抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选

目的构建抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ(Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ）单链抗体库，并筛选出阳性克隆。方 法用噬菌体抗体库技术构建抗恶性疟原虫ＨＲＰ－Ⅱ单链抗体库，并以ＨＲＰ－Ⅱ为靶抗原对该库进行了三轮“亲和吸附 一援救一感染扩增”的富集，挑取单菌落筛选并鉴定阳性克隆。结果获得目的基因并成功构建抗恶性疟原虫 ＨＲＰ－Ⅱ的 单链抗体库，库容为 １０６，并从中筛选出８株阳性克隆。结论 噬菌体抗体库技术具有高效的筛选性能，抗 ＨＲＰ－Ⅱ单链 抗体的制备为其在恶性疟的免疫快速诊断方法中的应用奠定了基础。

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ、Ⅲ的序列多态性分析

目的分析恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ/Ⅲ（Pf HRPⅡ/Ⅲ）的序列多态性。方法采集云南疟疾流行区恶性疟患者血样20份,血涂片后镜检,并进行疟疾快速诊断试剂检测（RDTs）,同时提取各血样中恶性疟原虫基因组DNA,进行PCR扩增Pfhrp2和Pfhrp3核酸片段并测序。使用Bioedit软件对Pfhrp2和Pfhrp3基因序列进行比对,使用TRANSEQ软件推导出其编码的氨基酸序列。结果 20份血样经镜检和RDTs检测均为恶性疟原虫阳性。PCR扩增结果显示,各血样的Pfhrp2核酸片段约389～986 bp,Pfhrp3核酸片段大小约329～640 bp,应用测序获得的核酸序列推导出相应的氨基酸序列,Pf HRPⅡ氨基酸残基序列以1型（AHHAHHVAD）起始并最终以12型（AHHAAAHHEAATH）作为结尾,Pf HRPⅡ特征性氨基酸残基重复序列数量相对较多的分别有7型（AHHAAD）、2型（AHHAHHAAD）和6型（AHHATD）;Pf HRPⅢ含有重复较多的型别是16型（AHHAAN）和17型（AHHDG）;Pf HRPⅡ和Pf HRPⅢ均未发现11型（AHN）。结论 20份恶性疟患者血样中Pfhrp2和Pfhrp3存在诸多的核酸变异,Pf HRPⅡ和Pf HRPⅢ共享一些特征性重复序列。

恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ基因大肠杆菌中的表达

目的在大肠杆菌中表达富含组氨酸蛋白Ⅱ，为抗疟疫苗研究及制备疟疾诊断单克隆抗体提供实验材料。方法采用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ—３／ＹＮ）富含组氨酸蛋白Ⅱ部分基因，经基因序列测定后克隆于ｐＧＥＸ４Ｔ－１融合蛋白的表达，并用ｄｏ－ＥＬＩＳＡ对表达产物进行鉴定。结果ＨＲＰⅡ基因与ｐＧＥＸ４Ｔ－１重组后在大肠杆菌ＴＧ１中表达—４１ｋＤａ的融合蛋白。Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ鉴定表明ＨＲＰⅡ基因表达产物能被抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体所识别。结论大肠杆菌表达的ＨＲＰⅡ能与抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体发生反应，且具有恶性疟原虫ＨＲＰⅡ抗原表位。

富血小板纤维蛋白治疗Ⅱ度根分叉病变的效果评价

目的:观察富血小板纤维蛋白(platelet rich fibrin, PRF)联合Bio-oss治疗Ⅱ度根分叉病变的临床效果。方法:选取临床Ⅱ度根分叉病变的下颌第一磨牙患者30例,经过牙周基础治疗后,随机分为实验组和对照组(各15例)。实验组采用引导牙周组织再生术,术中PRF联合Bio-oss植入骨缺损区并覆盖PRF膜;对照组仅采用单纯牙周翻瓣术。术后6个月回访,通过临床牙周指数检查及锥形束CT(CBCT)检查评价临床疗效。采用SPSS2.0软件包进行统计学分析。结果:2组患者术后牙周探诊深度(probing depth,PD)、临床附着丧失(clinical attachment loss,CAL)、根分叉水平探入深度(horizontal probing depth,HPD)均较术前显著改善(P<0.05),且2组间差异具有统计学意义(P<0.05);实验组术后根分叉区骨增量与对照组之间有显著差异(P<0.05)。结论:PRF联合Bio-oss明显促进牙周Ⅱ度根分叉病变区成骨,改善牙周状况,临床效果显著。

