多重PCR和间隔区寡核苷酸分型技术应用于不同流行地区的牛结核病研究

目的在牛结核病监测中联合应用菌株的多重PCR鉴定和间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping),快速鉴定分离菌株并分析不同地区流行菌株的特点。方法分别在牛结核病清净地区和流行地区进行牛型PPD变态反应试验,扑杀阳性牛后进行病理检查,并采集病料分离细菌。获取分离菌株,进行多重PCR鉴定和spoligotyping分型,分析不同地区的菌株特征。结果结核病清净地区监测到16头牛型PPD阳性牛,扑杀后未见有病变,采集病料分离到4株分枝杆菌,经多重PCR鉴定均为非典型分枝杆菌。流行地区监测牛型PPD阳性23头,扑杀后发现14头有病变,采集病料后共有11头分离到疑似菌,经多重PCR鉴定均为牛型分枝杆菌。用spoligotyping分析共分为4个型,其中2个为未见报道的新型,报英国AHVLA牛结核spoligotyping数据库后获取通用编号SB1903和SB1904。结论分离菌株中的优势菌株为首次报道的SB1903,但也检出有国际流行菌株SB0140,证实该地区牛结核病的流行是以"独特菌型地域内相互传播为主、输入性感染为辅"为特征。本次监测发现国内有SB0140菌株分布,提示应调查该型菌是否已经传染至我国人间。

河南省结核分枝杆菌MIRU-VNTR和间隔区寡核苷酸分型分析

目的:调查河南省结核分枝杆菌分子流行病学的结构特征。方法:共纳入河南地区668株结核分枝杆菌,进行间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)和26位点分枝杆菌散在重复单元-数目可变串联重复序列(MIRU-VNTR)分型分析,评估不同MIRU-VNTR位点组合的分辨效能。结果与结论:北京家族基因型菌株有558(83. 53)株,是河南省最流行的结核分枝杆菌,其中典型北京家族基因型(SIT1)是最具优势的基因型(512株,88. 89%)。26位点MIRU-VNTR可将668株菌分成567种基因型,其中含有38个基因簇和529种独立的基因型。累积Hunter-Gaston分辨力指数表明10个分辨力最强VNTR位点组合的分辨效力接近26位点组合。

间隔区寡核苷酸分型技术用于结核分枝杆菌多重感染的初步研究

目的初步评价间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术在鉴定结核分枝杆菌多重感染中的应用。方法选取结核分枝杆菌临床分离株,5μm孔径滤膜过滤法制备单个细菌菌悬液,平板接种37℃培养,选取生长良好的单个菌落培养增菌,提取基因组DNA,Spoligotyping进行基因分型鉴定,比较临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果。结果共选取32株结核分枝杆菌临床分离株,获得306个单克隆分离株。Spoligotyping分型鉴定结果显示30株结核分枝杆菌临床分离株与相应的单克隆分离株的分型结果一致,2株临床分离株的单克隆分离株呈现了多种基因型,多重感染率为6.25%。结论 Spoligotyping可用于快速,有效地区分结核分枝杆菌多重感染。

间隔区寡核苷酸分型法用于99株结核分枝杆菌杭州临床分离株的基因分型研究

目的用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)鉴定杭州结核分枝杆菌临床分离株的基因分型种类和特征,为结核病防治研究提供基础科学依据。方法收集结核分枝杆菌杭州临床分离株,应用Spoligotyping进行基因分型检测。基因聚类分析采用BioNumerics(Version 5.0)软件。结果共在杭州市收集到99株结核分枝杆菌临床分离株,可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(Non-Beijing family),分别占64.65%(64/99)和35.35%(35/99),20种基因型,其中9株为独特类型,剩余90株分为11簇。北京家族菌株中,89.06%(57/64)为典型北京家族(Typical Beijingfamily),35株非北京家族菌株可分为16个基因型,10株为独特的基因型。结论杭州结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,北京家族菌株占优势,但非北京家族菌株基因多态性更显著。

