富组氨酸糖蛋白在大鼠糖尿病视网膜病变新生血管形成中的作用

目的:探讨富组氨酸糖蛋白(HRG)在大鼠糖尿病视网膜病变新生血管形成中的作用。方法:建立链脲佐菌素(STZ)诱导的SD大鼠糖尿病模型,蛋白免疫印迹法(WB)检测正常(WT)组、糖尿病(DM)组视网膜中HRG、血管生成因子(VEGF)的蛋白表达情况。转染HRG小干扰RNA低表达序列,WB验证在高糖诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)中HRG的蛋白表达情况,选择最佳si-HRG#298序列用于后续实验。动物实验通过腺相关病毒载体沉默HRG,玻璃体腔注射HRG空载体对照组(AAV2-sh-NC)及HRG基因沉默组(AAV2-sh-HRG#298),WB验证HRG的蛋白表达情况后,通过HE染色观察各组视网膜结构变化,PAS染色观察各组视网膜新生血管变化情况,WB检测各组HRG及VEGF的蛋白表达情况。结果:HE染色发现DM组大鼠视网膜结构出现紊乱,神经节细胞层细胞数量减少,内核层和外核层细胞数量减少,视网膜总厚度也减少(P<0.05);PAS染色观察DM组大鼠视网膜中无细胞毛细血管明显增多(P<0.05);DM组大鼠视网膜中HRG及血管生成因子VEGF的蛋白表达上调(P<0.05);高糖诱导的hRMECs中转染HRG后其蛋白表达明显下调(P<0.05);HRG基因沉默可以抑制糖尿病视网膜的新生血管形成,下调VEGF的蛋白表达(P<0.05)。结论:HRG促进糖尿病大鼠视网膜的新生血管形成,HRG基因沉默可以抑制其新生血管形成。

NiFe_(2)O_(4)磁性纳米粒子制备及其吸附富组氨酸蛋白的研究

引入具有生物相容性、亲水性好的高分子材料聚乙二醇,通过水热法一步合成NiFe_(2)O_(4)磁性纳米材料,其直径大小约为50 nm,比表面积38.15 m^(2)·g^(-1),具有良好的结晶度、热稳定性、分散性以及较强的磁性。利用NiFe_(2)O_(4)磁性纳米材料NiFe_(2)O_(4)MNPs表面的Ni2+能够与富组氨酸蛋白上的咪唑环通过配位键结合,以此来实现对富组氨酸蛋白的吸附。实验证明NiFe_(2)O_(4)磁性纳米材料能吸附天然富组氨酸蛋白质牛血红蛋白,吸附量可达到235 mg·g^(-1),高于文献报道的120.1 mg·g^(-1),还可以用于人血血红蛋白的吸附,具有实际应用价值。

试纸法检测血液中富组氨酸蛋白Ⅱ快速诊断恶性疟的初步观察

本文报道了应用试纸法检测感染恶性疟后血内富组氨酸蛋白Ⅱ，用以诊断恶性疟。对镜检确诊的恶性疟病人进行了检测，阳性检出率为９５％，检测全过程需５～７ｍｉｎ。应用改良法检测全血或血浆仅需２～３ｍｉｎ；同时对间日疟病人血样和非疟疾病人血样进行了检测，结果全部阴性，特异性为１００％。应用试纸法诊断疟疾无须任何仪器，诊断快速、方便，对临床早期确诊病人并给于及时治疗、减少传播和病死率有重要意义。