两种方法检测富组蛋白Ⅱ诊断恶性疟的比较

在海南疟区门诊对检测ＨＲＰ－Ⅱ诊断恶性疟的ＰａｒａＳｉｇｈｔ－Ｆ及ＩＣＴ两种方法进行了比较。ＰａｒａＳｉｇｈｔ－Ｆ方法的敏感度和特异度分别为１００％和８７．１％，ＩＣＴ则为９４．７％和９０．３％；两种方法均比显微镜检查简单易学，快速方便。但ＨＲＰ－Ⅱ仅存在于恶性疟。

恶性疟原虫重组HRP-Ⅱ蛋白的纯化及抗体制备

目的 制备抗恶性疟原虫HRP Ⅱ的多抗和单抗 ,为疟疾免疫诊断提供良好的材料。方法 Sephacryl 2 0 0柱层析分离纯化HRP Ⅱ融合表达蛋白 ;纯化蛋白免疫新西兰兔及BALB/c小鼠制备抗HRP Ⅱ多克隆抗血清 ,采用杂交瘤技术制备抗HRP Ⅱ单抗 ;测定所获抗体的效价及其特异性反应。结果 表达产物获得高度纯化 ,纯度达 86 2 1% ;制备的多克隆抗血清双扩效价为 1∶4～ 1∶16 ;获得 6株能稳定分泌抗HRP Ⅱ单抗的杂交瘤细胞株 ,其单抗亚型均为IgG1,各株单抗均与重组HRP Ⅱ蛋白发生特异性反应 ,但只有 3A3和 2E7能与天然HRP Ⅱ反应。结论 获得了敏感、特异的抗HRP Ⅱ多克隆抗血清及稳定分泌抗HRP

富亮氨酸糖蛋白高表达对TGF-β_1及TβR-Ⅱ的影响

目的探讨细胞中富亮氨酸糖蛋白(LRG)高表达对转化生长因子β1(TGF-β1)、转化生长因子受体体Ⅱ(TβR-II)的影响。方法设计构建pAcGFP1-C1-LRG质粒,设为转染组和对照组,转染组将pAcGFP1-C1-LRG质粒转染入U87脑胶质瘤细胞,分别于转染后48 h及72 h收集细胞,提取总RNA,应用Real-time PCR方法测定U87细胞中LRG、TGF-β1及TβR-Ⅱ的mRNA表达。结果 pAcGFP1-C1-LRG质粒转染入U87细胞后LRG表达明显增高,TGF-β1、TβR-II的表达明显高于对照组,且转染后72 h表达高于48 h,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 LRG在细胞内高表达能促进TGF-β1、TβR-II的表达。

Ni~Ⅱ-NTA修饰的银纳米粒/多孔硅芯片在线分离组氨酸标记蛋白和MALDI-TOF质谱检测(英文)

本文通过沉积在多孔硅表面的银纳米粒吸附对氨基苯硫酚和氨基的化学转化得到终端为NiII-Nα,Nα-二(羧甲基)-L-赖氨酸水合物-即NiⅡ-NTA体系的芯片。NiⅡ-NTA修饰的芯片被用于从高浓度的盐和助溶剂的缓冲体系中亲和捕获组氨酸标记的融合蛋白:thioredoxin-urodilatin和SUMO-hu-aprotinin,并进行在线的MALDI-TOF质谱检测,克服了MALDI-TOF质谱中直接点样污染物妨碍样品与基质共结晶的问题,避免了繁琐的离线样品预处理。芯片在线分离、纯化和MALDI-TOF质谱分析体系有望在复杂或原始体液的溶液中分析目标分子。

