牦牛基因组微卫星富集文库的构建与分析

根据生物素与链亲和素的强亲和性原理 ,用链亲和素磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针(CA) 12 、(CCG) 8、(CAG) 8、(TTTC) 8退火结合的含有接头和牦牛微卫星序列的单链限制性酶切片段 ,获得单链目的片段 ,经PCR扩增形成双链 ,然后克隆到pMD18 T载体上 ,转化至DH5α中 ,首次成功构建牦牛基因组微卫星富集文库。测序结果发现 ,阳性克隆率为 77% (37/ 4 8) ,说明构建的牦牛基因组微卫星富集文库是一个高质量的文库。牦牛富集微卫星文库的建立和牦牛微卫星的筛选将为下一步进行牦牛基因组结构的分析、牦牛遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究、标记辅助选择以及经济性状的QTL定位提供大量的微卫星标记。

富集文库—菌落原位杂交法筛选栉孔扇贝的微卫星标记

应用微卫星富集文库——菌落原位杂交法，筛选得到了40个栉孔扇贝的微卫星标记。用固定了（AG）15和（AC）15探针的尼龙膜（HybondN^＋）捕捉含有微卫星DNA的片段，经洗脱、PCR扩增和TA克隆，构建栉孔扇贝的微卫星富集文库。利用ECL试剂盒（Amersham公司）标记的（AG）15和（AC）15探针进行菌落原位杂交筛选微卫星富集文库，阳性克隆经测序获得微卫星DNA。富集文库中1200个重组克隆经过菌落原位杂交后，532个（44．3％）为阳性克隆。任意挑选100个克隆测序，结果显示所有的克隆都至少含有一个微卫星位点。利用软件设计了65对特异性PCR引物，40对能扩增出清晰的带谱；利用48个栉孔扇贝个体评价微卫星位点，分析表明37个位点具有多态性。不同的位点获得的等位基因数目为2～14个不等，37个多态性位点共获得258个等位基因，平均每个位点获得7．0个等位基因。观测杂合度（H0）、期望杂合度（HP）及多态性信息含量值（P配）的范围分别为0．1000-1．0000、0．1197-0．9831和0．1172-0．9782。结果表明，富集文库一菌落原位杂交法适合大规模筛选目标物种的微卫星标记。

脊尾白虾微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

采用人工合成的生物素标记(AG)15探针及磁珠富集法构建了脊尾白虾基因组微卫星富集文库。将脊尾白虾基因组DNA经HaeⅢ酶切后,收集400～1 200 bp片段,连接特定接头,与生物素标记(AG)15探针杂交并捕获含有微卫星的DNA片段,然后连接到pMD18-T载体中,构建脊尾白虾微卫星富集文库。随机挑取947个克隆,经菌落PCR检验,其中667个为阳性克隆。从阳性克隆中随机选取184个克隆进行测序,有150个克隆含有微卫星序列,共获得199个微卫星序列,其中完美型158个(79.4%),非完美型27个(13.6%),复合型14个(7.0%)。根据微卫星序列,设计了119对微卫星引物,64对扩增出稳定的具有特异性的条带,经30个脊尾白虾个体进行多样性评价后,有26个位点表现出多态性。26个微卫星位点获得的等位基因数从3～16个不等,平均每个位点扩增得到6.5个等位基因。观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)及多态性信息含量值(PIC)的范围分别为0.111～0.929、0.246～0.932、0.231～0.909。本研究开发的微卫星位点将为脊尾白虾种群多样性研究、家系识别和种质鉴定提供有效的工具。

地黄微卫星富集文库构建及特性分析

应用Dynal磁珠-生物素标记的微卫星探针(AC)8,(AG)8和(ATG)12与地黄基因组DNA酶切片段杂交,捕获含有微卫星序列的DNA片段,连接到pMD 18-T载体上,转入感受态细胞Trans 5α,构建地黄富集微卫星文库。利用M 13 F和M 13 R载体序列引物筛选文库,对插入片段长度为400～800 bp的克隆进行测序。共获得96条序列,48条(50%)含有微卫星位点,其中完美型占66%,非完美型22%,混合型12%。微卫星重复基元中,二核苷酸(AG)n和三核苷酸(CAT)n最为常见。

