恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ、Ⅲ的序列多态性分析

目的分析恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ/Ⅲ（Pf HRPⅡ/Ⅲ）的序列多态性。方法采集云南疟疾流行区恶性疟患者血样20份,血涂片后镜检,并进行疟疾快速诊断试剂检测（RDTs）,同时提取各血样中恶性疟原虫基因组DNA,进行PCR扩增Pfhrp2和Pfhrp3核酸片段并测序。使用Bioedit软件对Pfhrp2和Pfhrp3基因序列进行比对,使用TRANSEQ软件推导出其编码的氨基酸序列。结果 20份血样经镜检和RDTs检测均为恶性疟原虫阳性。PCR扩增结果显示,各血样的Pfhrp2核酸片段约389～986 bp,Pfhrp3核酸片段大小约329～640 bp,应用测序获得的核酸序列推导出相应的氨基酸序列,Pf HRPⅡ氨基酸残基序列以1型（AHHAHHVAD）起始并最终以12型（AHHAAAHHEAATH）作为结尾,Pf HRPⅡ特征性氨基酸残基重复序列数量相对较多的分别有7型（AHHAAD）、2型（AHHAHHAAD）和6型（AHHATD）;Pf HRPⅢ含有重复较多的型别是16型（AHHAAN）和17型（AHHDG）;Pf HRPⅡ和Pf HRPⅢ均未发现11型（AHN）。结论 20份恶性疟患者血样中Pfhrp2和Pfhrp3存在诸多的核酸变异,Pf HRPⅡ和Pf HRPⅢ共享一些特征性重复序列。

快速诊断靶蛋白恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ和疟原虫乳酸脱氢酶的热稳定性

在新型冠状病毒肺炎流行期间,通常需将血样进行56℃病毒灭活处理后再行病原体检测。为了解56℃灭活对血样中疟原虫抗原稳定性的影响,本研究收集2017-2019年上海市疾病预防控制中心上报的疟疾患者血样71份,其中恶性疟血样38份、三日疟血样8份、卵形疟血样11份、间日疟血样14份。应用快速诊断检测(RDT)试剂盒对56℃孵育30 min前后血样中恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(Pf HRPⅡ)和疟原虫乳酸脱氢酶(p LDH)的热稳定性进行测定。结果显示,热处理前T1检测线(检测目标Pf HRPⅡ)呈阳性的38份恶性疟血样,热处理后35份仍呈T1阳性(92.11%, 35/38,χ^(2)=3.123, P>0.05);热处理前T2检测线(检测目标pLDH)阳性的54份血样(26份恶性疟血样、6份三日疟血样、10份卵形疟血样和12份间日疟血样),经热处理后T2均呈阴性(阳性率为0, 0/54,χ^(2)=87.755, P<0.01)。表明在56℃孵育30 min条件下,Pf HRPⅡ的稳定性较好;p LDH不稳定,全部降解或失活。因此,应用RDT检测热处理后的血样,恶性疟血样的检测结果不受影响,但非恶性疟血样会被漏诊。

恶性疟原虫重组HRP-Ⅱ蛋白的纯化及抗体制备

目的 制备抗恶性疟原虫HRP Ⅱ的多抗和单抗 ,为疟疾免疫诊断提供良好的材料。方法 Sephacryl 2 0 0柱层析分离纯化HRP Ⅱ融合表达蛋白 ;纯化蛋白免疫新西兰兔及BALB/c小鼠制备抗HRP Ⅱ多克隆抗血清 ,采用杂交瘤技术制备抗HRP Ⅱ单抗 ;测定所获抗体的效价及其特异性反应。结果 表达产物获得高度纯化 ,纯度达 86 2 1% ;制备的多克隆抗血清双扩效价为 1∶4～ 1∶16 ;获得 6株能稳定分泌抗HRP Ⅱ单抗的杂交瘤细胞株 ,其单抗亚型均为IgG1,各株单抗均与重组HRP Ⅱ蛋白发生特异性反应 ,但只有 3A3和 2E7能与天然HRP Ⅱ反应。结论 获得了敏感、特异的抗HRP Ⅱ多克隆抗血清及稳定分泌抗HRP

抗恶性疟原虫重组HRP-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定

采用恶性疟原虫重组富组氨酸蛋白 (HRP- )融合表达蛋白免疫 BAL B/ c小鼠 ,取脾细胞与 SP2 / 0细胞融合 ,经 3次 EL ISA筛选 ,共获得 6株分泌抗恶性疟原虫重组 HRP- 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (1B11、1D10、2 E7、3A3、3F9、4G5 ) ,用有限稀释法进行克隆、亚克隆及扩大培养 ,并用杂交瘤细胞经腹腔接种 BAL B/ c小鼠制备腹水。 6株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体 (Mc Ab)经琼脂双扩散鉴定均为 Ig G1亚类 ,Dot- EL ISA及 Western blot分析显示 6株 Mc Ab都能与重组 HRP- 抗原发生特异性反应 ,但其中只有 2 E7和 3A3在 Dipstick免疫胶体金反应中能与恶性疟原虫培养上清中的天然 HRP-

自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫HRP-II抗原的评价

目的对自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)的敏感性、特异性、稳定性等技术参数进行评价,为试剂盒的临床应用提供科学依据。方法对试剂盒的敏感性、特异性、灵敏度、精密度、稳定性等性能指标进行测定,并与国外的同类试剂盒进行比较研究。结果自制试剂盒操作简便,反应快速;以血涂片显微镜检查为金标准,对49例恶性疟血样、30例间日疟血样、43例正常人血样检测的敏感性为98%,特异性为100%;对恶性疟原虫血样的最小检出量为原虫密度0.01%,对重组HRP-II蛋白的最小检出量为10ng/ml;试剂盒精密度和稳定性均较好;各项性能指标相当或优于国外同类试剂盒。结论自行研制的恶性疟原虫免疫层析检测试剂盒测定结果较为准确、稳定和可靠,适用于恶性疟的快速诊断、流行病学筛查、疟区献血员筛查及过境边民筛查。

