密斑刺鲀(Diodon hystrix)gnrh基因的克隆及表达分析

密斑鲀刺(Diodon hystrix)不仅具有食用价值,同时也是传统的中药及保健食品,但目前关于密斑刺鲀的生殖内分泌调控研究较少,限制鲀了密斑刺的人工繁育基础理论的发展。总所周知,促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)是生殖内分泌调控的关键因子之一。利用转录组分析及分子克隆技术,获得密斑刺鲀促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)gnrh2和gnrh3基因的cDNA开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列,并利用生物信息学的方法,获鲀得密斑刺gnrh2 cDNA开放阅读框共279 bp,可编码92个氨基酸残基;密斑鲀刺gnrh3 cDNA开放阅读框共270 bp,可编码89个氨基酸残基。通过系统进化分析表明,密斑鲀刺GnRH与鲀科类的鱼具有较近的亲缘关系。通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)半定量的方法检测gnrh2和gnrh3基因在密斑刺鲀各组织中的分布,结果发现gnrh2和gnrh3基因在脾、鳃和垂体中的表达量较高,而在心脏中的表达量最低。此外,利用鲀实时荧光定量的方法检测了密斑刺gnrh2和gnrh3基因在性腺发育不同时期的表达模式,结果显鲀示密斑刺gnrh2基因在不同的性腺发育时期中没有显著性的变化,而gnrh3基因随着性腺发育成熟而不断升高。研究主要获得两个创新性的重要结果:首鲀先是证实了密斑刺存在两种gnrh基因(gnrh2和gnrh3),其次是提示了gnrh3基因可能是鲀密斑刺生殖调控的主要gnrh类型。研究结果可为深鲀入研究密斑刺生殖内分泌调控机理提供研究方向和基础。

雄性密斑刺鲀与雌性六斑刺鲀人工杂交繁育技术研究

密斑刺鲀(Diodon hystrix)与六斑刺鲀(D.holocanthus)是2种极具养殖开发潜力的经济鱼类,广泛分布于中国东南沿海。通过对刺鲀亲鱼培育、性腺催熟、授精孵化及苗种培育等系列技术的摸索,以期建立2种刺鲀人工杂交技术体系。针对亲鱼培育,通过人工调配强化饵料,试验组性腺指数均优于对照组,有效促进了性腺发育;在性腺催熟方面,采用注射适量绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素LRH-A2的方式,使亲本的性腺同步率达到(76.5±2.4)%,显著优于对照组;在授精孵化方面,通过人工授精方式和适宜的孵化条件,促使受精率达到(76.8±1.9)%,孵化率达到(83.6±2.8)%,显著优于对照组;在苗种培育阶段,通过调整仔稚鱼不同发育阶段的适口饵料,经过60 d培育,培育出全长(5.78±0.69)cm幼鱼。研究结果可为进一步挖掘具有优良性状刺鲀杂交品种的开发提供技术支撑,并对促进中国水产养殖品种向多元化发展,改善渔业产业结构具有重要的现实意义。

密斑刺鲀鱼皮胶原蛋白对UVB诱导小鼠皮肤急性光损伤的保护作用

初步探究密斑刺鲀鱼皮胶原蛋白(Diodon hystrix skin collagen,DHSC)对紫外线B(ultraviolet B,UVB)诱导的小鼠皮肤急性光损伤的保护作用。将Balb/c小鼠分为正常组(CTL)、模型组(MOD)、DHSC低剂量组(L)、DHSC中剂量组(M)、DHSC高剂量组(H)、基质对照组(B)、阳性对照组(Y),以UVB诱导法建立小鼠皮肤急性光损伤模型。实验结束后观察DHSC对小鼠背部皮肤的作用情况并进行双盲法红斑评分,HE染色后观察DHSC对皮肤组织病理的影响,Masson染色后观察组织中胶原蛋白的结构,并通过比色法检测组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活力及丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量。结果表明,密斑刺鲀鱼皮胶原蛋白可以有效减轻UVB辐射引起的小鼠皮肤外观形态、组织结构及胶原蛋白组织的改变,通过抑制抗氧化酶活性降低和减少脂质过氧化物堆积,表现出对小鼠皮肤急性光损伤的保护作用。

