件下,悬液培养中40%的小鼠ES细胞可发生去核作用,经Hoechst染色和形态观察确定:80%的去核ES细胞在30min内可恢复其原有形态,但其生活力不会超过48h,这为研究ES细胞的胞质功能及核质互作效应提供了一种可行的细胞去核方法。

密度梯度离心和贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞增殖活性和成骨功能比较

目的 通过比较密度梯度离心和贴壁筛选两种方法所获MSCs的增殖活性和成骨功能,探索骨髓MSCs体外分离和纯化较好的方法,为MSCs进一步的试验研究提供依据。方法 应用密度梯度离心和贴壁筛选两种方法分离纯化骨髓MSCs ,并通过MTT法检测其增殖活性。用第三代MSCs进行骨向诱导,以观察两种方法所获MSCs是否有相似的骨向分化能力。结果 密度梯度离心法所获MSCs纯度高,杂质细胞少,增殖活性强,常表现为梭形和小多角形,7到1 0天内便可达到融合。而贴壁法所获MSCs纯度低,红细胞、破骨样细胞等杂质细胞较多,增殖速度相对较慢,且经数次传代仍有较多杂质细胞存在。经骨向诱导后,两种方法所获MSCs表现出相似的ALP活性和矿化结节形成能力。矿化结节数目在两组比较无显著性差异(P >0 .0 5 )。结论 密度梯度离心法是体外分离和纯化骨髓MSCs较好的方法,所获细胞增殖活性高。两种方法所获MSCs具有相似的骨向分化能力。

密度梯度离心联合上皮细胞黏附分子免疫磁珠富集法检测卵巢癌循环肿瘤细胞及其与肿瘤复发转移的相关性

目的检测卵巢癌患者外周血中循环肿瘤细胞(CTCs)与肿瘤复发转移的相关性。方法采集50例卵巢癌患者的外周血,应用密度梯度离心联合上皮细胞黏附分子免疫磁珠富集法检测外周血中的CTCs的数目,并比较其与患者临床特征之间的关系。结果 50例卵巢癌患者中32例为CTCs阳性,CTCs阳性与远处转移(P<0.05)和复发密切相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤部位、TNM分期、肿瘤分化程度及淋巴转移无关(P>0.05)。结论 CTCs可以预测卵巢癌远处转移和复发。

密度梯度离心法联合上游法处理精液对精子功能的影响

目的分析密度梯度离心法联合上游法处理精液对精子功能的影响。方法 200份精液标本作为研究材料,根据材料编号不同随机分为对照组与实验组,各100份。对照组使用密度梯度离心法进行精液处理检测,实验组使用密度梯度离心法联合上游法进行精液处理检测,比较两种检测方法对精子功能的影响。结果实验组样本存活率、活力以及形态均显著优于对照组,精子DNA碎片率明显低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。实验组样本精子DNA碎片指数(DFI)、高可染性精子指数(HDS)水平分别为(22.57±4.46)%、(13.89±2.24)%,均明显优于对照组的(13.21±3.18)%、(8.12±2.59)%,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论密度梯度离心法联合上游法具有较好的精液处理能力,有利于提高精子的存活率,且不会造成精子DNA损伤,在精液处理中发挥出了较好的应用及推广价值。

氯化铯密度梯度离心法提纯枣疯病植原体DNA

本研究利用CTAB法提取感染枣疯病的枣树叶片总DNA,再通过氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心从总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA。利用枣树26S r DNA基因和枣疯病植原体16S r DNA基因的特异引物,分别对富集纯化前后感病枣树叶片总DNA进行PCR扩增。结果表明,模板浓度为1 ng/μL时,富集后的总DNA模板扩增枣树26S r DNA的电泳条带亮度低于富集前,扩增枣疯病植原体16S r DNA电泳条带亮度明显高于富集前。Real-time PCR检测结果表明,模板浓度为1 ng/μL时,纯化后的枣疯病植原体DNA中26S r DNA相对纯化前的量为0.0638,而JWB相对纯化前的量为0.5035,这说明采用氯化铯-双苯酰亚胺密度梯度离心法可以有效地从感染枣疯病枣树总DNA中富集纯化枣疯病植原体DNA。