抗恶性疟原虫重组HRP-Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定

采用恶性疟原虫重组富组氨酸蛋白 (HRP- )融合表达蛋白免疫 BAL B/ c小鼠 ,取脾细胞与 SP2 / 0细胞融合 ,经 3次 EL ISA筛选 ,共获得 6株分泌抗恶性疟原虫重组 HRP- 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (1B11、1D10、2 E7、3A3、3F9、4G5 ) ,用有限稀释法进行克隆、亚克隆及扩大培养 ,并用杂交瘤细胞经腹腔接种 BAL B/ c小鼠制备腹水。 6株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体 (Mc Ab)经琼脂双扩散鉴定均为 Ig G1亚类 ,Dot- EL ISA及 Western blot分析显示 6株 Mc Ab都能与重组 HRP- 抗原发生特异性反应 ,但其中只有 2 E7和 3A3在 Dipstick免疫胶体金反应中能与恶性疟原虫培养上清中的天然 HRP-

恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白II部分基因的克隆和序列分析

目的：测定恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白 Ｉ Ｉ部分序列，了解该虫株与其它虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因序列的差异。方法：采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法特异性扩增 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因片段，并将该基因片段克隆于 Ｍ １３ 载体，用双脱氧链末端终止法进行测序，应用 Ｐ Ｃ Ｇ Ｅ Ｎ Ｅ软件对不同虫株恶性疟原虫 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ进行基因序列分析。结果：我国云南株恶性疟原虫与 ７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因有不同程度的差异，３ 虫株间 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ氨基酸序列同源性为７０．３％ ，核苷酸序列同源性为 ６８．６％ 。结论：云南株与７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因存在差异。

恶性疟原虫富组氨酸蛋白(HRP-Ⅱ)的表达和分离纯化

为获得大量具天然抗原活性的恶性疟原虫HRP-Ⅱ抗原,用摇瓶发酵工程菌,诱导β-半乳糖苷酶-HRP-Ⅱ融合蛋白表达;裂菌后,洗涤沉淀2～3次,用6M脲溶解;取上清经Sephacryl-200柱层析分离纯化目的蛋白,然后复性。结果重组蛋白以包涵体的形式高效表达;Sephacryl-200柱层析后,目的蛋白纯度达86％,91.48％被复性,被Dipstick即 ParsSight-F识别,表明该重组抗原纯度高,复性效果好,可用于恶性疟原虫 HRP-Ⅱ抗体的制备等研究。

Pyk2促进血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌细胞肥大

目的探讨富含脯氨酸蛋白酪氨酸激酶(Pyk2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导大鼠心肌细胞肥大的作用及其机制。方法提取大鼠乳鼠原代心肌细胞,随机分为对照组、AngⅡ诱导组(AngⅡ剂量为100 nmol/L,将其加入心肌细胞培养皿中刺激24 h)、Pyk2抑制剂PF-431396组(PF-431396剂量为10μmol/L,在AngⅡ刺激前30 min加入心肌细胞培养皿中)以及PF-431396干预AngⅡ诱导组(AngⅡ剂量为100 nmol/L,PF-431396剂量为10μmol/L)。用细胞骨架蛋白(α-actinin)免疫荧光染色检测心肌细胞表面积大小;real-time PCR检测心肌细胞中肥大指标(ANP和β-MHC) mRNA表达;Western blot检测心肌细胞p-Pyk2、Pyk2以及p53的蛋白表达。结果在AngⅡ刺激下,心肌细胞表面积增大(P<0. 05)、肥大指标的mRNA水平升高(P<0. 05)、p-Pyk2和p53的蛋白水平增加(P<0. 05);而加入Pyk2抑制剂PF-431396后,心肌肥大指标明显改善,p-Pyk2和p53的蛋白表达降低(P<0. 05)。结论 Pyk2通过p53信号通路促进AngⅡ诱导的大鼠心肌细胞肥大。

快速诊断靶蛋白恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ和疟原虫乳酸脱氢酶的热稳定性

在新型冠状病毒肺炎流行期间,通常需将血样进行56℃病毒灭活处理后再行病原体检测。为了解56℃灭活对血样中疟原虫抗原稳定性的影响,本研究收集2017-2019年上海市疾病预防控制中心上报的疟疾患者血样71份,其中恶性疟血样38份、三日疟血样8份、卵形疟血样11份、间日疟血样14份。应用快速诊断检测(RDT)试剂盒对56℃孵育30 min前后血样中恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(Pf HRPⅡ)和疟原虫乳酸脱氢酶(p LDH)的热稳定性进行测定。结果显示,热处理前T1检测线(检测目标Pf HRPⅡ)呈阳性的38份恶性疟血样,热处理后35份仍呈T1阳性(92.11%, 35/38,χ^(2)=3.123, P>0.05);热处理前T2检测线(检测目标pLDH)阳性的54份血样(26份恶性疟血样、6份三日疟血样、10份卵形疟血样和12份间日疟血样),经热处理后T2均呈阴性(阳性率为0, 0/54,χ^(2)=87.755, P<0.01)。表明在56℃孵育30 min条件下,Pf HRPⅡ的稳定性较好;p LDH不稳定,全部降解或失活。因此,应用RDT检测热处理后的血样,恶性疟血样的检测结果不受影响,但非恶性疟血样会被漏诊。

