β1-整合素反义寡核苷酸抑制胃癌细胞系SGC7901粘附侵袭的实验研究

目的:观察β1-整合素反义寡核苷酸对高侵袭性人胃癌细胞SGC7901粘附侵袭的抑制作用。方法:以脂质体为载体将硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸转染SGC7901细胞,免疫化学方法观察转染后以Biotin标记的Inte鄄grinβ1asODN在细胞内的分布;RT-PCR及流式细胞术分别测定Integrinβ1mRNA和蛋白表达变化;MTT法和Boy鄄den小室模型分别测定其粘附力和侵袭力。结果:Integrinβ1asODN转染SGC7901后1h,胞浆及胞核内可见均匀分布的浅棕色颗粒,随着时间的延长,颗粒颜色不断加深;RT-PCR结果显示489bp处条带不同程度变浅;Integrinβ1蛋白表达曲线明显左移;粘附和侵袭实验证明,Integrinβ1asODN转染的SGC7901细胞的粘附力及侵袭力明显下降(P<0.001),抑制率分别为54%和76%,明显优于随机序列(P<0.001)。结论:Integrinβ1asODN转染SGC7901可降低其mRNA和蛋白表达水平,从而抑制其对细胞外基质(ECM)的粘附和侵袭。

经小脑延髓池局部应用反义寡核苷酸对脑组织TNF-α表达的影响

目的 :观察 TNF-α反义寡核苷酸对 TNF-α的阻断作用。方法 :用 DNA合成仪合成 17聚体的 TNF-α正义寡核苷酸和反义寡核苷酸。 2 4只犬随机分为对照组和实验组 (包括人工脑脊液组、正义链组和反义链组 )。实验组动物用已建成的颅脑爆炸伤模型装置致伤 ,伤前经小脑 -延髓池分别注入人工脑脊液、TNF-α正义寡核苷酸和 TNF-α反义寡核苷酸 ,比较 3组动物脑组织 TNF-α m RNA表达的变化。结果 :与人工脑脊液组和正义链组相比 ,伤前经小脑 -延髓池脑内局部应用 TNF-α反义寡核苷酸组 ,颅脑爆炸伤后脑组织内 TNF- α m RNA表达量明显减少 (P<0 .0 1)。结论 :经小脑延髓池局部应用反义寡核苷酸可有效阻断颅脑爆炸伤后脑组织 TNF- α的表达。

含CpG基序寡核苷酸对rHBsAg免疫小鼠脾脏组织及细胞增殖的影响

目的探讨合成含CpG基序的寡核苷酸(CpGODN)与重组乙型肝炎表面抗原(rHBsAg)联合免疫对小鼠脾脏淋巴组织及细胞增殖的影响。方法经后腿胫骨前肌初次免疫BALB/c小鼠,2周后加强免疫1次;常规石蜡切片,H-E染色,观察脾脏组织学改变;3H-TdR掺入法检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果抗原+CpG组脾脏可见明显的组织学改变。加CpG与不加CpG的2组比较,淋巴细胞增殖反应显著增强。结论CpGODN能够有效刺激小鼠脾脏组织T细胞区淋巴细胞增生,生发中心明显增大,而且能够显著增强淋巴细胞增殖反应。

免疫佐剂胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸1826对小鼠白血病的免疫治疗作用

背景与目的:肿瘤疫苗作为一种肿瘤特异性主动免疫治疗的手段,在其生物学治疗中起着重要作用。本研究探讨免疫佐剂胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸-脱氧寡核苷酸(cytidine-phosphatte-guanonine oligodeoxynucleotides,CpG ODN)1826在白血病动物模型中的抗瘤作用和毒副作用。方法:建立急性淋巴细胞白血病动物模型,在不同时间用灭活的L1210细胞和免疫佐剂皮下注射给DBA/2小鼠,观察小鼠一般状况、成瘤率、而且瘤块生长情况;通过病理切片了解瘤块中心及周围浸润细胞情况。结果:与对照组比,灭活细胞加GpG ODN1826瘤苗可以降低小鼠成瘤率,而且成瘤小鼠瘤块有消退现象,瘤周单个核细胞浸润明显,瘤块内肿瘤细胞坏死明显;但生存期无明显延长。结论:应用GpG ODN1826瘤苗可以加强白血病小鼠的抗瘤作用,但非荷瘤小鼠有死亡现象,需对GpG ODN1826瘤苗进行改进或筛选其他适合临床应用的免疫佐剂。

