Livin基因反义寡核苷酸诱导肺腺癌A549细胞的凋亡

目的:探讨Livin基因反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)对肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的影响。方法:用阳离子脂质体介导LivinASODN转染A549细胞后,MTT法检测对A549细胞增殖抑制率的影响;RT-PCR法和细胞免疫荧光化学检测LivinASODN转染前后,A549细胞中Livin mRNA和蛋白表达的变化;吖啶橙/溴乙锭(acridine orange/ethidium bromide,AO/EB)复合染色检测A549细胞的凋亡率。结果:在A549细胞中同时有Livinα和Livinβ的表达,Livin蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。Livin基因ASODN可显著抑制A549细胞的增殖(P<0.01),且作用具有剂量依赖性。终浓度为400nmol/L的Lip-ASODN转染后,A549细胞Livin mRNA和Livin蛋白的表达均被明显抑制,细胞凋亡率达(31.25±5.75)%,与对照组(3.23±1.98)%相比差异有统计学意义(P<0.01)。结论:LivinASODN可下调Livin基因表达,有效抑制A549细胞的增殖,并促进A549细胞凋亡。因此,Livin基因有望成为肺癌基因治疗的新靶点。

Survivin反义寡核苷酸联合AsI_3-cys对K562细胞凋亡的影响

目的:探讨Survivin反义寡核苷酸(ASODN)联合AsI3-cys对K562细胞增殖的抑制作用和细胞凋亡的诱导作用。方法:K562细胞体外培养,人工合成并硫代修饰Survivin ASODN,通过脂质体转染进入K562细胞,同时与AsI3-cys联用,MTT法检测细胞增殖抑制程度,Tunel法检测细胞凋亡指数,RT-PCR检测细胞中Survivin mRNA的表达水平,流式细胞仪检测细胞周期的变化和细胞凋亡率。结果:Survivin ASODN各浓度组对K562细胞的增殖有明显的抑制作用,能明显诱导细胞凋亡,联用组诱导K562细胞凋亡的能力与其他组相比在统计学上差异有显著性。结论:Survivin ASODN能够诱导K562细胞凋亡,并提高K562细胞对AsI3-cys的敏感性。

血管内皮生长因子受体启动子驱动双自杀基因联合survivin反义寡核苷酸对结直肠癌细胞及血管内皮细胞的特异性杀伤作用

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子受体（KDR）启动子驱动的CDglyTK融合基因（AdKDR-CDsbrTK）体系联合survivin反义寡核苷酸（ASODN）对结直肠癌细胞（sw620）及血管内皮细胞（ECV304）的特异性杀伤作用。方法将质粒pAdEasy—KDR-CDglyTK在293细胞内包装、扩增产生重组腺病毒。体外感染表达KDR的SW620、ECV304细胞株，同时用survivin ASODN转染同一细胞株，观察腺病毒的感染效率和ASODN的转染情况。应用RT．PCR和Western印迹检测CDglyTK和survivin基因的表达．MTT法测定两者联合应用对细胞株的杀伤效应和旁观者效应。结果survivin ASODN可转染重组腺病毒感染的细胞，并且两者的转染及感染效率无明显变化。CDglyTK可在SW620、ECV304细胞株高效表达。survivin ASODN可明显降低survivin蛋白表达。各基因治疗组细胞存活率明显低于阴性对照组（P〈0．001）。survivinASODN与AdKDR—CDglyTK基因联用后。随着前药浓度的增加，细胞存活率迅速下降，两者联合作用与单一基因作用相比，差异具有统计学意义（P〈0．05）。但在GCV100μg／ml、5-FC 2000μg／ml时，联合基因治疗组细胞存活率略低于单用AdKDR-CDglyTK，两者间差异无统计学意义（P〉0．05）。Survivin ASODN和AdKDR—CDglyTK联合作用，在前药浓度较低时表现为协同效应，并具有更明显的旁观者效应。结论KDR启动子调控的AdKDR-cDglyTK体系和survivin ASODN基因联合，较单一基因具有更强的特异性杀伤结直肠癌细胞及血管内皮细胞的作用。

