富亮氨酸重复激酶2抑制剂作为新型帕金森病治疗剂的研究进展

帕金森病(PD)是以多巴胺能神经系统退行性病变为特征的多因素疾病。对其进行分型研究,发展针对PD发病机制的治疗药物是提高PD治疗效果的必由之路。富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因突变是部分家族遗传性PD和散发性PD的直接原因。LRRK2基因突变会导致LRRK2活性增加,进而导致神经退行性病变。因此,发展LRRK2抑制剂调控LRRK2活性有望成为新的PD治疗方法。LRRK2既是激酶,也是小GTP酶,存在2个药物作用位点,因此,目前LRRK2抑制剂有2类,一类是LRRK2激酶位点抑制剂,另一类是LRRK2 GTP结合位点抑制剂。本文综述了LRRK2及其抑制剂的研究进展。

EGCG对富亮氨酸重复激酶2活性的影响及其作用机制

目的:研究表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)对富亮氨酸重复激酶2(leucine rich repeat kinase 2,LRRK2)活性的影响及其分子机制。方法:选用Ddc-LRRK2-G2019S品系果蝇,分为7组,对照组用标准玉米培养基饲养,各实验组果蝇分别用含LRRK2抑制剂GW5074、N-乙酰半胱氨酸(NAC)及浓度为0.1、1、10和100μmol/L的EGCG加药培养基饲养,检测并统计果蝇生命周期和运动能力,筛选出药物作用的最佳浓度与最适时间点;用蛋白质印迹法检测果蝇脑组织中p-LRRK2、p-p38 MAPK、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、p-ERK1/2和酪氨酸羟化酶(TH)等蛋白的表达。结果:与对照组相比,10μmol/L EGCG延长果蝇寿命、改善果蝇运动能力的效果最为突出,1μmol/L EGCG效果较好(P<0.05);各组果蝇第5周时行为学变化最显著(均P<0.05);与对照组相比,10μmol/L和1μmol/L EGCG组Nrf2、p-ERK1/2、TH表达均明显增加(均P<0.05),p-LRRK2、p-p38 MAPK表达明显降低(P<0.05)。结论:EGCG可能通过Keap1-Nrf2-ARE、MAPK等信号通路有效抑制LRRK2激酶活性。

LRRK2基因G2019S突变帕金森病相关基因的生物信息学分析

目的从分子水平揭示富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因G2019S突变帕金森病的发病机制,为临床诊断及治疗提供新思路。方法在公共基因芯片数据库(GEO)中下载LRRK2基因G2019S突变帕金森病的相关基因芯片数据(GSE22491),其中LRRK2(G2019S)突变帕金森病样本10例,正常控制组样本8例,利用Qlucore Omics Explorer(QOE)3.0软件、DAVID、STRING等在线分析软件对LRRK2基因G2019S突变帕金森病差异基因进行生物信息学分析。结果 QOE3.0分析筛选出1752个LRRK2基因G2019S突变帕金森病差异基因,其中上调191个,下调1561个。对其进行生物信息学分析发现,SKP2、RBX1、SKP1、CUL1、CUL4A等基因以及核糖体信号通路、氧化磷酸化信号通路、蛋白酶体信号通路、白细胞跨内皮迁移信号通路、磷酸戊糖途径信号通路、枸橼酸信号通路、Fcγ受体(FcγR)介导的吞噬通路等在LRRK2基因G2019S突变帕金森病的发生发展中可能起着重要作用。结论通过生物信息学分析LRRK2基因G2019S突变帕金森病相关基因芯片数据,提示LRRK2基因G2019S突变帕金森病发病是多种基因、多种分子机制相互作用的结果,对相关分子机制的进一步分析有利于揭示LRRK2基因G2019S突变帕金森病的发病机制。