叶酸受体介导^(99m)Tc标记c-erbB2癌基因反义寡核苷酸的乳腺癌细胞摄取率

目的 研究叶酸受体介导的99mTc标记c-erbB2癌基因反义寡核苷酸乳腺癌细胞的摄取率。方法 用双功能整合剂次已酰双半胱氨酸(EC)连接15mer寡脱氧核苷酸(ODN)和叶酸(FA),形成ODN-EC-FA,用99mTc标记,形成99mTc-ODN-FA。同样的方法不加叶酸,形成99mTc-ODN。加2μCi的99mTc-ODN-FA和99mTc-ODN到107cell／瓶对数生长期乳腺癌细胞MDA-MB-231,分别于20、40、60、120、180、240分钟测定细胞的摄取率。结果 乳腺癌细胞对99mTc-ODN-FA的摄取率明显高于99mTc-ODN。结论 叶酸配体与受体的特异结合使寡核苷酸的乳腺癌细胞摄取率明显增加。

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人肝癌细胞株乙酰肝素酶表达的影响

目的:探讨乙酰肝素酶(Hpa)反义寡脱氧核苷酸对人肝癌细胞株Hpa mRNA和蛋白表达的影响。方法:设计合成互补于Hpa mRNA起始密码区的硫代反义寡脱氧核苷酸AS-ODN及相应的无义对照寡脱氧核苷酸NS-ODN,以阳离子脂质体Oligofectamine^(TM) Reagent包埋后转染SMMC-7721、BEL-7402细胞,以RT-PCR和Western-blot检测转染前后细胞Hpa mRNA以及蛋白表达的变化。结果:与正常对照组和NS-ODN相应浓度组相比,转染AS-ODN组肝癌细胞Hp amRNA和蛋白的表达均下降。结论:Hpa反义寡脱氧核苷酸下调Hpa mRNA和蛋白的表达,可能抑制肝癌的侵袭转移。

寡核苷酸对星形胶质细胞硫酸软骨素蛋白聚糖表达调控的实验研究

目的用人工合成的内切磷硫酰寡脱氧核糖核苷酸(ODN-PSs)对星形胶质细胞进行体外干预培养,分析硫酸软骨素蛋白聚糖表达,探讨ODN-PSs与神经损伤修复的关系。方法采用星形胶质细胞体外诱导培养技术,制备得到ODN-PSs条件培养的细胞;利用斑点杂交、免疫印迹和RT-PCR方法对细胞表达的硫酸软骨素蛋白聚糖和木糖基转移酶-1(XT-1)mRNA进行分析。结果制备的星形胶质细胞采用抗GFAP抗体进行免疫细胞化学染色法进行鉴定,纯度在95%以上;条件培养星形胶质细胞的免疫印迹和RT-PCR分析结果表明,XT-1 ODN-PSs可减少星形胶质细胞CSPG蛋白和XT-1基因的表达。结论人工合成XT-1 ODN-PSs寡核苷酸对星形胶质细胞硫酸软骨素蛋白聚糖表达有明显的抑制作用,从而有利于损伤神经核突起的再生。

Ⅰ型内皮素受体反义寡核苷酸抑制人血管平滑肌细胞增殖

目的 研究Ⅰ型内皮素 (ET -1)受体 (ETA)反义寡核苷酸 (ODN)对血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖的影响。方法 培养人桡动脉 (humanradialartery ,HRA)的VSMCs ,通过四唑盐 (MTT)比色实验测定细胞的增殖 ,进而分别采用放射受体结合分析法和放射免疫法检测ETA蛋白表达和ET -1自分泌的情况。结果 ETA -ODN显著抑制VSMCs增殖 ,而且具有浓度和时间依赖性。ETA -ODN( 15 μmol L)具有时间依赖抑制ETA表达。ETA -ODN( 15 μmol L)作用 2 4、48h ,VSMCs的上清液ET -1水平以及VSMCs平均ET -1分泌水平 ,较对照组均显著降低 (P <0 .0 5 )。作用 72h ,ET -1分泌上清液水平继续降低 (P <0 .0 5 ) ,但是VSMCs平均ET -1分泌水平不但没有降低 ,反而高于对照组水平 (P <0 .0 5 )。结论 ETA -ODN通过减弱ETA表达和调节ET -1的自分泌抑制HRA的VSMCs增殖 ,提示对临床上血管移植术后的再狭窄有防治作用。

