甲型肝炎病毒抗原含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立及验证

目的:建立快速检测甲型肝炎病毒(HAV)抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,并进行验证及初步应用。方法:用HAV多克隆抗体和HAV单克隆抗体酶结合物建立双抗体夹心ELISA法,检测HAV抗原含量。对建立的方法进行特异性、线性(标准曲线)、准确度、精密度、灵敏度验证,对不同生产厂家生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)与不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品进行适用性检测。结果:HAV多克隆抗体的最佳包被浓度为8μg/mL,酶标抗体最佳稀释度为1∶10 000,封闭剂为1%BSA。该方法与其他人用疫苗和辅料成分无交叉反应;线性范围0.546 875~17.500 000 IU/mL,R^(2)> 0.99;准确度验证回收率80.1%~123.7%;精密度验证变异系数<8.3%。检测不同厂家的HAV疫苗(人二倍体细胞)和不同工艺阶段的HAV疫苗(人二倍体细胞)中间产品呈良好的剂量依赖效应。结论:建立了适用于HAV抗原含量检测的双抗体夹心ELISA方法,符合定量检测的需求,可用于不同毒株生产的HAV疫苗(人二倍体细胞)检测,可用于甲肝病毒收获液、浓缩液、纯化液、灭活液及原液等不同工艺阶段样品检测。

应用ELISA双抗体夹心法检测法氏囊病毒

从抗传染性法氏囊病（ＩＢＤ）高免卵黄液中提取ＩｇＧ，用作包被抗体和酶标记抗体，建立了检测ＩＢＤ病毒的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法，经特异性检验，阻断实验，敏感性检验等，证明此方法具有良好的特异性、敏感性，比普通免疫琼扩法可提高灵敏度１０００倍以上。为大样本检测ＩＢＤ病毒提供了一种有效的方法，是ＩＢＤ病原学诊断及流行病学调查的可靠手段，值得推广、使用。

伊氏锥虫变异表面糖蛋白抗原双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

试验旨在建立一种能鉴定水牛临床感染伊氏锥虫的方法。试验以纯化的伊氏锥虫3D7腹水单抗作为包被抗体,HRP标记的伊氏锥虫5B9单抗作为第2抗体,建立了检测伊氏锥虫变异表面糖蛋白(variant surface glucoprotein,VSG)抗原的双抗体夹心ELISA方法,并进行了灵敏度、特异性试验及初步检测应用试验。结果显示,用该法检测阳性血清,1∶3200稀释时其D450nm值仍大于阴阳临界值;交叉反应试验结果显示,其不与泰勒虫、弓形虫、衣原体、大片吸虫等抗原发生交叉反应,表明该法具有良好的检测特异性;用该法检测了当地82份水牛血清,阳性率为9.76%。结果表明本研究建立的伊氏锥虫VSG抗原双抗体夹心ELISA方法检测灵敏度高、特异性好,能作为检测水牛临床感染伊氏锥虫的有效方法,对于临床伊氏锥虫病的诊断和防控具有重要意义。

双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p抗体

目的建立一种检测马尔尼菲青霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法利用毕赤酵母系统表达重组马尔尼菲青霉特异性甘露糖蛋白Mp1p,并利用改良过碘酸钠法标记Mp1p,经棋盘滴定法建立一种可检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,并检测100例健康人群对照血清、21例血培养确诊其他真菌感染病人血清和15例血培养确诊马尔尼菲青霉病人血清,联合本实验室前期建立的马尔尼菲青霉抗原检测方法评价其临床应用价值。结果成功建立一种检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,经健康人群对照及其他真菌感染病人血清评价特异度为100%(121/121),检测15例马尔尼菲青霉病人血清,Mp1p特异性抗体2例阳性,Mp1p特异性抗原12例阳性,Mp1p抗体与抗原联合检测可明显提高灵敏度,达到93.3%(14/15)。结论双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体具有高度的特异性,联合抗原检测可提高马尔尼菲青霉感染诊断率。

禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化

利用原核表达的禽白血病病毒(ALV)P27蛋白作为抗原制备的单抗作为包被抗体,以制的酶标兔抗P27作为酶标抗体,在国内首次建立了检测ALV抗原的双抗体夹心ELISA方法。该方法对禽白血病P27抗原的最小检出量为5 ng/mL,通过统计学试验证明自制的诊断试剂具有良好的特异性和稳定性。与IDEXX试剂盒的平行实验确定自制诊断试剂S/P>0.17为阳性判定标准。应用此方法对北京附近鸡场对抽样检测687份蛋清样品,检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到100%。