单克隆抗体3A3、2E7用于恶性疟Dipstick检测的初步研究

目的 建立一种快速、简便 ,适用于基层的恶性疟免疫诊断方法。 方法 将抗恶性疟原虫 HRP- 的单克隆抗体 3A3、2 E7纯化后经配对筛选 ,利用 Dipstick-免疫胶体金技术 ,制成诊断恶性疟的 Dipstick层析条。用该层析条对 115份疟疾患者血样 ,2 0份非疟疾病人血样及 10份正常人血样进行检测 ,评价其敏感性和特异性 ,并对其稳定性、重复性等进行了初步研究。 结果 用该法检测 145份血样 ,其对恶性疟的敏感性和特异性分别为 83.1%及 97.5 % ,已包被抗原、抗体的 Dipstick条在 4℃及室温下可保存 3个月以上 ,对 30份血样重复检测 4次结果完全一致。 结论 Dipstick-免疫胶体金模式快速、简便 ,适用于基层应用 。

疟疾诊断技术进展与应用

疟疾是一种严重危害人类生命健康的蚊媒传染病,由于免疫学、分子生物学和生物化学技术的不断发展,陆续产生一些疟疾诊断的新技术,本文就疟疾各种诊断技术的原理和应用作简要综述。笔者认为,当前我国处于消除疟疾监测阶段,阻断病例境外输入,快速诊断外出回归人群中的疟原虫感染者,及时处置疟疾疫情是关键。在疟原虫镜检技术的基础上,实验室研究着重于DNA探针技术和PCR技术的应用,基层医疗单位和现场监测要推广应用胶体金免疫层析技术的快速诊断试剂,尤其是杭州艾康和广州万孚等国产产品,价格低廉,简便快速,灵敏度和特异度高,需要尽快普及。

云南恶性疟病例疟原虫Pfhrp2基因序列多态性分析

目的：分析云南省恶性疟病例疟原虫虫株的富组氨酸蛋白Ⅱ（Histidine？rich protein？2，HRPⅡ）基因（Pfhrp2）序列的多态性，为研究疟原虫抗原基因缺失奠定基础。方法搜集2012年8月-2015年9月云南省恶性疟现症病例的滤纸血样和相关信息，用PCR技术扩增血样中恶性疟原虫Pfhrp2基因exon2区并测序，测序成功序列与AY816237、AY816240、AY816301参比序列比对；用Mega 5.04分析Pfhrp2基因exon2区序列多态性，计算序列间保守位点、遗传距离等；根据氨基酸序列间遗传距离绘制聚类树状图。结果共收集云南省15个州（市）的恶性疟现症病例血样218份，病例感染来源地包括云南本地、非洲、缅甸等流行区。其中155份Pfhrp2基因exon2区扩增阳性和测序成功，编码氨基酸数在115～298之间，平均为239.7 aa，非洲（239.9 aa）、缅甸（239.5 aa）、云南（241.6 aa）感染虫株的氨基酸残基均数差异无统计学意义（F=0.025，P＆gt;0.05）。所有氨基酸残基序列均以12型重复作为结尾，以1型、2型重复为起始，比例各占98.1%（152/155）和1.9%（3/155），2型重复次数最多，为12.9次。155条Pfhrp2基因exon2区DNA序列的同源位点为894 bp，保守位点占20.8%（186/894），变异位点占78.2%（699/894），非洲虫株序列间遗传距离为0.000～0.741，缅甸为0.000～0.948，云南为0.000～0.750。所有155条序列按氨基酸序列大小聚类成3个大类，同一个层级的序列具有近似的序列长度和氨基酸重复类型。结论云南省恶性疟现症病例所感染疟原虫的Pfhrp2基因exon2区存在高度多态性，恶性疟原虫株主要按Pfhrp2基因exon2区的氨基酸序列长度进行聚类。

艾博混合疟/恶性疟快速诊断试剂效果评价

目的评价艾博混合疟/恶性疟(Malaria Pan./p.f..)快速诊断试剂的检测效果。方法采集疟疾、疑似疟疾、不明原因发热及感冒"四热"患者血样,以显微镜镜检方法为金标准,比较艾博混合疟/恶性疟试剂检测效果结果共采集584份血样,艾博试剂检测恶性疟原虫277份,灵敏度为98.9%,特异性为97.7%,与显微镜符合率为98.3%。艾博试剂检测混合疟377份的灵敏度为99.5%,特异性为99.0%,与显微镜符合率为99.3%,总符合率为98.8%,上述2方面的检测结果经Kappa一致性检验,Kappa值均大于0.97。结论艾博混合疟/恶性疟试剂盒实验室检测敏感性和特异性高,能检测混合疟并区分恶性疟,结果与血涂片吉氏染色镜检结果高度一致,适用于疟疾流行的基层使用。

疟疾快速免疫诊断试剂在我国的应用

近年来,随着诊断技术的发展,疟疾快速免疫诊断技术因其操作简便、快速、结果直观,无需复杂设备、敏感性和特异性高等优点,在我国各疟区逐步成为疟疾辅助诊断常用手段。现对已在我国开展过检验效能评估试验的国内外疟疾快速免疫诊断试剂进行综述,以期指导基层防治人员运用。