硅酸钾与密旋链霉菌Act12菌剂配施对连作草莓生长、果实产量及品质的影响

为了探索硅酸钾与生防放线菌配合施用对草莓连作障碍的修复效果,以"红太后"草莓为材料,采用日光温室栽培,研究了硅酸钾与密旋链霉菌Act12菌剂配施对连作草莓生长、果实产量及品质的影响。结果表明:(1)硅酸钾与密旋链霉菌Act12菌剂配施对日光温室连作草莓具有明显的防病促生作用,可使连作3年草莓1级苗比例提高44.7%,3级苗比例下降58.3%,连作4年草莓死亡率降至0%;连作3年草莓植株总鲜重、根鲜重、叶片数及叶片鲜重分别增加73.7%、71.3%、11.1%及38.7%。(2)硅酸钾与密旋链霉菌Act12菌剂配施对草莓开花、果实产量及品质有明显影响,可使连作3年草莓开花提前10 d,花蕾数提高17.0%,果实数、单果鲜重及单株产量分别增加18.6%、90.6%及126.2%,盛果期草莓果实可溶性固形物含量、糖酸比及维生素C含量分别提高21.7%、36.2%及27.0%;可显著提高连作4年草莓单果鲜重和单株产量(P<0.05),增幅分别为194.7%和359.1%。(3)硅酸钾与密旋链霉菌Act12菌剂配施可提高草莓的诱导抗性,草莓叶片可溶性蛋白含量和盛果期PPO酶活性分别提高67.4%和101.0%。由此可知,硅酸钾与密旋链霉菌Act12菌剂配施可显著促进连作草莓生长,提高果实产量及品质,增强植株抗病性,可有效缓解日光温室草莓连作障碍,在生产上具有较好应用潜力。

密旋链霉菌Act12中调控因子AdpA-s和LuxR-2306对寡霉素合成的影响

为揭示密旋链霉菌Act12(Streptomycespactum)中全局调控因子AdpA-s和途径特异调控因子LuxR-2306对寡霉素合成的影响,构建了AdpA-s和LuxR-2306的阻断突变株和高表达菌株,采用滤纸片法检验了发酵液对苹果腐烂菌(Valsamali)的抑生活性,利用高效液相色谱法(HPLC)分析了寡霉素的产量,通过定量PCR分析AdpA-s、LuxR-2306转录水平与寡霉素合成之间的关系.结果表明:高表达突变株AdpA-s HE和LuxR-2306 HE对苹果腐烂菌的抑生能力显著增强;而基因阻断突变株Spa LuxR-2306不再对苹果腐烂菌的生长具有抑制效果.AdpA-s HE和LuxR-2306 HE发酵液中寡霉素产量分别提高了1.8和1.9倍;Spa LuxR-2306中完全检测不到寡霉素的存在.实时定量PCR结果表明,LuxR-2306的转录水平与寡霉素生物合成核心酶的转录水平呈显著正相关.AdpA-s高表达突变株中LuxR-2306的转录水平也得到了显著提高.以上结果表明:LuxR-2306为寡霉素生物合成的途径特异性正调控因子,可以通过正调控寡霉素生物合成基因簇中核心酶的转录,进而促进寡霉素的合成.而全局性调控因子AdpA-s可能通过对LuxR-2306的转录调控,间接影响寡霉素的生物合成,后续实验将对此展开进一步的深入研究.此研究为后续对生防菌Act12中次级代谢的调控研究提供了一定的理论基础.

密旋链霉菌Act12遗传转化系统的建立与优化

密旋链霉菌(Streptomyces pactum)Act12是分离自黄土高原的1株多效放线菌,具有良好的生防应用价值,为了深入研究与利用,需建立该菌株的高效遗传转化系统。本试验以整合型质粒pSET152为出发质粒,大肠杆菌S17-1为供体,Act12的孢子为受体时,在改良2CMY培养基上进行接合转移,孢子预萌发条件为50℃热激10min,阿普霉素质量浓度为10.0mg/L,覆盖时间为18h,转化效率达到2.079×10^(-5)。以抗阿普霉素基因为目的基因,通过PCR验证,成功地将质粒pSET152转入到Act12中。同时,利用该转化系统,成功敲出Act12基因组中一可能的负调控转录因子spa0520,并获得了次级代谢图谱明显变化的缺失突变株Δspa0520。所构建的Act12遗传转化系统,为后续对其生防活性机理的研究以及深入开发利用奠定了基础。另外,通过培养基的改良发现,Act12在氮源含有NO-3时产孢丰富,为后续研究提供了思路。

密旋链霉菌对瓜列当寄生的影响及对加工番茄的增产作用

[目的]探索施用密旋链霉菌对瓜列当寄生的影响和对加工番茄的增产作用。[方法]通过盆栽试验和大田示范试验,设置番茄育苗和移栽时施密旋链霉菌制剂(处理(1))、番茄育苗时施密旋链霉菌制剂(处理(2))、不施密旋链霉菌制剂(对照),研究密旋链霉菌对瓜列当寄生的影响及对加工番茄的增产作用。[结果]盆栽试验中,处理(1)番茄地瓜列当寄生量较对照减少66.7%,番茄产量增加72.4%;大田示范试验中,处理(1)瓜列当寄生量较对照减少10.2%,番茄产量增加12.4%。[结论]密旋链霉菌制剂能减少瓜列当寄生量,促进番茄增产。