尿液水通道蛋白-2双抗体夹心ELISA测定法的建立

目的建立较为稳定的定量检测尿液水通道蛋白-2(AQP2)的酶联免疫吸附测定(ELISA)法。方法人工合成AQP2蛋白C-末端的CELHSPQSLPRGSKA多肽片段,并与KLH联接,制备兔抗AQP2多肽片段的多克隆抗体,用辣根过氧化物酶标记部分抗AQP2抗体IgG。建立检测充血性心力衰竭模型大鼠尿液AQP2的双抗体夹心ELISA法。结果双抗体夹心ELISA法成功建立,灵敏度为15.625 pmol/ml,批内及批间变异系数分别为4.65%和14.05%;用该法定量检测左冠状动脉结扎术后不同梗死面积充血性心力衰竭模型大鼠的尿AQP2浓度,其结果与Western blotting半定量检测结果一致。结论双抗体夹心ELISA法可以较好地定量检测充血性心力衰竭模型大鼠的尿AQP2蛋白浓度且较Western blotting更加简便易行,便于临床推广使用。

戊型肝炎病毒抗体双抗原夹心法ELISA的建立与初步应用

目的 建立抗戊型肝炎病毒 (HEV)抗体检测的双抗原夹心ELISA(DS -ELISA) ,并应用于多种动物血清的检测。方法 将大肠杆菌表达的一段HEVORF2区重组抗原分别包被微孔板和进行辣根过氧化物酶 (HRP)标记 ,利用 5份阳性血清和 4 0份阴性血清建立双抗原夹心ELISA ;用 4 0 0份义务献血员血清比较双抗原夹心ELISA与间接法IgG抗体ELISA的符合情况 ;用 3只HEV感染猴系列血清比较双抗原夹心ELISA试剂和Genelabs公司HEVIgG试剂 ;用双抗原夹心ELISA试剂检测新疆地区的部分牛、绵羊、山羊、猪血清和上海地区的部分鸡血清中的HEV抗体。结果 建立了检测HEV抗体的双抗原夹心ELISA方法 ,对 4 0 0份义务献血员血清的检测表明其与间接法IgG抗体ELISA试剂的符合情况良好 ,并且有更高的s/co比值 ;与Genelabs公司HEVIgG试剂的比较表明双抗原夹心ELISA试剂的检出更早 ,尤其是持续时间及强度明显优于Genelabs试剂 ;在所检测的各种动物中均发现了HEV抗体 ,其中猪抗体的阳性率最高 ,表明双抗原夹心ELISA试剂可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。结论 利用大肠杆菌表达的HEV重组抗原建立了双抗原夹心法ELISA ,并可同时用于不同动物的抗HEV抗体检测。

应用ELISA双抗体夹心法检测猪细小病毒抗原的研究

研究建立了从胎猪脏器中检测猪细小病毒（ＰＰＶ）抗原的ＥＬＩＳＡ双抗体夹心法。试验方法的最佳工作条件为，抗体浓度１：４００，酶标抗体浓度１：５０。５４份胎猪样品阳性检出率为５９．３％，不同脏器的阳性检出率分别为，心３６．４％、肝脏７２．７％、脾脏５０％、肺脏６６．７％、肾脏６６．７％。

应用双抗体夹心酶联免疫方法检测仿刺参病原菌--黄海希瓦氏菌AP629

"化皮病"是当前仿刺参养殖的最严重的疾病,导致大量死亡,严重影响我国水产养殖的经济效益。以仿刺参病原菌——黄海希瓦氏菌(Shewanella smarflavi)AP629兔源多克隆抗体和鼠源单克隆抗体3D9分别作为包被抗体和检测抗体,建立了黄海希瓦氏菌AP629的双抗体夹心ELISA快速检测方法。多克隆抗体和单抗3D9的最佳稀释倍数分别为1∶400和1∶80,该方法特异性强,与弧菌、气单胞菌、爱德华氏菌、大肠杆菌等均无交叉反应,检测灵敏度高。以PBS和仿刺参体壁匀浆上清液为悬菌介质的最低检出限分别为104cells/mL和106cells/mL。对人工感染黄海希瓦氏菌的10头仿刺参进行检测,其检测结果均为阳性,稳定性和重复性良好。该方法的建立有助于快速准确地诊断由黄海希瓦氏菌AP629引起的仿刺参疾病。

双抗原夹心ELISA法检测烟曲霉Afmp1cr/Afmp2cr抗体

目的建立检测烟曲霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法用毕赤酵母系统表达重组的烟曲霉特异性甘露聚糖蛋白片段Afmp1cr和Afmp2cr,经棋盘滴定法建立可检测烟曲霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。用Afmp1cr和Afmp2cr分别免疫兔血清评估方法灵敏度,健康人血清、其它微生物感染者血清评估特异性,并检测曲霉感染者血清。结果 Afmp1cr双抗原夹心ELISA法可捕获1∶800稀释兔多抗血清中的抗体,Afmp2cr双抗原夹心ELISA法可捕获1∶3200稀释兔多抗血清中的抗体,两者均与其他真菌及细菌无交叉反应。2例确诊曲霉感染和1例拟诊曲霉感染患者血清中能检测出抗体。结论初步建立了检测anti-Afmp1cr/Afmp2cr抗体的双抗原夹心ELISA方法,可辅助诊断临床烟曲霉感染。