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白与真核表达质粒免疫特性的比较

目的 探讨以恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (PfHRP2 )为基础的不同形式的侯选疫苗诱导小鼠免疫应答的特性 ,为包含HRP2的恶性疟红内期疫苗的研制提供实验依据。方法 用重组蛋白TP HRP2及真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2免疫BALB c小鼠 ,对抗体应答的动力学及特异性进行分析 ,取脾细胞进行体外增殖实验 ,用免疫血清进行P f.体外生长抑制实验。结果 重组蛋白TP HRP2加福氏佐剂诱导BALB c小鼠产生了高水平的抗体 ,其抗体产生快、持续时间久 ,并具较高的特异性 ,细胞应答被同期激活 ,免疫血清可明显抑制红细胞内发育期疟原虫。重组真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2诱导BALB c小鼠产生了较高水平和具有一定特异性的抗体 ,其抗体的产生需要多次免疫和较长时间 ,初始化的脾细胞对抗原再刺激的回忆应答显著 ,但免疫血清对疟原虫的体外生长没有抑制作用。结论 HRP2重组蛋白与真核表达质粒在小鼠具有较为不同的免疫特性 。

恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2基因诱导的免疫应答研究

[目的 ]探讨编码恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (HRP Ⅱ )C端基因的真核表达重组质粒诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。 [方法 ]将起始码和终止码引入HRP ⅡC端基因片段两端 ,经测序鉴定读框 ,将包含起始码和终止码的HRP Ⅱ基因片段克隆入真核表达质粒pcDNA3 1( )中 ,进行酶切鉴定。用重组真核表达质粒pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 经肌肉免疫小鼠 3次 ,每次间隔 3wk。第 3次免疫后 2wk ,取小鼠血清和脾细胞 ,分别用ELISA测定HRP Ⅱ抗体水平和用脾细胞增殖实验测定细胞免疫反应。 [结果 ]序列测定结果表明 ,HRP ⅡC端基因片段被准确地引入起始码和终止码 ;酶切鉴定表明包含起始码和终止码的HRP ⅡC端基因片段成功地克隆入pcDNA3 1( ) ,形成pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 。在pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 免疫鼠血清中可检测出高水平的HRP Ⅱ抗体 ,用原核表达的HRP Ⅱ蛋白刺激免疫脾细胞 ,可检测出明显的细胞增殖反应。 [结论 ]编码HRP Ⅱ的真核表达重组质粒可诱导小鼠产生明显的体液和细胞免疫反应。

过表达富组氨酸糖蛋白质粒在体外抑制MHCC-97H肝癌细胞增殖

目的检测原发性肝癌组织富组氨酸糖蛋白(HRG)的表达,及其在体外研究过表达富组氨酸糖蛋白质粒对肝癌细胞增殖能力的影响。方法采用免疫组化法检测8例肝癌组织HRG表达情况,采用Western blot法检测11例手术切除的肝癌组织和癌旁组织HRG表达的差异;在人肝癌细胞株MHCC-97H细胞中转染稳定过表达HRG质粒,使用流式细胞仪分析肝癌细胞的增殖能力。结果 8例原发性肝癌组织HRG表达量较非肿瘤组织明显减少;另11例癌组织HRG表达量为(0.14±0.17),癌旁组织HRG相对表达量为(1.39±2.08),两者差异有统计学意义(P<0.05);稳定过表达HRG的人肝癌细胞株MHCC-97H细胞增殖比例为(1.72±1.19)%,显著低于对照组[(14.3±2.99)%,P<0.01]。结论原发性肝癌癌组织HRG表达明显减少,过表达HRG的肿瘤细胞增殖能力降低。

唾液中富组氨酸多肽的免标记快速检测

唾液中含有多种生物活性成分,包含部分可用于疾病诊断的生物标志物。相比于血液和尿液,唾液的收集过程更为简便且其收集过程具有完全无创的优点。唾液代替血液、尿液在无创疾病诊断中的作用已日益显现。富组氨酸多肽是由唾液腺分泌的一类富含组氨酸的小分子阳离子多肽,与口腔健康密切相关。近年研究更表明,唾液富组氨酸多肽的浓度与HIV-1、艾滋病等疾病相关。因此,富组氨酸多肽的检测对于口腔健康监控、疾病诊断等具有重大的意义。根据叠氮基与富组氨酸结构域发生较强的氢键作用后给电子能力减弱的原理,建立了富组氨酸多肽的免标记、快速检测方法。实验结果表明,富组氨酸多肽——Histatin 5与3-叠氮基香豆素相互作用后,荧光强度显著增加,当Histatin 5浓度为0.23~31.05μmol·L^(-1)时,荧光增加值与浓度呈现很好的线性关系,线性相关系数r=0.994,检出限为72nmol·L^(-1)(3σ/k)。唾液中常见的游离氨基酸和蛋白质不干扰Histatins 5的测定。本方法已成功地测定了唾液中的富组氨酸多肽,加标回收率在96.7%~111.6%之间,表明本方法具有很好的准确性。与现有的唾液分析方法相比,本方法具有简单快速、成本低的优点,并有望为基于唾液的无创、非侵入性诊断提供新方法。

