利用PCR对PVX外壳蛋白基因进行同义密码子修饰

利用聚合酶链式反应 (PolymeraseChainReaction ,PCR)与限制性内切酶相结合的方法 ,设计 4条含有限制性酶切位点和相应突变的引物。以马铃薯X病毒 (PotatoVirusX ,PVX)外壳蛋白cp基因为模板 ,扩增出相应的片段 ,相应酶切后通过三片段连接构建到克隆载体pBlueKS(+/ - )上。随机挑选重组子测序表明 ,利用三片段拼接成功地在PVX外壳蛋白基因的不同部位产生了突变。实验结果说明利用三片段接可以大大提高筛选得到突变子的效率 ,从而节省人力、物力和时间。

密码子修饰增强乳头瘤病毒晚期蛋白表达的研究

目的观察密码子修饰对乳头瘤病毒衣壳蛋白基因表达的影响。方法以密码子改变影响乳头瘤病毒晚期蛋白的表达为依据，以人类常用密码子替代野生型密码子构建HPV6b L1(HLl)、HPV6b E7 N-端(HL1E7I)、HPV6b E7 C-端(HL1E7 Ⅱ)和BPV1 L2 （HBL2)质粒，转染真核细胞系，以免疫荧光、免疫印记、电镜、流式细胞分析、ELISA观察相应蛋白表达情况。结果上述质粒在真核细胞均有HpVL1、蛋白的高度表达；HLlE7I表达的L1蛋白定位于细胞质而HL1E7Ⅱ表达的L1蛋白定位于细胞核；密码子修饰后的6HL1和HL1E7基因能有效表达HPV6bL1样的假病毒颗粒。结论HPV6 E7蛋白的羧基端有核定位信号存在，密码子修饰能增加基因的表达效率，可用于目的基因的表达。

cp基因的修饰引起转基因的沉默及其介导的PVX抗性

将马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)外壳蛋白(coat protein,CP)基因(cp)编码序列中植物偏爱密码子替换成稀有同义密码子,并将此修饰的外壳蛋白基因(cpm)及未修饰外壳蛋白基因(cp)分别置于CaMV 35S启动子后,构建植物表达载体,并用农杆菌介导转化烟草。Northern杂交及Run on实验结果表明,转cpm基因烟草比转cp基因烟草发生转录后基因沉默(PTGS)的频率明显增高(从6.25％增至35％),并且对人工接种的PVX病毒抗性显著提高。以上结果表明,基因中密码子的替换可以明显提高转基因植株的病毒抗性。