密度梯度离心联合传代贴壁法分离、培养兔骨髓间充质干细胞

目的探讨密度梯度离心联合传代贴壁法分离、培养兔骨髓间充质干细胞的可行性。方法应用密度梯度离心联合传代贴壁法分离、培养兔骨髓间充质干细胞,观察细胞形态变化,应用免疫荧光法鉴定细胞并计算纯度,应用八肽胆囊收缩素(CCK-8)法绘制细胞生长曲线。结果应用密度梯度离心联合传代贴壁法可以分离、培养兔骨髓间充质干细胞,第3代细胞接种后2~8 d进入细胞增殖对数期,兔骨髓间充质干细胞的纯度可达(81.77±2.10)%,3代细胞纯度组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论应用密度梯度离心联合传代贴壁法可以分离、培养并获取正常活性及理想纯度的兔骨髓间充质干细胞。

密度梯度离心法与直接上游法在宫腔内人工授精中的应用效果分析

目的探讨密度梯度离心法与直接上游法两种方法优化处理精液行宫腔内人工授精对精子动态参数和受孕率的影响。方法对116例患者共254个IUI治疗周期作回顾分析,将254个周期随机分为A、B两组,两组精子的动态参数无显著性差异,A组采用直接上游法,B组采用密度梯度离心法优化处理精液后行宫腔内人工授精,比较两种方法的精子检测结果与妊娠结局。结果两种方法处理前后精子密度、活率、活力(a+b)、畸形率的差异均有显著性(P<0.05);两种方法处理后精子密度的差异有显著性(P<0.05);密度梯度离心法高于直接上游法,但活率、活力、畸形率的差异无显著性(P>0.05),两组间的临床妊娠率及流产率的差异也无显著性(P>0.05)。结论两种方法处理精液均可改善精子动态参数,但行宫腔内人工授精得到的临床妊娠率差异无显著性(P>0.05)。

贴壁法和密度梯度离心法分离经血源性子宫内膜间充质干细胞的比较研究

目的：比较贴壁法和密度梯度离心法对经血源性子宫内膜间充质干细胞（MB-MSCs）的分离效果。方法：选择25～35岁月经周期正常的健康女性的月经血，分别采用贴壁法和密度梯度离心法分离MB-MSCs并进行传代。镜下观察原代细胞形态变化；对比原代及第2、3代细胞传代时间；流式细胞仪检测表面标志物；阿尔辛兰染色检测其成软骨能力。结果：贴壁法分离的原代细胞呈聚集样生长，密度梯度离心法分离的原代细胞6 d后也呈聚集样生长。贴壁法分离原代细胞的传代时间（14.58±1.31）d明显快于密度梯度离心法（19.17±1.34）d，差异有显著意义（P〈0.05）；第2、3代细胞的传代时间两种分离方法差异无统计学意义（P〉0.05）。经流式细胞仪检测，两种方法分离的MB-MSCs阳性表面标志物CD44、CD29、CD105、CD73含量和阴性表面标志物CD31、CD45含量比较差异无统计学意义（P〉0.05），两种方法分离的第3代细胞经成软骨诱导后比较无显著差别。结论：采用贴壁法与密度梯度离心法分离MB-MSCs效果相似，但贴壁法更适用于早期快速获得纯度较高的细胞。