三角帆蚌微卫星富集文库的构建、鉴定及多态性分析

通过磁珠富集法构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)微卫星富集文库。共获得800个阳性克隆,其中的100个阳性克隆经测序分析,共获得微卫星序列54个。利用这些微卫星序列可设计33对引物,经过PCR扩增筛选获得了25对可用引物。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对洞庭湖1个种群的30只三角帆蚌进行扩增,发现13对引物呈现多态性,等位基因数在4～9。观测杂合度在0.2543～0.9827,期望杂合度在0.3629～0.8217,信息多态含量平均为0.5198。由于存在无效等位基因,两个微卫星基因座(GenBank登录号为GQ302651和GQ302658)明显地偏离哈代-温伯格平衡,但没有发现连锁不平衡现象。这说明利用磁珠富集法构建的三角帆蚌微卫星文库质量较好,13对多态性微卫星引物可为三角帆蚌微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、分子标记辅助育种以及经济性状的QTL定位提供帮助。

两种书虱微卫星富集文库的构建及比较

利用链霉亲和素与生物素之间的强亲和性原理,将链霉亲和素偶联的磁珠与微卫星探针(AC)12、(TC)12、(ATC)8、(ATG)8、(AAC)8、(ATAC)6及(GATA)6退火结合后,再亲和捕捉含接头和微卫星序列的单链书虱基因组DNA限制性酶切目的片段,经PCR扩增形成双链后进行克隆、建库。成功构建了嗜卷书虱和嗜虫书虱共13个微卫星富集文库,包括6个嗜卷书虱文库,7个嗜虫书虱文库,其平均阳性克隆率为71.17%。经检测发现共得到两种书虱260个微卫星位点。这两种书虱微卫星富集文库的建立和高多态性微卫星位点的筛选将为嗜卷书虱和嗜虫书虱的种群遗传与进化、基因连锁图谱构建、分子系统发育研究等提供大量分子遗传标记,对其在实仓中的持续控制提供遗传学信息。

三疣梭子蟹微卫星富集文库的构建与群体遗传分析

采用富集文库–菌落原位杂交法分离了30个三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的微卫星标记。三疣梭子蟹基因组DNA经HaeⅢ酶切连接后,用固定了（AC）15和（AG）15探针的尼龙膜（Hybond N＋）捕捉含有微卫星的片段,转化至大肠杆菌DH5α中,构建三疣梭子蟹微卫星富集文库。菌落原位杂交后,任意选取150个克隆进行测序,阳性克隆率为85.48%。利用软件设计了105对微卫星引物,筛选到稳定扩增标记56对,采用30个三疣梭子蟹个体进行多样性评价,30个位点均表现出多态性。观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）及多态性信息含量（PIC）的范围分别为0.222 2-1.000 0、0.436 7-0.909 9和0.350-0.892。本研究筛选的微卫星位点将为下一步三疣梭子蟹遗传多样性分析、家系分析、遗传图谱构建和QTL定位等研究提供基础依据。

胭脂鱼微卫星富集文库的构建及其应用前景展望

以湖北武汉和四川宜宾人工增殖放流的胭脂鱼子一代酒精浸泡鳍条样本为材料,提取完整基因组DNA,选用人工合成的生物素标记(AAAG)7探针,采用FIASCO(fast isolation by AFLP of sequences containing repeats)磁珠富集法构建胭脂鱼(Myxocyprinus asiaticus)微卫星富集文库。以MseI-N引物组和设计合成的微卫星核心序列引物(AAAG)5,用双引物PCR法筛选含有微卫星的阳性克隆,从54个阳性克隆中共获得22个微卫星序列,其中完美型(perfect)共15个(占68.2%),非完美型(imperfect)6个(占27.3%),混合型(compound)1个(占4.5%);(AAAG/TTTC)n序列在胭脂鱼的基因组DNA中含量非常丰富。根据微卫星侧翼序列最终设计并合成了18对胭脂鱼微卫星引物,经其有效性检验后,可应用于胭脂鱼遗传多样性、种群遗传结构等进一步研究及人工增殖放流效果评估。