BldM对密旋链霉菌Act12形态发育及抗生素合成的调控

【目的】以多效生防菌株——密旋链霉菌(Streptomyces pactum)Act12为研究材料,探究转录因子BldM对生防链霉菌Act12形态发育及抗生素合成的调控作用。【方法】通过基因工程手段构建bldM基因缺失突变株△bldM及过表达突变株OE-bldM,利用扫描电镜观察、抑菌实验、高效液相色谱检测和实时荧光定量PCR探究缺失突变株△bldM及过表达突变株OE-bldM与野生型(wild)Act12在形态发育、生长速率、寡霉素产量及抗病原菌能力等方面的差异。【结果】经测序验证bldM基因缺失突变体△bldM及过表达突变体OE-bldM均构建成功,其中△bldM寡霉素D产量明显降低且无法形成气生菌丝,而过表达突变株OE-bldM的气生菌丝更加密集,产孢更为丰富。与野生型菌株相比,OE-bldM的寡霉素D产量增加了23%,编码寡霉素核心合成酶基因的转录水平上调了2-3倍,抑菌活性显著增强。【结论】全局性转录调控因子BldM不但能影响Act12气生菌丝及孢子形成,并且参与正调控Act12寡霉素的合成,本研究结果为转录因子BldM的调控功能进行了新的挖掘和补充,并为后续深入研究密旋链霉菌Act12的生长代谢途径和调控机制提供了参考。

密旋链霉菌Act12发酵液对石油胁迫下紫花苜蓿幼苗生长及生理特性的影响

[目的]考察密旋链霉菌Act12发酵液对石油胁迫下紫花苜蓿幼苗生长及生理特性的影响,探讨其缓解石油胁迫的作用机制。[方法]以‘中苜3号’紫花苜蓿为供试植物,采用盆栽试验,考察质量分数3%(W/W)石油胁迫和不同浓度(0、1%、10%和100%)Act12发酵液处理下紫花苜蓿幼苗生长、根系构型、光合特性、渗透调节物质含量和抗氧化能力等指标的变化。[结果]相较于对照组(CK),3%石油胁迫显著抑制了幼苗的光合作用和生物量,同时增加了丙二醛(MDA)的积累,降低了可溶性糖和可溶性蛋白含量,改变了超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性。中低浓度(1%和10%)的发酵液处理可以有效缓解石油胁迫对紫花苜蓿幼苗的毒害,并以10%的Act12发酵液效果最佳;与不施用Act12发酵液处理相比,10%Act12发酵液处理幼苗的株高、地上部干质量、地下部干质量、茎耐受指数、根耐受指数、总根长、根表面积、根体积和根尖数均显著增加,地上部分和地下部分MDA含量分别降低了42.49%和56.45%,可溶性糖含量分别增加了79.25%和89.83%,可溶性蛋白含量分别增加了167.63%和256.15%,根系SOD和POD活性分别提升了35.81%和57.33%。[结论]中低浓度密旋链霉菌Act12发酵液能有效增强石油胁迫下紫花苜蓿幼苗的抗氧化酶活性和渗透调节能力,降低MDA含量,提高光合作用能力,增加生物量,有效缓解石油胁迫对幼苗生长的抑制。

角蛋白酶基因gm2886在密旋链霉菌ACT12中的表达及鉴定

通过生物信息学分析,在本实验室分离得到的1株羽毛高效降解菌微白黄链霉菌Fea-10基因组中发现基因gm2886(GenBank Accession Number:KY368946)可能编码一新的角蛋白酶,通过在该基因5'端和3'端分别连接红霉素抗性基因启动子(PermE)和组氨酸标签编码序列并构建在大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSET152上,接合转入密旋链霉菌Streptomyces pactum ACT12,从而实现了异源表达,蛋白纯化后对其酶学性质进行了研究。实验结果表明,带有组氨酸标签编码序列的gm2886在密旋链霉菌ACT12中可以表达分泌得到1个大小约为36 kDa的蛋白。多种底物检测表明异源表达得到的重组蛋白GM2886-His6具有蛋白酶活性,可以降解水不溶性的天青角蛋白和羽毛粉;其最适温度和pH分别为50℃和pH 10.0。PMSF可抑制GM2886-His6的酶活,而EDTA不能,说明该酶为丝氨酸蛋白酶。本研究为从分子水平上解析羽毛高效降解菌Fea-10的活性机理,从而进一步开发其应用潜力提供了基础,同时可为该类蛋白酶的研究提供借鉴。