LRRK2干扰对MPP+诱导PD细胞模型线粒体功能的影响

目的探讨富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)干扰对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病(PD)细胞模型线粒体功能及CaMKK-β/AMPK通路的影响。方法采用MPP+诱导传代培养的SH-SY5Y细胞构建PD细胞模型。将造模的SH-SY5Y细胞随机分PD模型组、空载转染组(空载转染PD模型细胞)和siRNA转染组(siRNA-LRRK2转染PD模型),另设正常对照组,每组设3个复孔。采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测各组细胞LRRK2 mRNA表达,采用免疫印迹(WB)法检测各组细胞LRRK2蛋白表达,采用JC-1探针法检测各组细胞线粒体膜电位,采用试剂盒检测各组细胞线粒体复合物I(Complex I)活性及ATP含量,采用WB检测各组细胞中CaMKK-β/AMPK通路相关蛋白CaMKK-β、AMPK和p-AMPK蛋白表达。结果与正常对照组相比,PD模型组LRRK2蛋白表达增加(P<0.05),线粒体膜电位下降,Complex I活性及ATP含量降低(P<0.05),CaMKK-β/AMPK通路蛋白CaMKK-β、AMPK、p-AMPKα(Thr 172)蛋白表达增加(P<0.05)。与PD模型组比较,siRNA转染组LRRK2 mRNA及蛋白表达水平降低(P<0.05),线粒体膜电位提升,Complex I活性及ATP含量增加(P<0.05),CaMKK-β、AMPK和p-AMPK蛋白表达降低(P<0.05)。结论LRRK2干扰可改善MPP+诱导的PD细胞模型中受损的线粒体功能,抑制CaMKK-β/AMPK信号通路。

槲皮素对LRRK2突变转基因PD模型果蝇的治疗作用

目的研究槲皮素对富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2,LRRK2)基因突变所致帕金森病(Parkinson s disease,PD)模型果蝇的作用及其机制。方法杂交获得的PD转基因模型果蝇Ddc-Gal4;UAS-LRRK2/G2019S能在多巴胺神经元表达G2019S突变LRRK2,使用浓度为1、10、100μmol/L的槲皮素加药标准玉米培养基饲养,PD模型组和空白对照组使用不加药培养基,观察槲皮素对PD模型果蝇寿命和运动能力的生物学效应;取果蝇脑进行TH免疫荧光染色观察多巴胺神经元存活情况;取果蝇脑组织行蛋白免疫印迹检测TH、GCLC、p-LRRK2、p-p38MAPK等蛋白的表达。结果与对照组相比,10μmol/L的槲皮素对果蝇寿命及改善果蝇运动能力效果最佳,果蝇在第6周时运动能力出现显著改变,PD模型果蝇脑内多巴胺神经元的丢失明显得到保护。和未用药对照组果蝇相比,槲皮素降低了PD转基因模型果蝇的磷酸化LRRK2的水平(P<0.05),显示了抑制PD模型果蝇LRRK2激酶活性的作用。此外,槲皮素还可以活化抗氧化信号通路和抑制p38MAPK信号通路。结论槲皮素能通过活化抗氧化信号通路和抑制LRRK2激酶活性,进一步调节MAPK信号转导通路,起到降低LRRK2突变在PD转基因模型果蝇的神经毒性,保护脑内多巴胺神经元的作用。

α-synuclein蛋白及LRRK2在帕金森患者血清中的表达及临床研究

目的研究α-突触核蛋白(α-synuclein)、富亮氨酸重复激酶2(leucine-rich repetitive kinase2,LRRK2)在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)患者血清中的表达及临床价值研究。方法选取2016年1月-2018年12月皖南医学院弋矶山医院收治的PD患者90例,根据是否腔隙梗死将患者分为腔梗患者25例,无腔梗患者65例;根据空腹外周血高同型半胱氨酸(hyperhomocysteine,Hhcy)将患者分为:Hhcy血症患者29例,正常Hcy患者61例;按Hoehn-Yahr(H-Y)分级修正量表将患者分为:PD1-2级36例、PD2.5-3级34例、PD4-5级20例。另外选取同期在本院进行健康体检的健康老人90例。对比两组研究对象的一般资料、LRRK2、α-synuclein表达水平,并对PD患者各个亚组进行比较,分析LRRK2、α-synuclein表达水平和PD患者严重程度的关系,采用Pearson分析LRRK2、α-synuclein之间的相关性。结果健康对照组、PD两组研究对象性别、年龄、体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05);PD组的LRRK2、α-synuclein表达水平均高于健康对照组,与无合并高血压患者相比,合并高血压患者LRRK2、α-synuclein水平较高(P<0.05)。与无腔隙梗死患者相比,合并腔隙梗死患者LRRK2、α-synuclein水平较高,差异有统计学意义(P<0.05)。与无Hhcy血症患者相比,Hhcy血症患者LRRK2、α-synuclein水平较高(P<0.05)。与12级相比,2.53级、4-5级LRRK2、α-synuclein表达水平升高(P<0.05);与2.5-3级相比,4-5级LRRK2、α-synuclein表达水平升高(P<0.05)。LRRK2、α-synuclein之间均呈正相关(r=0.246,P=0.019)。结论LRRK2、α-synuclein在PD患者血清高表达,且与患者严重程度有关,为临床PD的诊断提供参考。