藏酋猴微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选

通过磁珠富集法构建了藏酋猴AC重复和AAAG重复的微卫星富集文库,分离微卫星序列并对其进行分析。将藏酋猴基因组DNA经Sau3AI酶切后纯化回收,连接特定接头。用生物素标记的探针与酶切片段杂交,捕获300～1000bp片段,随后将获得的片段连接到pMD-19T载体上,转化至JM109中,成功构建藏酋猴微卫星富集文库。(AC)n富集文库和(AAAG)n富集文库的阳性克隆率分别为50%和10%左右。根据测序得到的48个微卫星序列成功设计了24对引物,最终筛选出6个微卫星标记,这些标记将为藏酋猴的遗传多样性研究、圈养种群结构的分析和遗传图谱的构建等奠定一定的基础。

中国地鼠基因组微卫星富集文库的构建与分析

目的筛选中国地鼠微卫星位点,为中国地鼠种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。方法中国地鼠基因组DNA经超声打碎,用2%琼脂糖凝胶电泳回收500～1000 bp的DNA片段,与SNX连接头连接,连接产物与生物素标记的14种微卫星探针变性及退火,再通过链亲和素偶联磁珠亲和捕捉,经吸附、洗涤及洗脱,然后以洗脱产物为模板,通过PCR扩增,与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH10B,构建中国地鼠微卫星DNA富集文库。结果测序结果发现,微卫星DNA序列的阳性克隆占70.3%。结论中国地鼠微卫星文库的建立和微卫星的筛选将为下一步进行中国地鼠遗传连锁图谱的构建、分子进化和系统发育研究提供大量的微卫星标记。

东方粘虫(Pseudaletia separata(Walker))微卫星富集文库的构建与分析

根据生物素与链亲和素的强亲和性原理，用包被链亲和素的磁珠亲和捕捉与生物素标记的微卫星寡核苷酸探针（CA）15 （GA）15、（GTT）12、（GAT）12、（TAGA）3和（GTGA）。退火结合的含接头和微卫星序列的单链粘虫基因组DNA限制性酶切片段，获得单链目的片段。经PCR扩增形成双链后连接到pGEM—T载体上，再转化到DH5α热感受态细胞中，首次成功构建粘虫基因组微卫星富集文库。随机抽样（16次抽样，每库共12—114个克隆）测序发现，6个文库总的微卫星阳性克隆率30．07％，CA／GAT／GTT等3个文库的阳性克隆率达到40％以上。单次抽样最高阳性克隆率达到56％。粘虫微卫星富集文库的建立和高多态性微卫星单拷贝位点的筛选将为粘虫的生态遗传学研究、连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究等提供大量遗传标记，对昆虫迁飞的分子生态研究也有重大意义。

云南松基因组微卫星富集文库的构建

采用磁珠富集法构建云南松微卫星富集文库。云南松基因组DNA经RsaⅠ酶切,与特定接头连接,再用接头特异引物进行PCR扩增。连接扩增产物与用生物素标记的(AG)12、(AT)12、(CG)12、(GT)12、(ACG)12、(ACT)12和(CCA)8探针杂交,通过链霉亲和素偶联的磁珠捕捉含接头和微卫星序列的片段并扩增,将获得的片段连接到pMD-19T载体上,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,成功构建了云南松微卫星富集文库。通过PCR检测从文库中筛选阳性克隆,在383富集阳性菌落中获得阳性克隆257个,经测序分析,在获得的159条序列中,有143条含有SSR,其中完美型占65.73%,非完美型占23.78%,混合型占10.49%。结果表明,磁珠富集法构建云南松基因组微卫星文库高效、可行的,文库的构建为微卫星位点的分离、遗传多样性的分析等奠定基础。