IL-1预刺激对反义IRAK-2寡核苷酸抑制NF-κB活化的影响

目的 研究白介素－１（ＩＬ－１）预刺激对反义受体相关激酶－２寡核苷酸（ＩＲＡＫ－２ＯＤＮ）抑制ＩＬ－１激活核因子－ｋａｐｐａ Ｂ（ＮＦ－κＢ）的影响。方法 实验分ＩＬ－１预处理组和非预处理组。以脂质体介导反义ＩＲＫＡ－２ＯＤＮ转染２９３细胞，以夹心酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）检测ＮＦ－κＢ的含量。结果 ＩＬ－１非预处理组反义ＩＲＡＫ－２ＯＤＮ不能抑制ＮＦ－κＢ活性。

乙酰肝素酶反义寡核苷酸对人胃癌细胞株SGC7901表达bFGF的抑制作用

目的 探讨乙酰肝素酶反义寡核苷酸(AS-ODN)对人胃癌细胞株SGC7901表达碱性成纤维细胞生长因子(basic fibrob-last growth factor,bFGF)的影响。方法 AS-ODN和乙酰肝素酶mRNA起始密码子区互补,无义寡核苷酸(NS-ODN)为对照组,用阳离子脂质体包裹ODNs并转入SGC7901细胞;转染后48小时提取细胞总RNA,半定量RT-PCR法检测乙酰肝素酶基因的含量,免疫细胞化学法检测bFGF的表达。结果 AS-ODN处理后SGC7901表达乙酰肝素酶mRNA下降;处理前bFGF的表达率为72.23％,不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8μmol／L)AS-ODN处理后bFGF的表达率下降程度不同(分别为57.15％、51.11％、42.36％和40.25％)。结论 和乙酰肝素酶mRNA起始密码子区互补的AS-ODN对SGC7901表达bFGF有明显影响,且呈剂量相关性。

寡核苷酸对脊髓损伤后硫酸软骨素蛋白聚糖表达调控的实验研究

目的用人工合成的内切磷硫酰寡脱氧核糖核苷酸(ODN-PSs)对脊髓损伤进行干预,分析硫酸软骨素蛋白聚糖表达,探讨ODN-PSs与神经损伤修复的关系。方法采用改良AllenWD法[1]制成脊髓损伤模型后,再随机分为ODN-PSsXT-1实验组30只和实验对照组30只进行干预实验;利用免疫组化染色,Western blot和RT-PCR方法对细胞表达的硫酸软骨素蛋白聚糖和木糖基转移酶-1(XT-1)mRNA进行分析。结果免疫印迹和RT-PCR分析结果表明,XT-1ODN-PSs可减少减少CSPG蛋白和XT-1基因的表达。结论人工合成XT-1ODN-PSs寡核苷酸对脊髓损伤后硫酸软骨素蛋白聚糖表达有明显的抑制作用,从而有利于损伤神经核突起的再生。

NF-κB靶向性哑铃形“圈套”寡核苷酸对体外肾小球系膜细胞细胞因子表达的影响

目的:设计合成靶向NF-κB的哑铃形“圈套”ODNs,并检测其对NF-κB转录活性和肾小球系膜细胞细胞因子(TNF-α和IL-6)表达的抑制效应。方法:以NF-κB顺式作用元件κB序列为模板,设计包含两个拷贝的κB序列,长度为58个碱基的环状ODNS,合成后部分序列做FAM标记,行转集效率鉴定实验。采用电泳迁移率改变实验(EMSA)体外检测哑铃形圈套ODNs对NF-κB转录活性的抑制效应。提取大鼠肾小球系膜细胞,随机分为正常对照组、LPS刺激组、哑铃形圈套ODNs处理组、无关圈套ODNs处理组和脂质体处理组。采用阳离子脂质体将2、4、8mg/L不同剂量哑铃形圈套ODNs转染大鼠肾小球系膜细胞,6h后用LPS刺激,收集转染后8、12、18上清和细胞。用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清细胞因子蛋白表达,逆转录PCR(RT-PCR)法检测细胞因子mRNA转录。结果:阳离子脂质体可将哑铃形圈套ODNs高效转集入肾小球系膜细胞,哑铃形圈套ODNs在体外能有效地抑制NF-κB与其顺式元件的结合;4、8mg/L剂量哑铃形圈套ODNs可明显抑制LPS诱导的大鼠肾小球系膜细胞TNF-α和IL-6转录与表达。结论:靶向NF-κB的哑铃形圈套ODNs在体外可抑制NF-κB的转录活性,从而对体外培养的肾小球系膜细胞细胞因子的表达具有抑制效应。