儿茶酚胺和凝血酶对人胎肝细胞富组氨酸糖蛋白分泌的影响

采用人胎肝细胞原代培养方法，观察儿茶酚胺和凝血酶对肝细胞富组氨酸糖蛋白（ＨＲＧ）分泌的影响。结果表明：抗原测定和生物活性检测，均证明细胞能分泌ＨＲＧ；而肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素以及凝血酶则对肝细胞白蛋白分泌无明显影响，但它们均能刺激肝细胞分泌ＨＲＧ。肾上腺素与心得安联用，虽仍然刺激肝细胞分泌ＨＲＧ，但其作用远较单独使用肾上腺素弱。故推测肾上腺素刺激肝细胞分泌ＨＲＧ主要是通过β肾上腺素能受体介导的，但部分由非β肾上腺素能受体介导。

抗富组氨酸糖蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的 :制备抗富组氨酸糖蛋白 (HRG)单克隆抗体 ,用于建立夹心ELISA方法检测血浆HRG浓度。方法 :用淋巴细胞杂交瘤技术 ,制备单克隆抗体 ,并对其免疫学特性进行了研究。结果 :建立了二株稳定分泌抗HRG单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (9E7C9和 3C6 F3) ,染色体数分别为 10 2和 96条 ,免疫球蛋白亚类均为IgG1。以羟基磷灰石法从腹水纯化McAb 9E7C9,SDS -PAGE检测其纯度 ,Westernblotting分析表明其可特异性地识别分子量为 670 0 0的抗原分子。用辣根过氧化物酶标记hcAb ,建立双抗夹心ELISA法 ,测定正常人血浆HRG含量为 110 .3± 9.7mg/L。结论 :所得McAbs特异性强 ,用其建立的夹心ELISA检测HRG的方法线性较好 ,灵敏度达 1ng/ml。

富组氨酸糖蛋白(HRG)的结构与功能

富组氨酸糖蛋白(HRG)为一种多结构域血浆糖蛋白,可与多种配体结合而行使多种功能.HRG配体包括锌离子、肝素和硫酸肝素、纤溶酶原、纤溶酶、纤维蛋白原、凝血酶敏感素、原肌球蛋白、IgG、FcγR及补体.在锌离子存在或在低pH的环境中(如组织损伤或肿瘤生长),HRG的富含组氨酸结构域与配体的结合能力加强.HRG的多结构域特点及其与多种配体结合的性质表明,其可以作为细胞外衔接蛋白衔接细胞表面的不同配体.除了细胞表面分子,HRG还可以结合IgG,从而阻止可溶性免疫复合物的产生.HRG与大多数细胞发生结合的功能是在锌离子存在或低pH环境下,通过与细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖相互作用实现的.HRG还具有加强凋亡细胞、坏死的吞噬细胞和免疫复合物的清除、抗血管新生、细胞的粘附和迁移、纤维蛋白溶解作用、血凝固、补体激活等生理活动调节等功能.本文针对HRG的分子结构与功能及其在临床上的研究进展进行概述.