eQTL结合ASE分析显示帕金森病相关基因Lrrk2表达受顺式作用调控

富亮氨酸重复激酶2(Lrrk2)基因与家族性及散发性帕金森病(Parkinson's disease,PD)密切相关,但其作用机制仍不十分清楚.本文以单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)为切入点,对其调控机制进行研究.以近交系C57BL/6J(B6)和DBA/2J(D2)小鼠杂交1代小鼠为实验动物,借助基因表达数量性状基因座(expression quantitative trait loci,eQTL)分析技术,结合等位基因特异性表达(allele specific expression difference,ASE)技术,验证帕金森病相关基因Lrrk2的顺式调控机制.eQTL分析显示,Lrrk2基因所在的位置有1个具有显著统计学意义(LRS值≥20)的顺式调节基因座.针对Lrrk2基因外显子区域错意突变SNP的ASE分析得出:rs50098646位点在cDNA水平上G∶A两碱基比值偏离1∶1,与gDNA水平中G∶A两碱基比值差异显著(P<0.01),表达受顺式作用调节.本研究结果表明,Lrrk2基因的表达受到顺式作用的调控.

Lrrk2缺失损害内质网蛋白输出的机制研究

目的 探讨帕金森病相关蛋白Lrrk2对内质网蛋白输出功能的调节作用及相关机制。方法 利用Lrrk2基因敲除小鼠(Lrrk2^-/-小鼠)及野生型小鼠(Lrrk2^+/+小鼠)获取成纤维细胞和皮质神经元,应用免疫荧光染色法检测Lrrk2缺失对内质网出口位点(ERES)形态以及对N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-asparticacidreceptor,NMDAR)亚基NR2A输出至胞膜的过程的影响。结果 Lrrk2缺失导致成纤维细胞中ERES直径增大,与内质网至高尔基体蛋白运输抑制剂BrefeldinA(BFA)处理效果类似;Lrrk2缺失抑制了河豚毒素(TTX)所诱导的NR2A蛋白输出至胞膜过程。结论 Lrrk2缺失导致内质网至高尔基体蛋白输出功能障碍,而这种异常会抑制神经元活性依赖的NMDA受体蛋白输出至胞膜的过程。

LRRK2调节纹状体神经元多巴胺受体2含量及机制研究

目的探讨LRRK2的表达或功能异常对纹状体神经元多巴胺受体D2R含量的影响,以及LRRK2调节纹状体神经元多巴胺受体D2R含量的机制。方法利用组织免疫荧光染色法检测LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S基因敲入小鼠和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中D2R含量的改变;并利用Cathepsin D免疫荧光标记溶酶体,检测LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变对蛋白降解的影响。结果LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体中D2R荧光强度均显著下降;LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中溶酶体数目和大小均显著增加,与Cathepsin D共定位的D2R显著增加。而LRRK2基因敲除小鼠纹状体神经元中溶酶体数目和大小与野生型相比差异无统计学意义。结论LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变导致纹状体D2R的含量下降;LRRK2G2019S和R1441C突变提高小鼠纹状体神经元降解,促使D2R降解加强,从而使得纹状体神经元内D2R含量下降。

LRRK2调节纹状体神经元多巴胺受体1含量及机制

目的探讨帕金森病相关蛋白LRRK2对纹状体神经元中多巴胺受体D1R含量的影响以及相关机制。方法利用组织免疫荧光染色法检测LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S突变基因敲入小鼠和R1441C突变基因敲入小鼠纹状体神经元中D1R含量的改变。并利用cathepsin D免疫荧光标记溶酶体,检测LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变对蛋白降解的影响。结果 LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体中D1R荧光强度均显著下降。LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中溶酶体数目均显著增加,LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元中溶酶体大小增加,LRRK2基因敲除小鼠、LRRK2 G2019S和R1441C基因敲入小鼠纹状体神经元内与溶酶体共定位的D1R显著增加。结论 LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变导致纹状体D1R的含量下降。LRRK2基因敲除、LRRK2 G2019S和R1441C突变提高小鼠纹状体神经元蛋白降解水平,D1R降解加强,从而使得纹状体神经元内D1R含量下降。