双抗原夹心ELISA法检测抗念珠菌烯醇化酶抗体

目的建立检测抗念珠菌烯醇化酶(Eno)特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,并进行临床应用评价。方法用基因工程制备的重组Eno作为包被抗原和酶标抗原,通过棋盘滴定法对双抗原夹心ELISA法的反应条件进行优化,对方法的敏感性、特异性和精密度进行考察。用双抗原夹心ELISA法测定291例住院患者(侵袭性念珠菌病114例,念珠菌定植82例,细菌感染患者95例)以及200名健康人血清,并与本实验室前期自建的间接ELISA法检测抗Eno抗体的结果进行比较。结果双抗原夹心ELISA法工作条件为:Eno抗原包被浓度为0.5μg/m L,酶标抗原1∶4 000稀释;封闭液为含50 g/L脱脂奶粉的PBS-T,待测血清稀释度为1∶100。患者血清检测结果显示,批内变异系数(CV)分别为6.8%、7.4%和5.9%;不同批次重复测定15次,其批间CV分别为10.1%、9.6%和12.4%。重组抗原对血清中相应抗体的阻断率为92.2%。通过ROC曲线确定cut off值吸光度(A)为0.209。检测侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis,IC)的敏感性和特异性分别为81.6%(93/114)和94.4%(356/377),敏感性高于检测抗Eno抗体的间接ELISA法(81.6%vs 76.1%)。结论建立了双抗原夹心ELISA法检测抗念珠菌Eno特异性抗体,可提高IC的诊断率,具有临床应用价值。

ELISA双抗体夹心法检测河蟹“颤抖病”病毒

用纯化的河蟹“颤抖病” (暂定名 )病毒分别免疫家兔和山羊 ,制备高效价的抗血清。羊抗血清经硫酸铵盐析纯化。经方阵滴定 ,选择P/N =2 95时作 1∶10 0稀释的抗血清为工作浓度 ,建立ELISA双抗体夹心法检测样本 14 4份 ,包括来自长江水域的野生河蟹、人工感染发病的河蟹、 1999年和 2 0 0 0年从江苏采集的自然发病的病蟹及市场购买河蟹。结果显示 ,病蟹和市场购买河蟹的阳性率为 6 6 7%～ 10 0 % ,人工感染的病蟹和人工感染石蟹致病组阳性率均为 10 0 % ,来自长江水域的健康河蟹及未接种病毒的对照石蟹阳性率均为 0 ,表明建立的方法可以用于检测河蟹“颤抖病”

hGH单克隆抗体的筛选及双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用杂交瘤法制备单克隆抗体,并用辛酸-硫酸铵法纯化单抗,通过ELISA方法和Western blotting测定抗体的效价与特异性,并进行抗体类型、相对亲和力测定;应用纯化的单抗建立hGH双抗体夹心ELISA检测方法。筛选出两株可以稳定分泌抗hGH单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3E11、2G9,抗体类型均为IgG1,抗体滴度均可达10-10,特异性好,相对亲和力高,以筛选到的两株单抗建立的双抗夹心ELISA法线性范围为0.09～1.5625ng/mL,R2>0.9,灵敏度为0.09ng/mL。筛选出高效抗hGH的单抗,并建立了hGH双抗体夹心ELISA检测方法。

应用ELISA双抗体夹心法诊断鸭冠状病毒性肠炎的研究

将电镜检查鸭冠状病毒阳性的病鸭肠管及粪便,经PEG沉淀及蔗糖线性梯度超速离心提纯抗原。用其免疫豚鼠制备抗血清,经饱和硫酸铵粗提,再经QAE-ScphadcxA50离子柱纯化提取IgG。纯化IgG与辣根过氧化物酶(HRP)用过碘酸钠法进行标记,制备酶标抗体,建立ELISA了双抗体夹心法,以诊断鸭冠状病毒性肠炎抗原,对发病鸭及回归试验、人工感染试验中收集的55份粪便样品,用本试验检测,并用电镜检查作为对照,证明该法具有特异、敏感、快速、简便之优点,解决了仅靠电镜检查的局限性。

牛附红细胞体病双抗体夹心ELISA诊断方法的建立

用过碘酸钠改良法制备酶标抗体,建立了从血液中检测奶牛温氏附红细胞体抗原的双抗体夹心ELISA。试验结果表明:抗体最适包被量为156μg/mL;酶标抗体最适工作浓度为1∶400;抗原及酶标抗体的作用温度和时间分别为37℃、1 h;封闭液为5%犊牛血清;底物显色时间为15 min;对温氏附红细胞体抗原的最低检出量为6.64μg/mL;全血及带有附红细胞体的红细胞与纯化抗体反应的最大稀释倍数分别为1∶160和1∶40,可按照此浓度检测血液中的附红细胞体抗原。对该方法进行特异性阻断试验、交叉性试验和重复性试验,结果表明此法是一种特异、灵敏、快速的诊断方法,并适合作群体检测。