野生稻基因组抗性基因富集文库的构建

通过集成候选抗性基因克隆技术和磁珠富集文库技术以及可转化基因组文库技术,提出了基于野生稻基因组富集文库克隆野生稻新抗性基因的策略。包括构建野生稻可转化基因组文库,利用RecA重组蛋白介导生物素标记的探针对文库进行磁珠富集,构建野生稻基因富集文库,然后对富集文库的克隆进行鉴定分析,包括点杂交和克隆末端测序分析,最后对富集文库的阳性克隆进行全序列测定和功能验证。按照上述方法,构建了东乡普通野生稻和小粒野生稻可转化基因组文库,库容量分别达到1.58×105和2.68×105个克隆,进而构建了东乡野生稻基因组候选抗性基因富集文库,单克隆总数1 152个,对富集文库的菌落原位杂交筛选获得12个阳性克隆,对其中5个阳性克隆全序列测定结果表明,4个阳性克隆含有已克隆抗性基因的保守序列,证实构建候选抗性基因富集文库克隆野生稻新抗性基因的策略是可行的。

鹅基因组微卫星富集文库的构建与分析

为分离鹅(Anser cygnoides)微卫星序列片段,提取鹅基因组DNA,用Hae III和Rsa I内切酶消化并连接接头,再用接头特异引物进行PCR扩增。扩增产物与生物素标记的(AC)12探针杂交,杂交复合物用链霉亲和素包裹磁珠进行结合,得到单链DNA目标片段。再经PCR扩增,连接pMD19-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星富集小插入片段DNA文库。用Colony-PCR法筛选获得318个阳性克隆,并进行测序分析。结果表明,所测的318个序列有242个含微卫星序列,197个为有效微卫星序列,其中完全型(perfect)占60.9%,非完全型(imperfect)20.8%,混合型(compound)18.2%。(CA)n重复最为常见。文章为鹅种资源遗传多样性、分子进化、遗传图谱的构建及重要经济性状基因座定位等研究奠定了基础。

杜鹃基因组微卫星富集文库的构建

利用FIASCO方法(Fast Isolation by AFLP Sequences COntaining repeats)构建杜鹃(Rhododendron simsii Planch.)的(AG)n微卫星富集文库。通过菌液PCR检测,从(AG)n微卫星富集文库的356个阳性菌落中筛选了233个进行测序分析。结果表明,202个序列富含SSR位点,阳性比率达86.7%。去除杂峰、叠峰、信号弱的序列,最终筛选39个供后续引物开发使用,其中完美型SSR有22个,不完美型5个,混合型12个。磁珠富集法构建杜鹃基因组微卫星文库是一条高效可行的途径,为微卫星位点的分离、杜鹃种群遗传多样性和遗传结构的研究奠定了基础。

RecA蛋白介导的小粒野生稻STK类抗性基因富集文库的构建

利用RecA蛋白的同源重组特性,以生物素标记的STK类抗性基因PCR扩增产物为探针,对小粒野生稻DNA文库进行富集,构建了库容量为1 710个的STK类抗性基因富集文库,通过菌落原位杂交筛选获得21个阳性克隆.其中10个阳性克隆进行了两端测序,生物信息学分析表明:有3个阳性克隆可分别定位于粳稻抗性基因附近和抗性基因内,可能是新的候选抗性基因;有2个阳性克隆可以在粳稻上定位,但周围无抗性基因片段;其它5个阳性克隆由于与栽培稻有多处匹配,不能精确定位。