自体激活富血小板血浆干预兔骨髓间充质干细胞体外成软骨分化的研究

背景:自体富血小板血浆激活后可释放多种生长因子,可以促进骨髓间充质干细胞的增殖与分化。目的:观察自体激活富血小板血浆对体外培养的兔骨髓间充质干细胞向成软骨细胞分化的影响。方法:取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞;取第3代骨髓间充质干细胞,分别应用体积分数10%自体激活富血小板血浆和体积分数10%胎牛血清培养液进行体外培养,观察其向成软骨细胞分化情况。结果与结论:分离培养的兔骨髓间充质干细胞呈长梭形,传代后细胞生长迅速。流式细胞仪检测发现第3代细胞高表达CD29、CD44,而低表达CD45。免疫荧光细胞化学染色显示经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞表达Ⅱ型胶原;实时荧光定量PCR检测发现经自体激活富血小板血浆诱导的骨髓间充质干细胞Ⅱ型胶原α1链基因和聚集蛋白聚糖基因表达明显高于经胎牛血清诱导的骨髓间充质干细胞(P<0.01)。可见自体激活富血小板血浆具有促进兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞方向分化的潜能。

自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫HRP-II抗原的评价

目的对自制免疫层析试剂盒检测恶性疟原虫富组氨酸蛋白II(HRP-II)的敏感性、特异性、稳定性等技术参数进行评价,为试剂盒的临床应用提供科学依据。方法对试剂盒的敏感性、特异性、灵敏度、精密度、稳定性等性能指标进行测定,并与国外的同类试剂盒进行比较研究。结果自制试剂盒操作简便,反应快速;以血涂片显微镜检查为金标准,对49例恶性疟血样、30例间日疟血样、43例正常人血样检测的敏感性为98%,特异性为100%;对恶性疟原虫血样的最小检出量为原虫密度0.01%,对重组HRP-II蛋白的最小检出量为10ng/ml;试剂盒精密度和稳定性均较好;各项性能指标相当或优于国外同类试剂盒。结论自行研制的恶性疟原虫免疫层析检测试剂盒测定结果较为准确、稳定和可靠,适用于恶性疟的快速诊断、流行病学筛查、疟区献血员筛查及过境边民筛查。

检测恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的疟疾诊断免疫层析试条的研制与评价

目的建立一种快速、简便的诊断恶性疟的胶体金免疫层析试条方法，并对其进行评价。方法克隆、表达恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ基因，以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备单克隆抗体，筛选恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ特异的单克隆抗体．分别作为包被抗体和标记抗体．制备免疫层析试条。用该试条检测流行区非疟疾发热患者血样80份、内脏利什曼病患者血样20份和确诊的间日疟患者血样75份以评价其特异性：检测确诊的恶性疟患者血样89份．以评价其敏感性。结果成功克隆并表达了恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ．用重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体．采用杂交瘤技术共筛选出5株能高效分泌特异抗体的细胞株（效价为1：12800～1：102400），抗体亚类均为IgG1。所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白组分．而与疫区非疟疾发热患者的红细胞组分无交叉反应。以筛选到的单克隆抗体制备的免疫层析试条检测疫区非疟疾发热患者、内脏利什曼病患者和间日疟患者血样的特异度为97．7％（171／175），其中20份内脏利什曼病患者血样全部为阴性。检测恶性疟患者血样敏感度为95．5％（85／89）。结论制备了能识别天然恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ的特异性单克隆抗体，以此单抗为基础研制出的快速诊断恶性疟的胶体金免疫层析试条敏感度、特异度均较高。