CpG寡核苷酸联合热固化瘤苗对肝癌细胞Hca-F荷瘤小鼠的免疫治疗研究

目的探讨CpG寡核苷酸(ODN)联合热固化瘤苗的抗肿瘤作用。方法剥取肿瘤,称重并计算抑瘤率;MTT法测免疫小鼠CTL、Mψ和CTL细胞的体外杀伤活性;ELISA法测免疫小鼠血清中IL-10、IL-12水平。结果联合使用CpGODN和热固化瘤苗可以诱导荷瘤小鼠的抑瘤作用,其抑瘤率与单独使用瘤苗或CpGODN比较差异有显著性;联合使用CpGODN和热固化瘤苗可以提高荷瘤小鼠NK、Mψ和CTL细胞的体外杀伤活性,与单独使用瘤苗组相比较,差异具有显著性,但与单独使用CpGODN组相比较,NK、Mψ细胞的体外杀伤活性差异无显著性;联合使用CpGODN和热固化瘤苗可以提高荷瘤小鼠血清中IL-12水平并降低血清中IL-10水平,与二者单独使用组比较差异都具有显著性。结论联合使用CpGODN和热固化瘤苗能显著提高机体的免疫功能,尤其是特异性细胞免疫功能。

CpG寡核苷酸链作为新型佐剂的研究进展

1924年Ramon提出免疫佐剂的概念,80多年来,虽然进行了深入的研究,人用疫苗佐剂主要还是铝胶佐剂.直到最近几年才上市了几种新型的疫苗佐剂,如MF59(高压条件下将鲨烯与Tween 80 和Span 85混合后进行微流化形成的均一小滴状乳液,应用于美国Chiron公司开发的流感亚单位疫苗),重组霍乱毒素B亚单位(rCTB,应用于瑞典SBL Vaccin AB公司研发的霍乱疫苗Dukoral),AS04(一种含有单磷脂A和皂角苷的油包水乳剂,应用于英国GlaxoSmithKline公司的乙型肝炎疫苗Fendrix)等,但应用范围较小.……

诱骗寡核苷酸靶向阻断信号转导和转录活化蛋白5抑制K562细胞生长增殖

目的观察信号转导和转录活化蛋白 5 (STAT5 )诱骗寡核苷酸 (DecoyODN)靶向阻断STAT5的信号传递对白血病细胞株K5 6 2生长增殖的影响 ,并初步探讨其分子机制。方法 将体外设计合成的STAT5DecoyODN经阳离子脂质体介导转染K5 6 2细胞 ,通过细胞生长曲线及集落形成实验观察K5 6 2细胞生长增殖能力 ,并用RT PCR方法检测STAT5下游靶基因的表达。结果 激光共聚焦显微镜观察显示 ,STAT5DecoyODN能高效转染K5 6 2细胞 ,阳性率 95 .2 % ;细胞生长曲线显示STAT5De coyODN可显著抑制K5 6 2细胞生长 ,抑制率 77.7% ;集落形成实验显示STAT5DecoyODN能显著抑制K5 6 2细胞集落形成能力 (DecoyODN处理组集落形成率为 8.3% ,空白对照组为 35 .7% ,P <0 .0 5 ) ;RT PCR检测发现STAT5DecoyODN处理后K5 6 2细胞c myc、bcl XL、CyclinD1基因较对照组分别下调15 .4 % ,30 .8% ,2 9.1%。结论 DecoyODN可能通过阻止STAT5对靶基因的转录激活 ,使靶基因表达下调 ,进而抑制K5 6 2细胞生长增殖。