包裹反义寡核苷酸的BCA纳米粒抑制C6脑胶质瘤细胞生长的实验研究

目的优化制备包裹反义寡核苷酸（ASODN）的α-氰基丙烯酸正丁酯（BCA）纳米粒，观察其对C6脑胶质瘤细胞的生长抑制作用。方法以BCA为载体材料，采用界面聚合法制备包裹ASODN的纳米粒（ASODNinNP）．并将其转染至C6脑胶质瘤细胞；倒置显微镜下观察游离ASODN组、ASODNinNP组、吸附ASODN纳米粒组和空白纳米粒组转染C6脑胶质瘤细胞后的细胞生长状态．流式细胞仪（FCM）检测细胞周期变化，采用CCK．8法测定ASODNinNP对细胞毒性和细胞增殖的影响。结果与空白对照组相比．除空白纳米粒组外．其他各组转染后的C6脑胶质瘤细胞形态均发生改变，细胞失去原有的贴壁特性，生长密度降低，生长状态变差，其中以ASODNinNP组最为明显．呈时间依赖性；各组细胞周期均发生变化，表现为G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例减少，其中ASODNinNP组最为显著（P〈0．05）；除空白纳米粒组外，各纳米粒组对细胞增殖的抑制效应随ASODN相对终浓度的增加而增加，呈现浓度依赖性特征，其中ASODNinNP组抑制效应显著优于其他各组（P〈0．05）。结论ASODNinNP转染C6脑胶质瘤细胞后能有效抑制细胞增殖及改变细胞周期，对胶质瘤细胞生长有明显抑制作用。

反义寡核苷酸对K562细胞增殖和端粒酶活性的影响

目的 研究靶向封闭端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的反义硫代寡核苷酸（ASPSODN）对K562细胞目的 基因的抑制及其对端粒酶活性及细胞增殖周期和凋亡的影响.方法 ASPSODN转染到人类红白血病细胞株K562,采用MTT法、酶联免疫吸附（ELISA）法和流式细胞术（FCM）检测K562细胞的增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变,RT-PCR检测hTERT mRNA的表达.结果 0.6μmol/L的ASPSODN（0.42±0.16）能明显下调hTERT表达（P〈0.05）,端粒酶相对活性降至52%;MTT法检测显示明显抑制K562细胞增殖活性;FCM显示细胞凋亡率为10.31%,PI染色显示细胞被阻止在G1/G0期,S期及G2/M期的细胞减少,但无特征性的凋亡峰.结论 ASPSODN靶向hTERT能特异性抑制K562细胞hTERT mRNA的表达,明显下调端粒酶活性,抑制K562细胞增殖,并通过降低细胞的端粒酶活性而诱发细胞凋亡.

肺癌反义核苷酸治疗的研究进展

肺癌是全世界高发肿瘤之一，而反义寡核苷酸（ASON）作为一个简单有效的基因治疗手段已受到广泛的关注。就肺癌反义核苷酸治疗的原理、特点及在肺癌癌基因治疗方面的应用进行综述。

反义血管内皮生长因子C转染对人胃癌细胞SGC-7901成瘤性和脉管生成的影响

目的观察反义血管内皮生长因子C(antiVEGF-C)基因转染对人胃癌细胞系SGC-7901成瘤性和脉管生成的影响,探讨VEGF-C在脉管新生和胃癌转移中的作用。方法30只BALB/c裸鼠随机分为转染antiVEGF-C组、转染空白质粒组及未转染质粒组(n=10),采用皮下注射分别转染antiVEGF-C基因、转染空白质粒及未转染质粒的SGC-7901细胞悬液0.2ml(1×107/ml),每2d注射1次,连续3次,观察裸鼠皮下肿瘤的生成速度,并对肿瘤组织中的微淋巴管及微血管密度进行检测。结果转染antiVEGF-C组裸鼠肿瘤生长速度明显减慢且瘤体较小。注射后第1、2、3周,转染antiVEGF-C组肿瘤组织中微淋巴管密度分别为4.0±2.2、6.0±3.1、9.0±2.7每高倍视野(/HF),转染空白质粒组分别为6.0±8.7、9.0±3.5、18.0±7.2/HF,未转染质粒组分别为7.0±4.9、9.0±6.4、19.0±6.5/HF,转染antiVEGF-C组肿瘤组织中微血管密度分别为3.0±2.4、5.0±2.1、8.0±1.7/HF,转染空白质粒组分别为4.0±1.8、6.0±2.7、10.0±1.3/HF,未转染质粒组分别为4.0±1.5、6.0±1.3、9.0±1.2/HF。转染antiVEGF-C组肿瘤组织中新生微淋巴管较未转染质粒组及转染空白质粒组明显减少(P<0.05),但新生微血管的数量与其他两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论antiVEGF-C转染对人胃癌细胞SGC-7901的成瘤性及淋巴管生成有明显抑制作用,但对肿瘤新生血管的形成影响不大。VEGF-C可能参与了胃癌新生淋巴管的形成过程。