检测瞬时受体电位通道6的ELISA双抗体夹心法的建立

目的建立ELISA双抗夹心法以用于TRPC6蛋白的测定。方法采用mAb相加法和配对实验,选择最佳配对组合;并通过cELISA法测定mAb阻断率,以选亲和力较高的mAb进行HRP标记,最终建立ELISA双抗体夹心法以用于大鼠和小鼠脑组织TRPC6蛋白的测定。结果 mAb-A2与mAb-F11的AI>50%,配对较佳;mAb-F11亲和力较强,IC50为0.6μg/ml;HRP标记mAbF11的最低工作浓度为1∶1 600;建立ELISA双抗夹心法可检测到大鼠和小鼠脑组织TRPC6蛋白分别为(1.42±0.06)μg/ml和(0.88±0.04)μg/ml。检测线性范围0.625～10μg/ml,R2=0.992,组间变异系数小于10%。结论所建立的ELISA双抗夹心法灵敏高,特异性强,重复性好,可用于脑组织中TRPC6蛋白的测定。

双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫循环抗原的研究

目的建立双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫循环抗原(Cag).方法采用两株抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原单克隆抗体,应用双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫CAg,并摸索该法的最佳实验条件.对感染大鼠、小鼠、疑似和确诊广州管圆线虫病病例血清进行检测,评价方法的敏感性;对日本血吸虫、肺吸虫、旋毛虫、囊虫病人血清进行交叉反应试验,评价方法的特异性.结果 10μg/ml单抗包被,酶标记单抗1∶1 600稀释为最佳工作浓度.利用该法检测不同血清广州管圆线虫循环抗原的敏感性为84.2%～87.2%,特异性为100%.结论建立的双抗体夹心ELISA法检测广州管圆线虫循环抗原具有敏感性高、特异性强和经济、简便易行等优点.

曲霉抗原双抗体夹心ELISA法特异性检测

目的用2组曲霉单克隆抗体(mAbs)建立特异性识别不同种类曲霉抗原的检测方法。方法采用天然烟曲霉抗原免疫,获得广谱针对曲霉抗原的单克隆抗体;采用重组烟曲霉抗原获得特异性针对烟曲霉抗原的单克隆抗体,用间接免疫荧光鉴定,并分别建立2种双抗体夹心ELISA法,对19种常见的环境和临床分离曲霉株、马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液进行检测。结果间接免疫荧光显示,用天然烟曲霉抗原免疫获得的单克隆抗体(mAbs-1)可广谱识别多种曲霉分离株,而重组烟曲霉抗原获得的单克降抗体(mAbs-2)仅能特异性结合临床和环境分离的烟曲霉抗原。用mAbs-1建立的双抗体夹心ELISA法可检测19种常见曲霉株培养液;用特异性针对烟曲霉抗原单克降抗体(mAbs-2)建立的双抗体夹心ELISA法可特异性检测临床和环境分离株烟曲霉培养液;与其他曲霉株无交叉反应;2种双抗体夹心ELISA法与马尔尼菲氏青霉菌及念珠菌培养液均无交叉反应。结论2种曲霉单克降抗体双抗体夹心ELISA法,除可广谱检测环境和临床分离曲霉株,还可以区分烟曲霉与其他曲霉,可作为监测环境、农产品、食品中的曲霉污染和早期诊断曲霉病的新技术手段。

双抗体夹心ELISA检测肺炎支原体抗原方法的建立及临床应用

目的 建立检测肺炎支原体抗原的双抗体夹心ELISA ,探讨其临床应用的可行性。方法 采用不同株Mp单抗 ,用双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原 ,优化该方法检测Mp抗原的最佳实验条件。对Mp标准株及 14 7份临床标本进行测定 ,观察双抗体夹心ELISA方法的敏感度和特异度 ,以及该方法与聚合酶链反应 (PCR)检测法的符合率。结果 包被单抗量为 2 0 μg·ml-1,酶标记单抗 1∶2 0 0稀释时 ,阳性对照与阴性对照吸光度之比 (P/N值 )最大 ;检测Mp抗原敏感度达 2 μg·ml-1,和其它支原体没有交叉反应。 14 7份临床标本PCR检测阳性率为 13 .6% (2 0 /14 7) ;双抗体夹心ELISA法检测阳性率为 12 .2 % (18/14 7) ,两者符合率达 95 .9%。结论 建立的双抗体夹心ELISA法检测Mp抗原具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点。