唾液富组氨酸蛋白

唾液富组氨酸蛋白(histidine-rich protein,HRPs)是由人类和高等灵长动物的腮腺、下颌下腺、舌下腺分泌到唾液中的碱性小分子多肽,分子量为4 k D左右,其氨基酸序列富含组氨酸,分子表面带有正电荷和稳定的α螺旋结构.唾液富组氨酸蛋白具有广谱抗菌性,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌都有杀伤作用,其抗菌机制是作用线粒体呼吸通路,诱发ATP的释放.此外,唾液富组氨酸蛋白具有促进伤口愈合的能力,其作用机制与细胞内信号调节激酶1/2通路相关.同时,它也具有金属离子结合能力、机体免疫调节能力,其作用机制与分子表面本身结构特点和阻滞下游信号通路相关.唾液富组氨酸蛋白是一种天然的功能性蛋白质,有望应用在相关疾病的治疗上,本文对唾液富组氨酸蛋白的结构特点、功能机制、应用前景作一简要论述,为后续功能蛋白质的研发和应用奠定了理论基础.

唾液富组氨酸蛋白一种具有前景的抗真菌物质

唾液腺分泌的抗菌肽类物质———唾液富组氨酸蛋白为一复含组氨酸的阳离子小蛋白家族,具有强大的杀伤白色念珠菌、光滑念珠菌、克鲁念珠菌和新型隐球菌等致病真菌与其耐药株的活性,对一些革兰阳性、阴性细菌与厌氧菌亦有抑制活性,作用机制独特,对机体几无毒性,作为抗真菌药物,是一理想的研究对象。对唾液富组氨酸蛋白的结构、杀菌功能、杀菌机制进行了综述并评述了作为抗真菌药物的研发前景。

唾液富组氨酸阳离子多肽的研究进展

人体唾液腺分泌的富组氨酸阳离子多肽与口腔健康关系密切,从20世纪80年代初发现唾液富组氨酸阳离子多肽以来,学者们对其进行了大量的研究,研究结果证实唾液富组氨酸阳离子多肽对口腔真菌、龋病和牙周相关细菌都有广谱抗菌活性。本文就有关唾液富组氨酸阳离子多肽的种类和来源、生物学活性、作用机制的研究进展作一综述。

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2的原核表达、纯化及表达产物的鉴定

目的为将恶性疟原虫的富组氨酸蛋白2（HRP2）应用于疟疾诊断和疫苗研究，本文原核表达、纯化及鉴定了恶性疟原虫的HRP2。方法将HRP2基因片段克隆入原核表达载体pGEX-4T-1，形成pGEX-4T-1／HRP2；诱导pGEX-4T1／HRP2转化的BL21菌，纯化表达产物并免疫BALB／C小鼠；以免疫色谱法鉴定表达产物，以免疫小鼠血清对受染红细胞（IRBC）进行Westemblot分析。结果成功构建了pGEX-4T-1／HRP2，经诱导表达出与GST融合的蛋白（约60KD），纯化后纯度达92％；HRP2特异性单抗可识别表达蛋白，免疫小鼠血清可识别IRBC中的原虫HRP2抗原。结论成功表达并纯化了HRP2蛋白，为深入研究和应用HRP2打下基础。

富组氨酸糖蛋白调节凝血与纤溶的研究进展

富组氨酸糖蛋白含有大量组氨酸残基,其氨基端序列与抗凝血酶Ⅱ具有同源性。它可与肝素结合,中和其抗凝作用。它与纤溶酶原结合,使游离纤溶酶原减少,从而抑制纤溶。此外,它还与纤溶酶原、凝血酶敏感蛋白形成复合物,对血小板与血管壁的相互作用以及血小板表面的凝血与纤溶具有调节作用。

富组氨酸糖蛋白的研究进展

富组氨酸糖蛋白(HRGP)的基因定位于3p^(14)～q^(tex)区域,由9个外显子和8个内含子组成,其cDNA长度为2067bp。成熟HRGP蛋白由507个氨基酸组成,其中组氨酸和脯氨酸含量均达12％以上。HRGP对肝素的高亲和力、与纤溶酶原竞争结合以及与补体成份、T淋巴细胞和巨噬细胞的相互作用显示,其对凝血、纤溶和免疫功能具有调节作用。肝病时HRGP含量减低;HRGP与血栓形成的关系尚未明确。