密斑刺鲀(Diodon hystrix)fshβ和lhβ基因的克隆及表达分析

密斑刺鲀(Diodon hystrix)是南海名特优鱼类,同时具备食用和中药保健价值,但目前关于密斑刺鲀生殖生理的研究较少,影响了该鱼繁育理论研究的发展。众所周知,促性腺激素(Gonadotropic hormone,GtH)是生殖调控的关键激素之一,在生殖调控轴中发挥着承上启下的作用。利用转录组分析及分子克隆技术从密斑刺鲀中克隆并鉴定出fshβ和lhβ基因的cDNA序列,通过生物信息学分析,发现密斑刺鲀fshβcDNA开放阅读框共363 bp,编码120个氨基酸;lhβcDNA开放阅读框共420 bp,编码139个氨基酸。通过序列比对和系统进化树分析,表明密斑刺鲀Fshβ和Lhβ均与鲀科类的鱼的亲缘关系较近。利用三级结构分析,发现Fshβ的三级结构相对保守,而Lhβ的三级结构差异较大。利用实时荧光定量的方法检测了密斑刺鲀fshβ和lhβ基因的组织分布情况,结果表明密斑刺鲀fshβ和lhβ在垂体的表达量最高,其次是性腺。此外,进一步检测了fshβ和lhβ基因在雌雄性腺发育过程中的表达模式,发现垂体中fshβ基因伴随性腺的发育,表达量逐渐下降,而lhβ基因的表达量呈逐渐增加模式。研究结果将为构建密斑刺鲀生殖调控网络提供研究基础。

基于RNA-seq数据的密斑刺鲀SSR分子标记开发及鉴定

以密斑刺鲀(Diodon hystrix)为研究对象,利用RNA-seq技术进行转录组测序及序列组装,最终获得221762条Unigene序列,N50为2240 nt,GC含量为46.20%。利用MISA软件从该转录组数据中搜索到106221个符合条件的SSR位点,分布于62451条Unigene中,发生频率为28.16%。优势重复单元为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,发生频率分别为48.99%、32.57%和14.72%,其中单核苷酸重复单元中以A/T为主,占总SSR位点数的46.21%,二和三核苷酸重复单元分别以AC/GT和AGG/CCT为主,占比分别为21.90%和2.70%。选取SSR长度大于等于20 bp的位点设计了17563个位点的引物,随机挑选160对位点引物进行扩增鉴定,筛选到95对有效扩增引物,占比为59.38%。通过多态性验证,最终获得30对稳定、可重复的多态性引物(占有效扩增引物的31.58%),其中15对引物表现出高多态性(PIC>0.5),这些高多态性引物具有评估密斑刺鲀群体多样性的潜力。结果表明,密斑刺鲀转录组数据可作为开发稳定的SSR标记的有效来源,该实验所开发的多态性SSR位点为进一步研究密斑刺鲀的遗传图谱和遗传多样性奠定了基础。

密斑刺鲀胶原蛋白的提取和成分分析

以密斑刺鲀( Diodon hystrix )为研究对象,采用酸法和酶法从其分别提取酸溶性胶原蛋白(Acid-Soluble Collagen ,ASC)和酶溶性胶原蛋白(Pepsin-Soluble Collagens,PSC),并比较2种胶原蛋白的提取率.通过全自动氨基酸分析仪、SDS-PAGE凝胶电泳、紫外可见分光光度计和傅立叶红外光谱法比较研究这2种胶原蛋白的氨基酸含量、蛋白质分子质量和结构.结果表明:(1)通过酸法提取得到的胶原蛋白的提取率远远低于胃蛋白酶法所得到的胶原蛋白提取率;(2)酸法和酶法提取的ASC和PSC的纯度高,且具有明显的β链,α1链和α2链,为典型的Ⅰ型胶原蛋白特征;(3) ASC和PSC含有甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬氨酸,其中甘氨酸(分别为27.125%和27.371%)和丙氨酸(分别为13.523%和11.031%)含量较高;ASC的总氨基酸含量较PSC的总氨基酸含量高;(4)ASC,PSC的紫外最大吸收峰均在230 nm处,但ASC比PSC的蛋白肽链更有序整齐.

密斑刺鲀igf2基因的克隆及表达分析

胰岛素样生长因子2(insuline-like growth factors 2,IGF2)在控制脊椎动物的生长、发育、繁殖、代谢和渗透调节等方面发挥着关键作用。本研究利用分子克隆技术分离并鉴定了密斑刺鲀(Diodon hystrix)igf2基因cDNA序列738 bp,其中开放阅读框全长645 bp,可编码214个氨基酸残基。多重序列比对分析发现,密斑刺鲀IGF2氨基酸序列与其他鱼类的IGF2具有较高的同源性,显示出序列进化的保守性。组织分布结果表明,igf2基因在肝脏和脑组织中表达量较高,而在肾脏以及精巢中没有检测到表达信号,表明igf2基因具有显著的组织表达特异性。本研究结果为深入研究密斑刺鲀的igf2基因在生长发育中的调控机理提供研究基础。