葡萄糖对表皮葡萄球菌生物被膜形成的影响及调节机制的研究

生物被膜(Biofilm)是条件致病菌表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)的主要致病因素,生物被膜的形成依赖多糖PIA合成,合成PIA的糖基转移酶由icaADBC基因编码。以生物被膜形成能力不同的菌株为对象,通过研究不同环境对生物被膜形成、细菌总糖量及相关基因表达的变化,探索外界环境对生物被膜形成的影响及葡萄糖对生物被膜诱导的分子机制。有利于生物被膜形成培养条件促进生物被膜形成及多糖的表达,葡萄糖能诱导ica基因的表达和生物被膜形成,ica基因的反义寡核苷酸(ODN)能对抗葡萄糖的作用;葡萄糖作用下不同生长周期生物被膜形成相关基因ica、icaR、AtlE表达不同。表皮葡萄球菌生物被膜的形成与细菌糖代谢有关,葡萄糖通过上调ica表达诱导生物膜形成,但不需要ica基因的持续表达;

反义c-jun寡核苷酸对成纤维细胞中波紫外线辐射损伤的抑制作用

目的探讨反义c-jun寡核苷酸(ODN)转染体外培养成纤维细胞后,对中波紫外线(U-VB)辐射诱导基质金属蛋白酶(MMP)表达的抑制作用。方法用蛋白印迹法测定UVB辐射后,成纤维细胞原癌基因c-jun和c-fos的蛋白c-jun和c-fos的表达变化;用RT-PCR方法测定c-jun反义ODN转染后,其mRNA的表达变化。用ELISA方法测定c-jun反义ODN转染后,对UVB辐射诱导的pro-MMP-1和MMP-3的合成变化。结果不同剂量UVB(10、20、30mJ/cm2)辐射成纤维细胞,均可诱导c-jun蛋白表达显著增加,分别为未辐射对照组的1.8、2.6、3.3倍;而c-fos的表达未见显著变化。UVB辐射还可以显著增加pro-MMP-1和MMP-3的合成。不同浓度c-jun反义ODN转染成纤维细胞后,均可以抑制UVB诱导的c-junmRNA表达;对UVB诱导的pro-MMP-1和MMP-3合成具有显著抑制作用。经统计学分析,差异有显著性(P<0.01)。结论UVB辐射诱导的pro-MMP-1和MMP-3表达可以由c-jun介导;c-jun反义ODN可以抑制pro-MMP-1和MMP-3的合成。

脱氧寡核苷酸对卵巢癌细胞核转录因子-κB活性和下游细胞分子表达的影响

目的 探讨核转录因子(NF)-κB诱捕物脱氧寡核苷酸(ODN)对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞NF-κB活性和下游细胞分子如细胞间黏附分子1(ICAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)表达的影响。方法 SKOV3细胞转染NF-κB诱捕物ODN后,用白细胞介素113(IL-1β)刺激6、12、24、48 h,采用凝胶电泳滞后实验测定NF-κB DNA结合活性,采用RT-PCR技术检测ICAM-1、VEGF、uPA mRNA表达水平,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VEGF蛋白表达水平。结果 (1)SKOV3细胞表达NF—κB DNA结合活性,IL-1β刺激后其活性上升,在转染NF—κB诱捕物ODN后SKOV3细胞NF-κB DNA结合活性被显著抑制,刺激6、12、24、48 h的抑制率分别为99.6％、86.4％、80.1％、21.6％。各时间点间比较,差异均有显著性(P<0.05～0.01)。(2)SKOV3细胞表达ICAM-1、VEGF、uPA mRNA和VEGF蛋白,IL-1β刺激后其表达率上升,转染NF-κB诱捕物ODN后其表达率下降。结论NF—κB诱捕物ODN转染SKOV3细胞后可能通过抑制NF-κB活性,从而抑制ICAM-1、VEGF、uPA的表达。NF—κB诱捕物ODN有望应用于卵巢癌的基因治疗。

基因原位修复的研究进展

基因原位修复是一种新的基因治疗策略。用三链形成寡核苷酸 (TFO)、RNA/DNA嵌合体 (RDO)和单链脱氧寡核苷酸 (ODN)可以对质粒和基因组DNA的特定位点进行修复 ,它可能通过细胞自身修复系统起作用。