沧州市结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型研究

目的初步了解沧州市结核分枝杆菌临床分离株的基因多态性和分子流行病学特征,探讨各基因型与表型耐药之间的关系。方法收集结核病患者经临床分离培养得到的结核分枝杆菌菌株及相应病例信息,提取菌株DNA,采用间隔区寡核苷酸基因分型法进行基因分型研究,采用BACTECTMMGITTM960液体培养技术进行一线抗结核药物敏感试验。运用Bio Numerics 5.0软件进行聚类分析,运用Graphpad Prism 5.0软件进行数据分析。结果 154例患者中男109例,女45例;初治121例,复治33例;34例有吸烟史,12例合并糖尿病。48株(31.2%)至少对链霉素、异烟肼、利福平、乙胺丁醇中的1种药物耐药。复治患者的耐药率(63.6%)显著高于初治患者耐药率(22.3%)。典型北京型菌株占所有菌株的91.6%,非典型北京型菌株占8.4%。典型北京型与非典型北京型在患者性别、治疗情况、吸烟史、糖尿病史及耐药分布上的差异均无统计学意义。结论沧州市结核分枝杆菌呈现明显的基因多态性。典型北京型菌株是该地区的优势菌株,且基因型与耐药性无关。

结核分枝杆菌的间隔寡核苷酸分型法(Spoligotyping)

结核分枝杆菌是引起结核病的主要病原体。近年来 ,针对结核分枝杆菌的分子生物学研究方法日臻成熟 ,Spoligotyping分型就是其中的一种。它是指针对多种不同的间隔序列 (位于结核分枝杆菌染色体上DR序列之间 ) ,设计各自特异的寡核苷酸探针 ,并固定在尼龙膜上 ,引物标记后的扩增产物与膜上的探针进行反向杂交。由于不同菌株的间隔序列不同 ,因此导致杂交的探针数量和种类也不同而产生多态性。这种方法在流行病学研究中可以用来调查结核病暴发流行 ,追踪和寻觅传染源 ,确定结核病及耐药结核病的传播机制 ,鉴定实验室交叉污染或院内感染和阐述结核分枝杆菌菌株分布及优势株的情况。

中国结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型方法标准化操作程序的探讨

目的探讨中国结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）的标准化方法，初步评价其应用价值。方法采用核酸提取、聚合酶链反应（PCR）、反向线性点杂交等技术，结合BioNumerics（Version5．0）软件，对224株结核分枝杆菌临床分离株进行分型研究。结果使用Spoligotyping标准化方法对224株中国结核分枝杆菌临床分离菌株进行基因分型，将其分为北京家族菌株和非北京家族菌株两大簇。其中北京家族菌株129株，为主要的流行菌株。结论初步确定中国Spoligotyping标准化技术方案。该方法快速、简便、重复性好，能同时对结核分枝杆菌进行检测和分型，有利于结核病传染源的追溯和流行趋势的研究，尤其是在鉴定北京家族菌株上具有独特作用。

间隔区寡核苷酸分型和多位点可变数量串联重复序列分析在结核分枝杆菌基因分型中的应用

目的评价间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）方法在结核分枝杆菌基因分型研究中的应用。方法收集224株结核分枝杆菌临床分离株，分别采用Spoligotyping及MLVA方法进行基因分型，比较两种方法的分型效果，评价两种方法在结核分枝杆菌基因分型中的应用。结果使用Spoligotyping方法，224株结核分枝杆菌呈现出55种基因型，39株具有独特的基因型，其余185株菌呈现出16种基因型；使用MLVA方法时，224株结核分枝杆菌呈现出160种基因型，132株具有独特的基因型，余下的92株菌呈现出28种基因型；当两种方法联合使用时，224株结核分枝杆菌呈现出179种基因型，159株结核分枝杆菌具有独特的基因型，余下的65株菌表现为20种基因型。湖南省和安徽省的菌株中北京家族菌株所占的比例差异有统计学意义（P〈0．001），安徽省北京家族菌株所占的比例明显高于湖南省。结论MLVA在结核分枝杆菌株水平的鉴定方面，其分辨能力高于Spoligotyping，但是Spoligotyping在鉴定北京家族菌株和M.bovis方面有一定的优势。将Spoligotyping方法作为一线分型技术，MLVA作为二线分型技术联合应用时，将提高结核病的流行病学调查和病原学监测效果。不同地区的菌株有不同的特点。

24位点可变串联重复序列和间隔区寡核苷酸分型对河南省结核分枝杆菌基因型的鉴定

目的了解河南省结核分枝杆菌的基因型别。方法采用经典24位点分枝杆菌散在重复单元-可变串联重复序列(mycobacterium interspersed repetitive unit -variable number of tandem repeat,MIRU-VNTR)和间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)对2015年间河南省不同地区的668株结核分枝杆菌进行基因分型。结果间隔区寡核苷酸分型将668株菌分为11个家族,35个基因型。在558株北京家族基因型中,典型北京家族菌株546株,非典型北京家族菌株12株。在110株非北京家族菌株中,8株为新发现菌株;另102株非北京家族菌株被分为10个家族,其中T家族有76株,包括T1家族59株,T2家族7株,T3家族10株。标准24位点VNTR将668株菌分为550个基因型,有508株菌显示出单一的基因型,另160株菌被分到42个不同的基因簇中。最大簇含有21株菌,其余簇包含2~20株菌。结论河南省结核分枝杆菌主要为北京家族基因型。