超声介导TFO脂质超声微泡对TFO的细胞吸收率及组织因子表达的影响

目的探讨超声作用下脂质超声微泡对反向硫代磷酸酯寡核苷酸(TFO)的细胞吸收率及内皮细胞组织因子(TF)表达的影响。方法合成针对切应力反应元件基因序列的GT21-apsTFO,并构建携带TFO的脂质超声微泡。将ECV304细胞分为4组:空白对照(SSRE)组,仅接受切应力作用6h;TFO+超声辐照(TFO+U)组,取60μlTFO(终浓度0.2μmol/L)加入细胞,同时给予超声辐照30s;TFO-脂质微泡(TFO-M)组,取60μl携带TFO脂质超声微泡(终浓度0.2μmol/L)加入细胞;TFO-脂质微泡+超声辐照(TFO-M+U)组,取60μl携带TFO脂质超声微泡(终浓度0.2μmol/L)加入细胞,同时给予超声辐照30s。后三组进行TFO转染后24h接受切应力(压强1.2Pa)作用6h。荧光显微镜观察TFO的细胞吸收率,免疫荧光法和RT-PCR分别检测TF蛋白和mRNA的表达。结果TFO-M+U组的TFO转染效率(38.83%±6.52%)高于TFO-M组(9.50%±2.88%)和TFO+U组(12.66%±3.01%,P<0.01),后两组间无显著差异。与SSRE组比较,TFO+U组、TFO-M组和TFO-M+U组中TF蛋白和mRNA的表达降低(P<0.01);TFO-M+U组明显低于TFO+U组和TFO-M组(P<0.01),后两组间无显著差异。结论在超声介导下,TFO脂质超声微泡可明显增加细胞对TFO的吸收率,从而增强TFO对TF的抑制作用。

生存素基因诱导人黏液表皮样癌细胞凋亡的实验研究

目的 研究生存素（survivin）反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3细胞的生长抑制效应及可能的作用机制,探讨生存素基因作为黏液表皮样癌基因治疗靶点的可行性.方法 设计合成靶向生存素特异性ASODN,转染Mc3细胞.将转染的Mc3细胞分为4组：空白对照组、脂质体转染组、生存素正义寡核苷酸（sense oligodeoxynucleotide,SODN）转染组、生存素ASODN转染组.转染后24、48及72 h倒置显微镜观察Mc3细胞形态学变化,甲基噻唑基四唑（MTT）法观察转染前后对细胞增殖的影响,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法分析细胞凋亡指数,半定量反转录聚合酶链反应分别检测生存素mRNA的表达.结果 生存素ASODN转染组的Mc3细胞数量明显少于其他组,脱壁悬浮细胞明显增多,可见典型凋亡改变,并呈时间依赖性.生存素ASODN转染组Mc3细胞G1～G0期前出现明显的亚二倍体凋亡峰,Mc3细胞的凋亡率在转染后24、48及72 h分别为12.96%、14.43%及22.69%,明显高于其他组（P＜0.01）,并呈时间依赖性（P＜0.05）.生存素ASODN对Mc3细胞增殖抑制率分别为22.35%、39.04%、43.46%,明显高于其他组（P＜0.01）,并呈时间依赖性（P＜0.05）.生存素ASODN转染组在细胞转染后24、48及72 h Mc3的凋亡指数分别为11.038%、12.172%及18.900%,明显高于其他组（P＜0.01）,并呈时间依赖性（P＜0.05）.生存素ASODN转染组Mc3细胞生存素mRNA在24、48及72 h的相对表达量分别为0.739±0.008、0.668±0.007、0.500±0.006,相对抑制率分别为18.21%、26.06%、44.82%,明显低于其他组（P＜0.01）,并呈时间依赖性（P＜0.01）.结论 生存素ASODN可抑制人黏液表皮样癌高转移细胞株Mc3的生长增殖,诱导其凋亡,同时亦可抑制Mc3细胞生存素mRNA的表达,并呈时间依赖性.生存素可作为黏液表皮样癌基因治疗研究的一个靶点.