不同浓度富血小板血浆修复兔膝骨关节炎软骨缺损的比较

背景:体内和体外的研究均表明,富血小板血浆对促进软骨细胞增殖和组织再生修复起重要作用,但对于不同浓度富血小板血浆修复兔膝骨关节炎软骨缺损的研究较少。目的:比较不同浓度富血小板血浆修复兔膝骨关节炎软骨缺损的效果,为临床治疗膝骨关节炎软骨损伤提供理论依据和选择方案。方法:50只健康新西兰大白兔随机被分为空白组、模型组、富血小板血浆低浓度、中浓度、高浓度组,每组10只。二次离心法制备富血小板血浆。除空白组以外,各组采用改良Hulth法制备兔膝骨关节炎模型。模型组在关节腔注射0.3 mL生理盐水,富血小板血浆低浓度、中浓度、高浓度组分别注射浓度为(1.0-1.2)×10^(12)L-1、(1.5-1.7)×10^(12)L-1、(2.0-2.2)×10^(12)L-1的富血小板血浆。采用ELISA法检测关节液中相关炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6的表达;苏木精-伊红染色、甲苯胺蓝染色和Mankin’s病理评分来评估不同浓度富血小板血浆修复膝骨关节炎软骨缺损后的组织学变化;Western blot和RT-PCR检测关节软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖的蛋白及mRNA表达水平。实验方案经中国医科大学动物实验动物福利与伦理委员会批准。结果与结论:①与模型组比较,富血小板血浆各浓度组相关炎症因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6的水平均有所下降(P<0.05),中浓度组表达水平少于低浓度组和高浓度组(P<0.05);②苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色结果显示,富血小板血浆低浓度组和高浓度组软骨细胞形态较规则,数量有所增加,中浓度组软骨细胞排列较整齐,有软骨样细胞形成,软骨细胞修复效果明显;③Mankin’s病理评分结果,模型组最高,其次富血小板血浆低浓度和高浓度组,中浓度组评分最低;④Western blot和RT-PCR结果显示,与模型组比较,富血小板血浆各浓度组软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖蛋白和mRNA表达水平明显增加(P<0.05),中浓度组表达明显高于低浓度组和高浓度组(P<0.05);⑤结果说明,不同浓度富血小板血浆均能有效抑制兔膝骨关节炎过程中相关炎症因子的表达,对膝骨关节炎软骨缺损有明显修复作用,以(1.5-1.7)×10^(12)L-1浓度富血小板血浆修复效果更理想。

恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ全编码区基因的真核克隆及表达

目的 探讨恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ (Histidine richproteinⅡ ,HRPⅡ )基因在真核细胞中的表达。方法 应用聚合酶链反应 (PCR)扩增HRPⅡ全编码区基因 ,经HindⅢ和BamHI双酶切后定向克隆入带CMV启动子的真核高效表达载体 pcDNA3,构建HRPⅡ /pcDNA3重组载体 ;用脂质体法将重组载体转染HepG2肝癌细胞 ,经G418加压筛选后 ,收集阳性克隆细胞培养上清 ,表达产物进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析。结果 成功构建HRPⅡ / pcDNA3真核表达载体 ,SDS PAGE和Western免疫印迹分析表明 ,HRPⅡ表达产物相对分子质量约 35 0 0 0 ,呈分泌性表达 ,且表达产物能被抗HRPⅡ单克隆抗体特异识别。

单克隆抗体3A3、2E7用于恶性疟Dipstick检测的初步研究

目的 建立一种快速、简便 ,适用于基层的恶性疟免疫诊断方法。 方法 将抗恶性疟原虫 HRP- 的单克隆抗体 3A3、2 E7纯化后经配对筛选 ,利用 Dipstick-免疫胶体金技术 ,制成诊断恶性疟的 Dipstick层析条。用该层析条对 115份疟疾患者血样 ,2 0份非疟疾病人血样及 10份正常人血样进行检测 ,评价其敏感性和特异性 ,并对其稳定性、重复性等进行了初步研究。 结果 用该法检测 145份血样 ,其对恶性疟的敏感性和特异性分别为 83.1%及 97.5 % ,已包被抗原、抗体的 Dipstick条在 4℃及室温下可保存 3个月以上 ,对 30份血样重复检测 4次结果完全一致。 结论 Dipstick-免疫胶体金模式快速、简便 ,适用于基层应用 。