结核分枝杆菌间隔区寡核苷酸分型法分析

目的应用间隔区寡核苷酸分型(spoligotyping)方法分析甘肃省结核分枝杆菌临床分离株的分子型别特征。方法用spoligotyping基因分型方法,对甘肃省兰州市肺科医院住院或门诊确诊患者分离的结核分枝杆菌进行分型,采用BioNumerics 4.5软件进行聚类(cluster)分析,对聚类结果与国际间隔寡核苷酸分型数据库(SpolDB4)对比。结果 215株临床分离株被分成3个基因群22种基因型,其中成簇菌株形成11个基因型共204株,独特基因型菌株11株;北京家庭基因型结核分枝杆菌占86.51%(186/215),T4占4.19%(9/215)、H1占1.86%(4/215)、MANU占1.40%(3/215)等基因型;Logistic多元回归分析结果表明,北京家庭基因型与患者性别、年龄、职业、抗结核治疗史、耐药、发病情况和菌种耐药性、来源地等均无关联。结论甘肃省结核分枝杆菌临床分离株基因具有多态性,北京家族基因型结核分枝杆菌为该地区主要流行株,其他罕见的基因型结核分枝杆菌也值得重视。

间隔区寡核苷酸DNA微阵列分型在结核分枝杆菌检测中的应用

目的探讨间隔区寡核苷酸DNA微阵列法在结核分枝杆菌基因分型检测中的应用价值。方法将结核分枝杆菌标准菌株(H37Rv)、卡介苗(BCG)菌株和97株临床结核分枝杆菌株的聚合酶链反应产物分别进行传统Spoligotyping和间隔区寡核苷酸DNA微阵列分型,比较2种方法的一致性,并用H37Rv菌株检测间隔区寡核苷酸DNA微阵列法的灵敏度。结果结核分枝杆菌标准菌株、BCG菌株和97株临床结核分枝杆菌菌株的间隔区寡核苷酸DNA微阵列分型结果与传统Spoligotyping完全一致,符合率为100%;且间隔区寡核苷酸DNA微阵列法有较好的检测效能。结论间隔区寡核苷酸DNA微阵列法用于结核分枝杆菌分型具有操作简便、快速等特点,适于结核病的溯源和分子流行病学调查。

基因分型方法在结核分枝杆菌分型中的应用进展

结核分枝杆菌(Mtb)基因分型在结核病流行病学研究中应用广泛,对结核病疫情的监测、溯源和防控具有重要意义。Mtb基因分型方法中,IS6110限制性片段长度多态性分型曾经是国际公认的Mtb分型的“金标准”,但其缺陷明显,包括分型能力不足、对样本质量要求高和实验操作繁琐等;间隔区寡核苷酸分型技术操作简便且成本较低,稳定性较高,但其分型能力同样不足,结果可能趋向同型化;长序列多态性分型可以简便、快速鉴别牛型、人型和北京基因型菌株,并且在遗传进化研究中发挥重要作用;可变数目串联重复序列分型的分辨率高、可重复性好,可以根据不同情况优化位点组合,已经成为结核分子流行病学研究的重要方法;单核苷酸多态性分型具有高通量、高分辨率和结果准确性高等优点,在结核分子流行病学上的应用非常广泛,有望成为Mtb分型的下一个金标准。

海南省136株耐药结核分枝杆菌寡核苷酸基因分型和耐药性分析

目的 通过对2022年收集的海南省136株耐药结核分枝杆菌进行基因分型研究,了解和掌握海南省不同耐药结核分枝杆菌基因型的流行情况及耐药率,为海南省结核病防治策略提供科学依据。方法 收集海南省结核分枝杆菌耐药菌株136株,采用间隔区寡核苷酸分型技术(Spoligotyping)对结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,并对不同基因型结核分枝杆菌的耐药率进行统计学分析。结果 136株耐药结核分枝杆菌中北京型占54.41%(74/136),非北京型占27.94%(38/136),新发现基因型占17.65%(24/136)。北京型中包含SIT1和SIT269两种基因型,占比分别为52.94%(72/136)、1.47%(2/136)。在非北京型中,T型(T1、T2、T3)占21.32%(29/136),U型占6.62%(9/136)。基因分型聚类分析结果:分为北京型和非北京型两个大类以及一些散在的新型基因型。Spoligotyping分型成簇分析结果:136株耐药菌株分为3簇,成簇率为75.74%(103/136)。北京型和非北京型的单耐药、多耐药、耐多药、广泛耐药比率分别为41.89%(31/74)、13.51%(10/74)、24.33%(18/74)、20.27%(15/74)和36.84%(14/38)、15.79%(6/38)、26.32%(10/38)、21.05%(8/38),经过卡方检验,北京型和非北京型两者之间以上各耐药率差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 海南省结核分枝杆菌基因型呈基因多态性,其主要流行菌株基因型为北京型中的SIT1型,应加强该基因型结核分枝杆菌监测工作。