LRRK2调控ERES支架蛋白Sec16A分布的研究

目的探讨LRRK2和内质网出口位点(ERES)支架蛋白Sec16A之间的相互作用,以及LRRK2对细胞中Sec16A分布的影响。方法利用Lrrk2基因敲除小鼠(Lrrk2^-/-小鼠)及野生型小鼠(Lrrk2^+/+小鼠),应用免疫共沉淀实验和蔗糖梯度离心实验检测LRRK2和Sec16A之间的相互作用,应用免疫染色实验观察LRRK2表达缺失对细胞中Sec16A的分布的影响。结果免疫共沉淀实验显示Lrrk2^+/+小鼠脑皮质中内源性的LRRK2和Sec16A存在相互作用;蔗糖梯度离心实验显示LRRK2和Sec16A存在于相同组分中;免疫荧光染色结果显示小鼠原代成纤维细胞中LRRK2缺失导致Sec16A异常弥散分布。结论LRRK2和Sec16A存在相互作用,二者之间的相互作用可能促进Sec16A锚定于ERES。

LRRK2/NF-κB信号对BCG诱导巨噬细胞RAW264.7炎症应答的调控

目的:探讨富亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)在巨噬细胞抗结核分枝杆菌感染中的作用机制。方法:用结核分枝杆菌疫苗株卡介苗(BCG)感染巨噬细胞RAW264.7,菌落形成单位(CFU)计数检测结核分枝杆菌生存率;酶联免疫吸附法测定白细胞介素(IL)-1β、IL-6和干扰素γ(IFN-γ)表达水平;q PCR和Western blot法分别检测相关m RNA和蛋白的表达。结果:BCG感染的巨噬细胞RAW264.7中LRRK2的m RNA和蛋白表达均显著上调,并刺激RAW264.7细胞释放大量细胞因子。此外,沉默LRRK2明显抑制BCG感染巨噬细胞的分枝杆菌存活率;同时,沉默LRRK2降低BCG刺激诱导分泌的促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ。更为重要的是,LRRK2可能通过正调控NF-κB通路调节BCG诱导的炎症应答进程。结论:LRRK2/NF-κB信号正调控BCG刺激诱导的巨噬细胞炎症应答进程。本研究结果为结核病在基因水平上的诊断和治疗提供了实验依据。

LRRK2的功能及其在神经变性疾病中的作用机制

目的富亮氨酸重复序列激酶2(LRRK2)是由PARK8基因编码的一种大分子蛋白,具有多个酶活性和蛋白结合域,这预示着其复杂的细胞功能。LRRK2基因突变呈常染色体显性遗传,突变所导致的病理变化多种多样。有研究表明,LRRK2突变可能引起晚发型帕金森病(PD)、痴呆、克罗恩病、麻风病及癌症等。近年来的遗传学研究表明,LRRK2突变在PD、阿尔茨海默病(AD)等神经变性疾病的病理生理中具有重要作用。本文将对LRRK2的结构、功能、表达调控及LRRK2突变在PD、AD等神经变性疾病中的作用和临床应用前景进行综述。

VPS35WT逆转LRRK2G2019S所致的非神经细胞的tau蛋白过度磷酸化及相关功能缺陷

目的探究逆膜复合体亚基VPS35对富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)G2019S所导致的tau蛋白功能缺陷的影响。方法采用HeLa细胞转染过表达LRRK2G2019S质粒(LRRK2G2019S组)、囊泡分选蛋白35(VPS35)WT质粒(VPS35WT组)、共转染VPS35WT+LRRK2G2019S(VPS35WT+LRRK2G2019S共转染组)和空载对照组(对照组)。采用Western blot法和免疫荧光组化法检测HeLa细胞内tau蛋白磷酸化水平、细胞骨架形态及在低剂量毒物作用下细胞死亡率的变化。结果VPS35WT+LRRK2G2019S共转染可以进一步逆转过表达LRRK2G2019S的HeLa细胞的tau蛋白磷酸化,稳定细胞骨架,提高细胞对毒物的抵抗力,降低细胞的死亡率(均P<0.01)。结论VPS35WT可以逆转LRRK2G2019S所致的HeLa细胞相关功能障碍。

