毛果杨富含谷氨酸蛋白PtrGARP1基因启动子特性

为了研究PtrGARP1与杨树木质化生长的相关性,明确木材发育及形成的分子机制,以毛果杨幼树为材料,提取各组织的cDNA进行PCR扩增,并构建植物表达载体在模式植物拟南芥中进行PtrGARP1组织表达分析。结果显示,PtrGARP1基因在毛果杨木质化组织内高丰度表达,且表达水平与幼茎木质化程度同步增加;用Gateway技术构建该基因启动子融合报告基因GUS的ProPtrGARP1::GUS植物表达载体,转化野生型拟南芥获得5个稳定表达的转基因株系;GUS活性染色分析显示,PtrGARP1基因启动子活性集中在转基因植株发达的维管组织内。这个结果暗示着PtrGARP1与杨树木质化生长相关,可能参与木材发育及形成。

八肋游仆虫一种富含谷氨酸的蛋白GARP的表达与纯化

为研究游仆虫中含有三核苷酸重复序列的GARP基因编码的GARP蛋白在细胞中的功能,利用定点突变技术,将GARP基因中的TGA突变为通用半胱氨酸密码子TGT。突变后的GARP基因构建于原核表达载体pRSETc中,得到重组质粒pRSETc-GARP,将pRSETc-GARP质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导,带有纯化标签的重组蛋白His6-GARP获得可溶表达,表达产物与抗His抗体在约26 kDa处有很强的交叉反应。His6-GARP蛋白在不同pH条件下通过两次阴离子交换层析和一次凝胶层析三步纯化达到电泳纯。

SH3域结合谷氨酸富含蛋白在宫颈癌组织中的表达及其临床意义的分析

目的分析SH3域结合谷氨酸富含蛋白(SH3BGR)基因在宫颈癌组织中的表达及其临床意义,研究SH3BGR蛋白对宫颈癌细胞系He La恶性转化、增殖和迁移能力的影响,并初步探索其调控机制。方法采用免疫组织化学染色方法(IHC)检测SH3BGR蛋白在宫颈癌组织中的表达。运用TCGA数据库和生物信息学相关方法分析SH3BGR表达水平与宫颈癌临床分期和患者生存率的关系。采用PCR进行SH3BGR基因的扩增,将其克隆至p HAGE-CMV-MCS-Izs Green载体,构建重组慢病毒表达质粒p HAGE-SH3BGR。将重组质粒p HAGESH3BGR与包膜质粒pMD2. G和包装质粒psPAX2共转染入人胚肾上皮细胞HEK293T,包装重组慢病毒,运用梯度稀释法测定病毒滴度。将重组慢病毒SH3BGR感染人宫颈癌细胞系He La,通过Western blot验证SH3BGR蛋白的表达。采用细胞增殖实验(CCK-8)、细胞划痕实验和软琼脂克隆形成实验分别评价过表达SH3BGR对HeLa细胞增殖、迁移及恶性转化能力的影响。运用小干扰RNA(siRNA)敲低人乳头瘤病毒(HPV) E6/E7基因,观察SH3BGR蛋白的表达。结果 SH3BGR蛋白在宫颈癌组织中表达明显高于癌旁组织,SH3BGR高表达宫颈癌患者生存期显著短于低表达患者。慢病毒载体介导的SH3BGR蛋白的过表达可显著提高He La细胞的增殖、迁移和恶性转化能力。敲低HPV E6/E7可以抑制SH3BGR蛋白的水平。结论 HPV可能通过E6/E7上调SH3BGR蛋白的表达,促进宫颈癌恶性转化、增殖、迁移,SH3BGR蛋白的高表达不利于宫颈癌患者的生存。

SH3BGRL对胃癌细胞增殖、迁移的影响

目的探讨SH3结构域结合富含谷氨酸的蛋白质(SH3 binding glutamic acid-rich protein like,SH3BGRL)对胃癌细胞增殖、迁移能力的影响及其作用机制。方法基于TCGA、GTEx及GEO数据库,通过生物信息学分析SH3BGRL在胃癌组织及正常胃黏膜上皮组织中的表达情况;通过HPA数据库获取SH3BGRL蛋白在胃癌组织及正常胃黏膜上皮组织中的表达图谱;并基于TCGA数据库的SH3BGRL表达水平进行高、低表达分组,分析其对胃癌患者预后、免疫细胞浸润和免疫治疗的影响。通过临床标本IHC染色观察SH3BGRL蛋白在胃癌中的表达情况;采用RT-qPCR检测SH3BGRL在胃癌细胞系和正常胃黏膜上皮细胞GES-1中的表达水平。将胃癌HGC-27及NCI-N87细胞进行siRNA转染分为si-NC组(转染阴性对照组)、si-SH3BGRL组(沉默SH3BGRL组),并通过RT-qPCR及Western blot验证是否转染成功。采用CCK-8及Transwell实验检测细胞增殖和迁移能力,随后诱导THP-1单核细胞分化为M0巨噬细胞,并将分化后的M0巨噬细胞和转染后的胃癌细胞进行共培养,采用RT-qPCR及细胞免疫荧光检测共培养之后M2巨噬细胞标志物的改变,并采用RT-qPCR检测SH3BGRL沉默胃癌细胞中CSF1的表达水平。结果生物信息学分析结果显示,与正常胃黏膜上皮组织相比,SH3BGRL在胃癌组织中表达上调(均P<0.01),且SH3BGRL高表达者总生存期和无进展生存期比SH3BGRL低表达的患者短(均P<0.01)。SH3BGRL高表达者M2巨噬细胞浸润比例更高,与免疫治疗低应答率相关(均P<0.01)。IHC染色结果表明,SH3BGRL蛋白在胃癌组织中表达上调(P<0.001)。与GES-1细胞相比,SH3BGRL在胃癌HGC-27及NCI-N87细胞中的mRNA表达水平均显著上调(均P<0.01)。与si-NC组相比,沉默SH3BGRL后HGC-27和NCI-N87细胞的增殖能力明显下降(均P<0.01),HGC-27细胞迁移能力显著下降(P<0.01)。M0巨噬细胞与沉默SH3BGRL的HGC-27及NCI-N87共培养后,M2巨噬细胞标志物CD163、CD206及Arg1均下调(均P<0.01)。在HGC-27及NCIN87细胞中沉默SH3BGRL后,NF-κB信号通路的靶基因CSF1显著下调(均P<0.01)。结论SH3BGRL在胃癌中表达上调,沉默SH3BGRL能抑制胃癌细胞增殖和迁移,其机制可能与抑制M2巨噬细胞极化进而形成免疫抑制肿瘤微环境有关。