云南省昭通地区结核分枝杆菌临床分离株遗传多样性和耐药分子特征

目的调查云南省昭通地区结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)临床分离株的遗传多样性和耐药分子特征。方法2022年9月—2023年8月从昆明医科大学附属昭通医院收治的298例涂阳肺结核患者中共采集了MTB 298株,用MeltPro TB测定法通过荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)熔解曲线法鉴定所有分离株。用多色熔解曲线分析技术进行间隔区寡核苷酸分型(interval oligonucleotide typing,Spoligotyping)。用分枝杆菌散布重复单元(mycobcterial interspersed repetitive units,MIRU)-可变数目串联重复序列分型(variable number of tandem repeat typing,VNTR)(MIRU-VNTR)24位点分型法进行基因分型。使用PCR和靶向测序检测耐药基因突变。结果北京菌株占所有MTB菌株的69.80%(208/298)。其他谱系包括T、LAM、MANU2、CAS、NEW-1和SITVITWEB数据库中未发现的孤儿型,分别占5.70%(17/298)、3.36%(10/298)、0.67%(2/298)、0.34%(1/298)、8.39%(25/298)及11.74%(35/298)。北京菌株对左氧氟沙星的耐药率略高于非北京菌株(P=0.042),而北京菌株与非北京菌株2种基因型菌株对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、吡嗪酰胺、卡那霉素耐药率差异无统计学意义(P>0.05)。MIRU-VNTR 24位点分型分析结果显示,33个菌株可分为13株聚类,其聚类率为39.39%。每个等位基因的Hunter-Gaston指数在0~0.814之间,其中18个位点对非北京菌株具有中高鉴别能力。但只有10个位点对北京菌株具有中高鉴别能力。结论MTB菌株在中国云南省昭通地区表现出较高的遗传多样性,北京菌株是MTB和耐药结核病菌株的优势谱系。

Spoligotyping对广西地区208株结核分枝杆菌临床分离株的基因分型

目的用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)对广西地区结核分枝杆菌临床分离株进行基因分型,并分析北京家族菌株与耐药的相关性。方法收集广西地区结核分枝杆菌临床分离株,应用Spoligotyping进行基因分型研究和比例法进行药物敏感性检测。基因聚类分析采用BioNumerics软件。统计分析采用χ2检验。结果共在广西地区收集到208株结核分枝杆菌临床分离株,可分为2个基因群,即北京家族(Beijingfamily)或称北京基因型(Beijinggenotype),和非北京家族(Non-Beijingfamily),分别占55.3%(115/208)和44.7%(93/208),47种基因型,其中36株为独特类型,剩余172株分为11簇。北京家族菌株中,90.4%(104/115)为典型北京家族(TypicalBeijingfamily),非北京家族菌株表现为高度的基因多态性,可分为39个基因型,31株为独特的基因型。有耐药结果的205株菌株中,北京家族菌株,76.25%(76/113)表现为全敏感,而23.75%(37/113)表现为耐药;非北京家族菌株,75%表现为全敏感,而25%表现耐药,经卡方检验(Chi-SquareTests)(表2),两者间的差异无统计学意义(χ2=2.9721,P>0.05)。结论广西结核分枝杆菌存在明显的基因多态性。本研究证实北京基因型与耐药无明显相关性。

220株结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型种类和特征,为结核病防治研究提供基础科学依据。评价两种分型方法在北京地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集北京市结核分枝杆菌临床分离株,应用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)二种分型方法进行基因分型,结果聚类分析采用BioNu-merics(Version5.0)软件。结果共在北京地区收集到220株结核分枝杆菌临床分离株。采用Spoligotyping分型方法,220株菌可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(non-Beijing family),20种基因型。其中北京家族含有202株菌,占91.82%。北京家族菌株中,典型北京家族菌株占95.05%(192/202),非典型北京家族占4.95%(10/202)。北京家族菌株的耐药率为22.55%(22/98),非北京家族菌株的耐药率为16.67%(1/6),两者间的差异无统计学意义(fisher analysis,P=0.5835>0.05)。采用MLVA分型方法,202株菌可分成5个基因群59种基因型,主要为Beijing family、China2和China3,分别占91.37%、2.73%和4.55%。结论北京地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与耐药性无明显相关性。