LRRK2G2019S位点突变通过抑制自噬相关蛋白诱发驱铁处理后小胶质细胞的活化

目的探讨LRRK2G2019S位点突变对驱铁处理后小胶质细胞活化的影响及其机制。方法(1)利用人类诱导多能干细胞(IPSC)经造血祖细胞(HPC)分化产生小胶质细胞,免疫荧光染色进行鉴定,利用蛋白纯化技术获取α-突触核蛋白(α-syn)A53T突变蛋白。(2)将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+甲磺酸去铁胺(DFO)组,分别加入磷酸盐缓冲液(PBS)、1μmol/L纯化的α-syn A53T突变蛋白、1μmol/L纯化的α-syn A53T突变蛋白+30 mmol/L DFO作用24 h。采用比色法检测细胞Fe2+浓度,Western blotting实验检测细胞Rab35蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)水平,实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转化生长因子β(TGF-β)mRNA的表达。将3组小胶质细胞培养上清液(MCS)转移到SH-SY5Y细胞中,采用流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞的凋亡情况。(3)双向DNA测序检测1μmol/L纯化的α-syn A53T突变蛋白处理后小胶质细胞富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因的突变。将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+GSK3357679A组,分别加入对应的药物处理24 h(LRRK2抑制剂GSK3357679A浓度为10 nmol/L),采用Western blotting实验检测细胞LRRK2蛋白的表达。将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+GSK3357679A、α-syn+GSK3357679A+DFO组,分别加入对应的药物处理24 h后采用Western blotting实验检测细胞Rab35蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞内ROS水平,RT-PCR检测细胞IL-6、TNF-a、TGF-βmRNA的表达。(4)将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+雷帕霉素(RAPA)组,分别加入对应的药物处理24 h(自噬诱导剂RAPA的浓度为50 nmol/L),采用Western blotting实验检测细胞Rab35、P62、微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞内ROS水平,RT-PCR检测细胞IL-6、TNF-α、TGF-βmRNA的表达。(5)将小胶质细胞分为对照组、α-syn组、α-syn+Rab35组,分别加入对应的药物处理24 h(Rab35过表达质粒的浓度为1μg/mL),采用Western blotting实验检测细胞Rab35、P62、LC3Ⅱ蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞内ROS水平,RT-PCR检测细胞IL-6、TNF-α、TGF-βmRNA的表达。结果(1)免疫荧光染色检测显示小胶质细胞神经元核蛋白(NeuN)表达阴性、离子钙结合适配分子1(Iba1)表达阳性、LRRK2呈高表达。成功构建PcDNA3.1-SNCA-A53T表达质粒并纯化获得α-syn A53T突变蛋白。(2)α-syn组细胞Fe2+浓度高于对照组,α-syn+DFO组细胞Fe2+浓度低于α-syn组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、α-syn组、α-syn+DFO组细胞Rab35蛋白、TGF-βmRNA的表达依次降低,IL-6、TNF-a mRNA的表达依次增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组、α-syn组、α-syn+DFO组小胶质细胞ROS水平、SH-SY5Y细胞凋亡率均依次增加。(3)双向DNA测序显示α-synA53T突变蛋白刺激后小胶质细胞LRRK2G2019S突变最明显。与对照组比较,α-syn组细胞LRRK2蛋白的表达增高;与α-syn组比较,α-syn+GSK3357679A组细胞LRRK2蛋白的表达降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,α-syn组细胞Rab35蛋白、TGF-βmRNA的表达降低,IL-6、TNF-a mRNA的表达增高;与α-syn组比较,α-syn+GSK3357679A组细胞Rab35蛋白、TGF-βmRNA的表达增高,IL-6、TNF-a mRNA的表达降低;与α-syn+GSK3357679A组比较,α-syn+GSK3357679A+DFO组细胞Rab35蛋白、TGF-βmRNA的表达降低,IL-6、TNF-a mRNA的表达增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。α-syn组细胞ROS水平高于对照组,α-syn+GSK3357679A组细胞ROS水平低于α-syn组,α-syn+GSK3357679A+DFO组细胞ROS水平高于α-syn+GSK3357679A组。(4)与对照组比较,α-syn组细胞Rab35、LC3Ⅱ蛋白、TGF-βmRNA的表达降低,P62蛋白、IL-6、TNF-a mRNA的表达升高;与α-syn组比较,α-syn+RAPA组细胞Rab35、LC3Ⅱ蛋白、TGF-βmRNA的表达升高,P62蛋白、IL-6、TNF-a mRNA的表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。α-syn组细胞ROS水平高于对照组和α-syn+RAPA组。(5)与对照组比较,α-syn组细胞Rab35、LC3Ⅱ蛋白、TGF-βmRNA的表达降低,P62蛋白、IL-6、TNF-a mRNA的表达升高;与α-syn组比较,α-syn+Rab35组细胞Rab35、LC3Ⅱ蛋白、TGF-βmRNA的表达升高,P62蛋白、IL-6、TNF-a mRNA的表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。α-syn组细胞ROS水平高于对照组和α-syn+Rab35组。结论在驱铁处理条件下,LRRK2G2019S能通过抑制Rab35等自噬相关蛋白诱发小胶质细胞活化,Rab35有望成为干预神经炎症反应的关键因素。