富组氨酸糖蛋白的功能及临床意义

富组氨酸糖蛋白含有大量组氨酸残基,其氨基端与抗凝血酶Ⅲ同源。富组氨酸糖蛋白可与肝素、纤溶酶(原)、凝血酶敏感蛋白、纤维蛋白(原)、二价金属离子、血红素结合,还可与血小板、单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞以及补体相互作用。因此,它对凝血、纤溶、免疫功能具有调节作用,同时对金属离子、血红素的运输具有一定影响。

单克隆抗体ELISA测定血浆富组氨酸糖蛋白的方法

建立用单克隆抗体（ＭｃＡｂ）酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）测定血浆富组氨酸糖蛋白（ＨＲＧ）的方法。结果显示：ＭｃＡｂ３Ｃ６Ｆ３包被浓度为１０μｇ·ｍｌ－１，单抗酶标结合物（ＭｃＡｂ９Ｅ７Ｃ９ＨＲＰ）作１∶２００稀释时标准曲线最理想；最低检出限为１ｎｇ·ｍｌ－１，批内ＣＶ８２％，批间ＣＶ１１５％，回收率为８９１％，测定范围为２５～８０ｎｇ·ｍｌ－１；用该法测定４０例正常人血浆ＨＲＧ为（１１０３±９７）ｍｇ·Ｌ－１，２４例肝硬化患者血浆ＨＲＧ为（７９５±１２６）ｍｇ·Ｌ－１。该法的特异性强，且方便而准确。

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ、Ⅲ的序列多态性分析

目的分析恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ/Ⅲ（Pf HRPⅡ/Ⅲ）的序列多态性。方法采集云南疟疾流行区恶性疟患者血样20份,血涂片后镜检,并进行疟疾快速诊断试剂检测（RDTs）,同时提取各血样中恶性疟原虫基因组DNA,进行PCR扩增Pfhrp2和Pfhrp3核酸片段并测序。使用Bioedit软件对Pfhrp2和Pfhrp3基因序列进行比对,使用TRANSEQ软件推导出其编码的氨基酸序列。结果 20份血样经镜检和RDTs检测均为恶性疟原虫阳性。PCR扩增结果显示,各血样的Pfhrp2核酸片段约389～986 bp,Pfhrp3核酸片段大小约329～640 bp,应用测序获得的核酸序列推导出相应的氨基酸序列,Pf HRPⅡ氨基酸残基序列以1型（AHHAHHVAD）起始并最终以12型（AHHAAAHHEAATH）作为结尾,Pf HRPⅡ特征性氨基酸残基重复序列数量相对较多的分别有7型（AHHAAD）、2型（AHHAHHAAD）和6型（AHHATD）;Pf HRPⅢ含有重复较多的型别是16型（AHHAAN）和17型（AHHDG）;Pf HRPⅡ和Pf HRPⅢ均未发现11型（AHN）。结论 20份恶性疟患者血样中Pfhrp2和Pfhrp3存在诸多的核酸变异,Pf HRPⅡ和Pf HRPⅢ共享一些特征性重复序列。

恶性疟原虫富组氨酸蛋白(HRP-Ⅱ)的表达和分离纯化

为获得大量具天然抗原活性的恶性疟原虫HRP-Ⅱ抗原,用摇瓶发酵工程菌,诱导β-半乳糖苷酶-HRP-Ⅱ融合蛋白表达;裂菌后,洗涤沉淀2～3次,用6M脲溶解;取上清经Sephacryl-200柱层析分离纯化目的蛋白,然后复性。结果重组蛋白以包涵体的形式高效表达;Sephacryl-200柱层析后,目的蛋白纯度达86％,91.48％被复性,被Dipstick即 ParsSight-F识别,表明该重组抗原纯度高,复性效果好,可用于恶性疟原虫 HRP-Ⅱ抗体的制备等研究。