Spoligotyping和MLVA用于71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株基因分型的初步研究

目的初步探讨寡核苷酸分型(Spoligotyping)和多位点数目可变串联重复序列分析(MLVA)用于浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株的分型,以初步了解浙江省结核分枝杆菌的基因型特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株,常规培养,收集菌体,提取基因组DNA。采用聚合酶链反应(PCR)扩增整个DR区进行Spoligotyping分型,同时分别扩增15个VNTR位点进行MLVA分型。聚类分析采用BioNumerics软件。统计学分析采用卡方检验。结果对70株菌进行了基因分型,Spoligotyping结果显示,可分为2个基因群,即北京家族(Beijingfamily)和非北京家族(Non-Beijingfamily),分别占70和30,49株北京家族菌株中,89.8为典型北京家族;MLVA结果显示,可分4个基因群,分别为Ⅰ群占8.5,含5个基因型,Ⅱ群占18.3,含13个基因型,Ⅲ群占70.4,含38个基因型,Ⅳ群占2.8,含2个基因型。两种方法对菌株的基因分型结果非常吻合,Spoligotyping分型为北京家族的菌株均分布在MLVAⅢ型中,非北京家族菌株的基因多态性,分属于MLVAⅠ、Ⅱ和Ⅳ型。MLVA将70株菌分为58个基因型(含53个独特基因型),而Spoligotyping只分为18种基因型(含12个独特基因型)。结合对临床一线4种药物的耐药检测结果分析,两种方法的分型结果均显示北京家族菌株中表现为全敏感者71.4(35/49),表现为耐药者为28.6(14/49);而非北京家族菌株中表现为全敏感者为66.7,表现为耐药者为33.3,经卡方检验,两者间的差异无统计学意义(χ2=0.158,P>0.05)。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为北京家族。北京家族与耐药无明显相关性。MLVA株水平鉴定能力明显高于Spoligotyping,尤其是在鉴别北京家族菌株上具有明显的优势。

70株浙江省结核分枝杆菌临床分离株Spoligotyping基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌临床分离株相关基因型的分布情况,并分析北京家族菌株与耐药的相关性。方法收集浙江省结核分枝杆菌临床分离株,常规罗氏培养基培养,应用Spoligotyping进行基因分型研究,聚类分析采用BioNumerics软件,统计学分析采用卡方检验。结果70株浙江省结核分枝杆菌临床分离株可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(Non-Beijing family),分别占70%(49/70)和30%(21/70),18种基因型,其中12株为独特类型,剩余58株分为6簇。北京家族菌株中,89.8%(44/49)为典型北京家族(typical Beijing family),非北京家族菌株表现为高度的基因多态性,可分为13个基因型,9株为独特的基因型。北京家族菌株中表现为全敏感者71.4%(35/49),表现为耐药者为28.6%(14/49);而非北京家族菌株中表现为全敏感者为66.7%,表现为耐药者为33.3%,经卡方检验,两者间的差异无统计学意义(X^2=0.158,P>0.05)。结论北京家族菌株为浙江的流行优势菌株。北京基因型与耐药无明显相关性。

四川省106株结核分枝杆菌spoligotyping基因分型研究

目的了解四川省结核分枝杆菌基因型构成情况以及北京基因型菌株在四川省结核分枝杆菌中所占的比例,为四川省结核病预防控制提供分子流行病学依据。方法采用间隔区寡核苷酸分型(spacer oligonucletide typing,spoligotyping)方法对106株四川省结核分枝杆菌进行分型分析,将spoligotyping分型结果与SITVIT2数据库进行比较确定菌株的基因家族。结果根据spoligotyping分型结果及与数据库SITVIT2的比较,106株结核分枝杆菌表现为30种基因型,21种基因型为数据库中存在的基因型,9种基因型为新的基因型。基因家族分析发现,65株结核分枝杆菌为北京家族菌株(61.32%),26株为T家族菌株,4株为MANU家族菌株,U型及H型家族菌株各1株。9株新基因型的菌株没有进行基因家族的确定。结论本研究对四川省结核分枝杆菌的基因型构成以及北京家族菌株的流行程度做了初步的描述。对四川省结核病的流行趋势分析、结核病的预防控制等具有重要的意义。