一新富含甘氨酸果蝇抗菌肽在大肠杆菌中的优化表达

目的:探索大肠杆菌原核表达系统制备具有生物功能的抗菌肽的最佳诱导条件。方法:将富甘氨酸果蝇抗菌肽基因的核心片段构建表达载体pET32a+中,经序列分析证实基因序列的正确性。在不同温度、不同时间和不同IPTG浓度进行诱导后,用15%SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,发现有一条分子量约8kD的新增蛋白条带。结果:研究表明在37℃菌液OD值0.8时诱导7h蛋白表达量最高(IPTG 0.7mmol/L,AMP 100μg/ml,0.3%Glu)。结论:获得了抗菌肽表达的最佳诱导条件,为大量诱导产生该抗菌肽奠定了理论基础。

富甘氨酸果蝇抗菌肽在大肠杆菌中的直接表达和纯化

利用RT-PCR技术从果蝇总RNA中克隆出富甘氨酸果蝇抗菌肽基因,将该基因插入原核表达载体pET-32a(+)的Nde I和Xho I酶切位点之间,然后用重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)利用乳糖操纵子的葡萄糖效应IPTG诱导表达,经15%SDS-PAGE、Western blot分析,在大约8 kD处出现了含6×His标签的抗菌肽蛋白。再以Ni-N TA纯化树脂进行亲和层析、脱盐、冻干,成功制备了富甘氨酸果蝇抗菌肽蛋白。

富甘氨酸果蝇抗菌肽SK_(66)对子宫颈癌细胞Hela增殖的研究

SK66是一个编码了N端为丝氨酸、C端为赖氨酸且含有66个氨基酸残基的富甘氨酸果蝇抗菌肽。SK66能杀灭宫颈癌细胞Hela,经SK66处理后子宫颈癌细胞Hela的贴壁性很快被破坏,大量细胞悬浮并死亡。通过MTT试验,发现SK66能够显著抑制子宫颈癌细胞Hela的增殖。采用膜片钳技术,研究表明SK66能在DRG细胞上形成阳离子通道。这说明SK66对癌细胞的杀灭机制可能为细胞膜出现大量穿孔、原生质泄漏,细胞破裂死亡。

富甘氨酸果蝇抗菌肽SK_(66)的抗菌机制研究

为了研究SK66的抗菌机制,对K66-his、AMA-SK66、Trx-SK66进行序列比对和分析,结果发现Trx-SK66是SK66的氮端加了1个Trx蛋白,AMA-SK66是SK66的氮端加了2个丙氨酸和1个甲硫氨酸,SK66-his是在SK66的碳端加了6个组氨酸;比较SK66-his、AMA-SK66和Trx-SK66杀灭细菌活性,结果表明Trx-SK66没有杀菌活性,AMA-SK66杀菌活性大大降低。试验结果说明氮端氨基酸对SK66杀菌活性很重要,尤其氮端氨基酸的极性。