生防菌密旋链霉菌Act12中SPA7074缺失突变株的构建及其次级代谢产物鉴定

【目的】通过基因工程手段构建生防菌Act12转录调控因子SPA7074缺失突变株,并挖掘其中活性次级代谢产物资源和探讨其活性机理。【方法】利用同源重组方法敲除Act12基因组中可能的Tet R家族转录调控因子编码基因spa7074(accession number:KU955325),平板实验检测缺失突变株发酵液抑菌活性的变化,并通过HPLC比较代谢图谱,然后通过质谱及核磁共振对差异峰对应化合物进行结构鉴定。【结果】SPA7074缺失突变株对几种病原真菌的拮抗活性显著增强,比较代谢图谱表明出现数个差异峰,将最显著差异峰所对应化合物进行分离纯化鉴定,结果为寡霉素D。【结论】本研究通过基因工程手段敲除生防菌株Act12中的负转录调控转录因子,使得突变菌株抑菌活性显著增强,并获得了产量达野生型菌株7倍的寡霉素D高产菌株Δspa7074。

活性氧在密旋链霉菌Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累中的作用

作者前期研究成果显示密旋链霉菌Act12可以上调丹参酮生物合成途径上的关键酶基因的表达大幅提高丹参毛状根中丹参酮含量。该实验则进一步研究了活性氧在Act12诱导丹参毛状根中丹参酮积累的作用。在继代培养21 d的丹参毛状根中添加Act12不同的诱导子及诱导子组合,分别测定不同收获期毛状根的生物量,毛状根中活性氧积累量,丹参酮类成分的积累量和关键酶基因表达量。Act12诱导后丹参毛状根中活性氧含量上升,HMGR和DXR基因表达上调,最高分别达到对照的32.4,4.8倍,毛状根中丹参酮积累增加,最高达到对照的10.2倍;加入活性氧抑制剂CAT和SOD后,丹参毛状根中的活性氧含量较Act12处理显著下降,HMGR和DXR基因表达也明显下降,毛状根中丹参酮含量较Act12处理下降了74.6%。活性氧介导了Act12诱导丹参酮积累,Act12很可能是通过ROS信号通路激活了MVA和MEP途径,从而提高了丹参酮在毛状根中的含量。

多功能放线菌Act12对土传病原真菌的拮抗性及其鉴定

采用琼脂块法及抑菌试验,研究了多功能放线菌Act12对6种常见土传病原真菌的拮抗作用;采用形态特征、生理生化特性及16 S rDNA序列分析,确定了Act12的分类地位。结果表明,Act12对6种供试土传病原真菌具有不同程度的拮抗作用,其中,对木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)和尖孢镰刀菌西瓜专化型(F.ox-ysporum f.sp.niveum)的拮抗圈直径分别达到20.5 mm和18.4 mm;培养48 h,Act12无菌发酵滤液对木贼镰刀菌的抑菌率达到83.2%。菌株显微形态、培养特征、生理生化特性及16 S rDNA序列分析结果表明,多功能放线菌Act12为链霉菌属的密旋链霉菌(Streptomyces pactum)。

番茄溃疡病生防菌YH23的发酵条件优化及菌种鉴定

海洋是当前放线菌资源的重要来源,由于其独特的生态环境造就了代谢系统多样的放线菌,随着研究的深入,有望获得具有不同抑菌活性的有益菌株。从大连黄海海域海底沉积物样品中分离得到1株放线菌YH23,为进一步开发其在生物防治中的应用潜力,采用牛津杯法检测其发酵液对番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的抑菌活性,并采用单因素试验与正交设计方法筛选出该菌株的最优发酵配方和发酵条件,同时通过形态观察、生理生化反应及16S rDNA序列分析初步确定了该菌株的分类地位。结果表明:YH23发酵液对番茄溃疡病菌(Cmm)具有抑制活性;其优化后的发酵培养基组分为黄豆粉10g,地瓜粉10g,氯化钠2g,碳酸钙1g,去离子水1L;优化后的发酵条件为初始pH值6.0,发酵温度25℃,发酵时间5d,接种量8%,装液量75mL/250mL,转速为150r·min^-1,优化后发酵液的最佳抑菌圈直径较初始发酵液增大47.2%;该菌株16S rDNA序列与密旋链霉菌(Streptomyces pactum NBRC 13433T)相似度为99.58%,聚类分析显示二者亲缘关系最近,结合形态特征及生理生化特性最终确定该菌株YH23为密旋链霉菌(Streptomyces pactum)。

放线菌制剂对人参生长及根域土壤微生物区系的影响

以小兴安岭地区人参为研究对象,探索放线菌制剂对人参的促生效应及对人参根区、根表土壤微生物区系的影响.结果表明:经放线菌制剂Streptomyces pactum(Act12)处理后,人参药用部分产量增加,品质改善;叶片诱导酶活性提高,根系活力增强;土壤中细菌、放线菌的数量和比例显著增加,真菌的数量和比例减少.与对照相比,土壤微生物区系结构改变:优势菌荧光假单胞菌、韩国假单胞菌和氧化微杆菌在根区、根表土壤中的数量大幅提高;病原真菌烟色织孢霉在根区土壤中减少,在根表土壤中消失.表明施用放线菌制剂Act12能够改善土壤微生物区系,提高人参植株的抗性和根系活力,增加产量并改善品质.