铁调节蛋白质-2对肺癌铁代谢调节作用的实验研究

目的 探讨铁调节蛋白质-2（IRP2）在肺癌铁代谢中的调节作用.方法 培养肺腺癌A549细胞随机分成脂质体组（含脂质体20 mg/L）、对照寡核苷酸组和反义寡核苷酸组3组,每组设10个平行样.通过脂质体介导转染,以脂质体组和对照寡核苷酸组为对照.利用逆转录-PCR、Western印迹检测转铁蛋白、转铁蛋白受体、铁蛋白等铁代谢相关基因mRNA及蛋白的表达.结果 转染48 h后,转铁蛋白mRNA在3组之间表达差异无统计学意义（F=2.18,P=0.078）;反义寡核苷酸组转铁蛋白受体mRNA表达显著低于脂质体组和对照寡核苷酸组（均P〈0.05）;反义寡核苷酸组铁蛋白mRNA（0.56±0.06）表达高于脂质体组（0.36±0.05）和对照寡核苷酸组（0.39±0.03）（均P〈0.05）.转染48 h后,反义寡核苷酸组IRP2蛋白表达明显低于脂质体组和对照寡核苷酸组（P〈0.05）;转铁蛋白在3组之间表达差异无统计学意义（F=2.668,P=0.088）;反义寡核苷酸组转铁蛋白受体蛋白表达低于脂质体组和对照寡核苷酸组（P〈0.05）;反义寡核苷酸组铁蛋白表达高于脂质体组和对照寡核苷酸组（P〈0.05）.结论 IRP2可能通过蛋白量的改变来影响肺腺癌A549细胞转铁蛋白受体和铁蛋白的表达,调节铁代谢.

反义转化生长因子β1基因修饰对肌腱细胞生物学活性的影响

目的观察腱鞘成纤维细胞经反义TGF—β1基因修饰后生物学活性的改变，为肌腱术后粘连防治提供新的思路。方法取新西兰白兔6只，分离、培养腱鞘成纤维细胞，利用脂质体将反义TGF-β1表达载体pcDNA3-TGF—β1（-）导入腱鞘成纤维细胞，RT—PCR检测肌腱细胞TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达，Western blot法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达。结果RT—PCR显示基因修饰后肌腱细胞TGF—β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原的mRNA表达显著降低，与未传染组和空转染组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）；Westernblot结果显示基因修饰后肌腱细胞Ⅰ型胶原蛋白表达降低，与未传染组和空转染组比较，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论反义TGF-β1质粒能成功导人肌腱细胞中，并有效降低TGF—β1的表达和Ⅰ、Ⅲ型胶原的产生，减少肌腱的粘连成分，可能为防止肌腱损伤后的粘连起一定的作用。

反义MLL-AF9基因对THP-1细胞增生和凋亡的影响

目的研究MLL-AF9融合基因反义寡核苷酸（ASODN）对人类急性单核细胞白血病细胞THP-1增生和凋亡的影响。方法选择THP-1细胞特有的MLL-AF9融合基因为靶基因，设计并合成靶向MLL-AF9的ASODN及正义核苷酸（SODN），应用脂质体转染方法，将其转入细胞，RT—PCR法比较转染前后MLL-AF9 mRNA表达水平的变化，Western blotting法鉴定MLL-AF9蛋白表达量，改良MTF法检测细胞增生抑制率，并通过Hoechst33258染色观察ASODN作用于THP-1后细胞出现凋亡形态特征，流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果与空白对照组、脂质体对照组和SODN组相比，ASODN组细胞中MLL-AF9表达明显降低（P〈0．01），相对应MLL-AF9蛋白水平亦明显下降，同时细胞生长受到抑制，被诱导凋亡产生凋亡小体。ASODN转染THP-1细胞0、24和48h后，ASODN组凋亡率分别为（10．4±3．0）％、（22．8±2．5）％和（24．7±3．1）％，与对照组相比凋亡率显著增加（P〈0．01）且呈时间依赖性。结论利用ASODN靶向沉默MLL-AF9融合基因的表达能有效抑制THP-1细胞增生并促进其凋亡。