甜叶菊微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

甜叶菊是我国一种重要特种经济作物,其分子标记相关遗传背景研究甚少。本研究基于生物素与链霉亲和素的强亲和性原理,用链霉亲和素顺磁颗粒捕捉人工合成的标记有生物素的寡核苷酸探针(AG)15,间接筛选出含有甜叶菊基因组微卫星序列的DNA酶切片段,将筛选得到的片段连接到pUC-T载体中,构建甜叶菊微卫星序列的富集文库。挑取354个克隆进行菌落PCR检验,从中筛选出158个阳性克隆进行测序。结果表明,134个(84.81%)克隆中含有微卫星序列,其中完美型85个(63.43%)、非完美型15个(11.19%)、复合型34个(25.38%)。根据微卫星序列共设计出71对微卫星引物,其中62对能扩增出稳定的条带。利用24个甜叶菊品系对这62对引物的遗传多样性的分析表明,有16个位点表现出多态性,等位基因数为2～8个,平均每个位点扩增得到4.5个等位基因,多态性信息含量在0.3163～0.7595之间,观测杂合度(Ho)与期望杂合度(He)的范围分别为0.2174～0.9167与0.3555～0.8076。通过聚类分析,将甜叶菊分为大小叶两大类。本研究开发出的微卫星标记可为甜叶菊的分子遗传育种提供有效的遗传标记。

藏羚羊(AAC)_n微卫星富集文库构建与引物筛选

基于磁珠富集法，利用生物素标记的寡核苷酸探针（AAC）8从藏羚羊（Tibetan antelope）基因组酶切的300—1000bp片段中筛选微卫星位点，纯化的富集片段连接到pCR@2．1载体和转化到Trans5α感受态细胞．随机挑取180个白斑克隆，PCR检测到条带数大于或等于2的阳性克隆为56个，阳性率为31．1％．对阳性克隆测序，获得43条含微卫星座位的序列，微卫星重复次数在5～20次之间．舍弃不适宜设计引物的微卫星座位，试验设计并合成了20对微卫星引物；以3个样点（青海、新疆、西藏）的24个藏羚羊基因组为模板进行PCR扩增，获得8对可得到稳定扩增产物的微卫星引物，其中4对引物的扩增产物具有多态性，座位分别为AAC050、AAC056、AAC165和AAC477．上述引物可用于藏羚羊及近缘物种的遗传多样性、种群遗传结构等研究．

岩原鲤微卫星富集文库的构建及微卫星分子标记的筛选

用磁珠富集法构建了岩原鲤Procypris rabaudi AC重复和GATA重复的微卫星富集文库。采用PCR方法分别以人工合成的oligoA和探针(AC)12或(GATA)6为引物筛选含有微卫星的阳性克隆。(AC)n富集库和(GA-TA)n富集库的阳性克隆率分别为30%和7%左右。对40个AC重复的阳性克隆和30个GATA重复的阳性克隆测序,共获得61个微卫星序列,其中包含了一个三碱基重复(TGA)的微卫星序列。选择设计了19对AC重复和16对GATA重复的微卫星引物以及1对TGA重复的微卫星引物,通过PCR优化,共有20对引物能够产生稳定、清晰的目的产物带。为了检测获得的岩原鲤微卫星座位是否能用于近缘物种的研究,我们将20对岩原鲤微卫星引物用于中华倒刺鲃Spinibarbus sinensis基因组DNAPCR扩增,有60%的引物对能产生特异性的目的条带。本研究获得的20个岩原鲤微卫星座位可以用于岩原鲤及近缘物种的遗传多样性、种群遗传结构等的进一步研究。

富集文库-菌落原位杂交法筛选仿刺参微卫星标记

应用微卫星富集文库—菌落原位杂交的方法,筛选得到了33个仿刺参的微卫星标记。富集文库中900个重组克隆经过菌落原位杂交后,415个(46.1%)为阳性克隆。随机挑取100个阳性克隆进行测序,结果显示这些克隆都含有微卫星位点。设计了57对特异性PCR引物,33对能扩增出清晰的条带。利用48个野生仿刺参个体对33个微卫星位点进行评价,结果显示位点都具有多态性。33个多态位点共获得222个等位基因,平均每个位点获得6.7个等位基因。观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的范围分别为0.050 0~1.000 0和0.203 2~0.915 9。结果表明,富集文库—菌落原位杂交法筛选微卫星标记比较高效,获得的微卫星标记可以用于仿刺参的分子遗传学研究。