全骨髓贴壁法与密度梯度离心法培养小鼠内皮祖细胞的方法比较

目的:比较全骨髓贴壁法与密度梯度离心法分离培养小鼠内皮祖细胞(EPCs)的差异。方法:取8周龄雄性近交系昆明小鼠,提取原代EPCs,分别采用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法分离培养细胞,观察细胞形态、细胞摄取DiI-acLDL、结合FITC-UEA-I双阳性率及细胞生长增殖情况。结果:全骨髓贴壁法培养第4天,可见较多贴壁细胞,呈圆形、短梭形,部分为长梭形;第6~8天贴壁细胞多为梭形及类圆形;随着培养时间的延长,梭形细胞数量渐渐增多,可出现细胞集落,10d后EPCs大量增殖,14d细胞长满培养瓶底部。密度梯度离心法接种24h后可见圆形贴壁细胞,并逐渐增多变形;培养至第4~7天,可以观察到贴壁细胞明显增多且体积变大,细胞为类圆形、梭形或多边形,第7~9天,细胞呈集落生长,多数细胞呈多边形或长梭型;培养至第2周可见贴壁细胞生长呈"铺路石"样外观。全骨髓贴壁法细胞摄取DiI-acLDL和结合FITC-UEA-I双阳性率高于密度梯度离心法(P<0.05),但两种方法细胞增殖率比较无明显差异(P>0.05)。结论:全骨髓贴壁法与密度梯度离心法均可培养出EPCs,且两种方法培养的细胞增殖活性相当,但前者更简单易行,EPCs培养成功率更高。

密度梯度离心法联合上游法制备精子除菌效率观察

目的对密度梯度离心法联合上游法制备精子的除菌效率进行评价。方法选择2013年12月—2014年1月在解放军202医院全军计划生育优生优育技术研究所进行辅助生殖技术治疗的男性志愿者100例,将精液培养无细菌感染者设为对照组(n=50),有细菌感染者设为实验组(n=50)。采用密度梯度离心法联合上游法进行精子制备,应用精液常规分析、细菌培养方法进行评估。结果实验组与精液原液比较,经密度梯度离心后精液上清液与沉淀物中细菌生长率比较均显著下降(P<0.05),经上游后精液上清液与沉淀物中细菌生长率下降更为明显(P<0.01),上清液培养无细菌生长。100份精液标本精子制备后前向运动与非前向运动精子之和百分比与制备前比较显著上升(P<0.05);实验组前向运动与非前向运动精子之和百分比与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论采用密度梯度离心法联合上游法制备精子隔离细菌效果好,精子活动力显著提高。

密度梯度法与羟乙基淀粉法培养脐血间充质干细胞比较

目的比较密度梯度离心法与羟乙基淀粉法体外分离培养脐血间充质细胞(hUCB-MSCs)的成功率,为今后细胞移植和基因治疗提供重要的细胞来源。方法取44份足月儿顺产或剖宫产脐带血,分为两组,每组22份,分别用密度梯度离心法结合贴壁法与羟乙基淀粉法分离脐血中单个核细胞,专用培养基培养,观察两种方法培养所得细胞的形态变化并绘制生长曲线,用流式细胞术鉴定细胞表面标志物CD14,CD29,CD44,CD45,CD105的表达。结果羟乙基淀粉法培养hUCB-MSCs的成功率(36.36%)高于密度梯度离心法结合贴壁法的培养成功率(9.1%)(P<0.05)。两种方法所得细胞在形态、生长曲线和表面标志物CD14,CD29,CD44,CD45,CD105的表达无明显差异(P>0.05)。结论羟乙基淀粉法可以提高hUCB-MSCs培养成功率,为hUCB-MSCs在临床中应用奠定基础。

聚丙烯酰胺梯度凝胶法测定低密度脂蛋白颗粒直径方法的建立

目的建立具有良好敏感性、重复性的聚丙烯酰胺梯度凝胶法(PAGE),以测定低密度脂蛋白(LDL)颗粒的大小。方法灌注3%～16%的聚丙烯酰胺梯度凝胶,分离LDL颗粒,并与经典的密度梯度超速离心法(DUC)进行比较。对于凝胶法进行板内和板间重复性的测定。随后分别观察-30℃和-70℃下保存24周的血清对采用凝胶法分离LDL颗粒的影响。结果与DUC法相比,PAGE法的敏感度为70%,特异度为100%。凝胶分离LDL亚组分的平均板内差异为0.44%,平均板间差异为2.05%。-30℃和-70℃分别保存2、4、8、16和24周对血清LDL颗粒直径无明显影响。结论本研究建立的3%～16%的PAGE法具有较好的敏感性和重复性,具有临床和科研使用的可行性。