MMP-9ASODN对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响及其机制初步探讨

目的 探讨基质金属蛋白酶-9反义寡核苷酸(MMP-9ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖与凋亡的影响,并初步探讨其机制.方法 MTT法检测MMP-9ASODN转染对A549细胞生长增殖的影响;流式细胞术检测MMP-9ASODN转染对A549细胞周期和凋亡比率的影响;RT-PCR法与Western blot法分别检测MMP-9ASODN转染对A549细胞内MMP-9mRNA及蛋白表达的影响.结果 在一定范围内,MMP-9ASODN对A549细胞生长抑制呈浓度和时间依赖性,反叉寡核苷酸浓度为600 nmo/L作用48 h时其抑制作用最明显;MMP-9ASODN转染A549细胞48 h后G1期细胞数明显增多,S期细胞数明显减少,G2期细胞数则无明显变化,其凋亡百分比明显升高;与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);细胞内MMP-9mRNA及其蛋白的相对表达量明显低于对照组(P＜0.01).结论 MMP-9ASODN转染能够有效能够抑制肺腺癌A549细胞的增殖同时诱导其凋亡,其机制可能是通过下调MMP-9mRNA及蛋白的表达.

人鳞状细胞癌细胞株（A431）中NET-1基因对癌细胞增殖和浸润的影响

目的探讨小分子干扰核酸（siRNA）对皮肤鳞状细胞癌（简称皮肤鳞癌）细胞株（A431）中NET-1基因的抑制作用，及其基因对癌细胞增殖、浸润的影响。方法构建针对人NET-1基因的siRNA NET-1真核表达载体（pU6H1-GFP—siRNANET-1），转染A431细胞后通过半定量RT—PCR检测细胞中NET-1 mRNA水平以筛选较有效的siRNA NET-1。同时设置针对NET-1的正、反义真核表达载体和随机序列对照组siRNA表达载体，体外瞬时转染A431细胞，RT—PCR、Western blot分别检测癌细胞内NET-1mRNA和蛋白的表达，经免疫荧光染色在激光共聚焦显微镜下观察NET-1蛋白在细胞内的表达；四甲基偶氮唑盐（MTT）法和流式细胞仪分别检测A431细胞增殖与占不同细胞周期中细胞增殖指数（PI）；划痕试验和Transwell迁移试验分别检测A431细胞的迁移和侵袭能力。结果测序证实编码NET-1序列的siRNA已经插入载体pU6H1-GFP中u6和H1两个启动子之间，其他载体测序结果符合设计要求。pU6H1-GFP载体转染A431细胞后其转染率达到80％。转染siRNA NET-1和反义NET．1后分别与未转染组比较，A431细胞中NET-1mRNA分别减少72％和62％（t值分别为-36．01，-17．65；均P〈0．05）和蛋白表达水平分别减少61％和69％（t值分别为-21．13，-33．14；均P〈0．05）；在转染48h后能显著抑制A431细胞的增殖、迁移和浸润（均P〈0．05）。在转染对照组siRNA后并未见到明显的抑制效果。转染正义NET-1后，能分别增加细胞内52％NET-1mRNA和49％蛋白表达水平（t值分别为12．49，13．98，均P〈0．01）。结论靶向NET-1的siRNA真核表达载体能特异、有效的下调NET-1基因蛋白的表达，并抑制A431细胞增殖、迁移和浸润。进而证明内源性NET-1基因的功能与A431细胞增殖、迁移、浸润有关。靶向NET-1的siRNA显示基因抑制效率比反义核酸技术更好。